Diagnostika fetálnej chromozomálnej aneuploidie použitím sekvencovania genómu

Číslo patentu: E 16032

Dátum: 23.07.2008

Autori: Chiu Rossa Wai Kwun, Lo Yuk-ming Dennis, Chan Kwan Chee

Je ešte 20 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 Tento vynález sa všeobecne týka diagnostického testovania fetálnej chromozomálnej aneuploidie určením nerovnováh medzi rôznymi sekvenciami nukleových kyselín a konkrétnejšie identifikácie trizómie 21 (Downovho syndrómu) a ďalších chromozomálnych aneuploidii testovanlm materskej vzorky (napriklad krvi).0002 Fetálna chromozomálna aneuploidia vyplýva z prítomnosti abnormálne dávky (dávok) chromozómu alebo chromozomálnej oblasti. Abnormálna dávka (dávky) môže byť abnormálne vysoká. napríklad prítomnosť dodatočného chromozómu 21, alebo chromozomálnej oblasti u trizómie 21 alebo abnormálne nízka, napríklad prítomnosť kópie chromozómu X u Turnerovho syndrómu.0003 Konvenčné prenatálne diagnostické metódy fetálnej chromozomálnej aneuploidie, napriklad trizómie 21, zahŕňajú odber vzoriek fetálnych materiálov takými invazívnymi procedúrami, ako je amniocentéza alebo odber chóriových klkov, ktoré nesú konečné riziko straty plodu. Neinvazívne procedúry, ako je skríning ultrasonografiou a biochemickými markermi, sa používajú na vrstvenie rizík tehotných žien pred definitívnymi invazívnymi diagnostickými procedúrami. Avšak tieto skrínovacíe metódy typicky merajú epifenomény, ktoré súvisia s chromozomálnou aneuploidiou,napríklad trizómiou 21, napríklad s jadrovou chromozomálnou abnormalitou a tým majú suboptimálnu diagnostickú presnosť a ďalšie nevýhody. ako že sú vysoko ovplyvnené tehotenským vekom.0004 Objav cirkulujúcej bezbunkovej fetálnej DNA v materskej plazme v roku 1997 ponúkol nové možnosti pre neínvazívnu prenatálnu diagnostiku (Lo, Y. M. D. a Chiu, R. W. K., Nat Rev Genet 8,71-77 (2007. Kým táto metóda sa lahko aplikuje na prenatálnu diagnózu s pohlavlm Spojenými(Costa. J. M. et al., N Engl J Med 346, 1502 (2002 a určitými jednogénovými poruchami (Lo. Y. M. D. et al., N Engl J Med 339, 1734-1738 (1998, jej aplikácia na prenatálnu detekciu fetálnych chromozomálnych aneuploidii predstavuje značnú výzvu (Lo, Y. M. D a Chiu, R.W. K. (2007) vyššie). Po prvé, fatálne nukleové kyseliny koexistujú v materskej plazme s vysokým pozadím nukleových kyselín materského pôvodu, ktoré môžu často rušiť analýzu fetálnych nukleových kyselín (Lo, Y. M. D et al., Am J Hum Genet 62, 768-775 (1998. Po druhé, fetálne nukleové kyseliny cirkulujú v materskej plazme predominantne v bezbunkovej forme, čo sťažuje odvodenie informácií o dávkovani génov alebo chromozómov vo fetálnom genóme.0005 Nedávno sa dosiahol významný vývoj, ktorý prekonáva tieto výzvy (Benachí, A. a Costa,J. M., Lancet 369, 440-442 (2007. Jeden prístup deteguje pre fetus špeciñcké nukleové kyseliny v materskej plazme, čím prekonáva problém rušenia materským pozadím (Lo, Y. M. D. a Chiu,R. W. K. (2007) vyššie). Dávkovanie chromozómu 21 sa odvodilo z pomerov polymorfných alel z placenty odvodených molekúl DNA/RNA. Avšak táto metóda je menej presná, ked vzorky obsahujú nižšie množstvo cieľovej nukleovej kyseliny a môže sa použiť len na plody, ktoré sú heterozygotné pre cielové polymorfizmy, čoje len podmnožina populácie, ak sa používa jeden polymorfizmus. 0006 Dhallan et al. (Lancet 369, 474-481 (2007 opísali alternatívnu stratégiu obohatenia podielu cirkulujúcej fetálnej DNA pridaním formaldehydu do materskej plazmy. Podiel sekvencií chromozómu 21, ktorými prispieval plod v materskej plazme, sa určil zhodnotením pomeru od rodičov zdedených pre plod špecifických alel voči pre plod nešpecíñckých alel pre jednonukleotidové polymorfizmy (SNP) na chromozóme 21. Pomery SNP sa podobne vypočítali pre referenčný chromozóm. Nerovnováha fetálneho chromozómu 21 sa potom odvodila detegovaním štatisticky významného rozdielu medzi pomermi SNP pre chromozóm 21 a referenčný chromozóm, kde významný je deñnovaný pomocou pevnej hodnoty p s 0,05. Aby sa zabezpečilo vysoké pokrytie populácie, najeden chromozóm sa zacielilo viac než 500 SNP. Avšak existujú kontroverzie ohladne účinnosti formaldehydu pre obohatenia fetálnej DNA na vysoký podiel (Chung, G. T. Y. et al., Clin Chem 51, 655-658 (2005 a preto reprodukovatelnosť metódy treba ďalej hodnotiť. Taktiež,pretože každý plod a matka by boli informatívne pre odlišný počet SNP pre každý chromozóm, sila štatistického testu porovnanie pomerov v SNP by bola premenlivá od prípadu k prípadu (Lo,Y. M. D. a Chiu, R. W. K. Lancet 369, 1997 (2007. Ďalej, pretože tieto prístupy závisia od detekcie genetických polymortizmov, sú obmedzené na plody heterozygotné pre tieto polymorfizmy.-2 0007 Pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) a kvantifikácie DNA Iokusu chromozómu 21 a referenčného Iokusu v amniocytových kultúrach získaných z trizómie 21 a z euploidných plodov, Ziminermann et al. (Clin Chem 48, 362-363 (2002 boli schopní rozlíšit dve skupiny plodov na základe 1,5-násobného nárastu DNA sekvencii chromozómu 21 u prvého. Pretože dvojnásobný rozdiel koncentrácie templátu DNA vytvára rozdiel len jedného prahového cyklu (Ct - threshold cycle), rozlíšenie LS-násobného rozdielu je limitom konvenčnej PCR v reálnom čase. Aby sa dosiahli jemnejšie stupne kvantitativneho rozlíšenia, sú potrebné alternatívne stratégie.0008 Digitálna PCR sa vyvinula na detekciu časového posunu (zošikmenia) pomerov alel vo vzorkách nukleových kyselín (Chang, H.W. et al., J Natl Cancer lnst 94, 1697-1703 (2002. Digitálna PCR je technológia analýzy nukleových kyselín založená na ampllfikácii, ktorá vyžaduje distribúciu vzorky obsahujúcej nukleové kyseliny na množstvo diskrétnych vzoriek, kde každá vzorka obsahuje v priemere nie viac než približne jednu cieľovú sekvenciu na vzorku. Terčíky špecifických nukleových kyselín sa ampliñkujú s primérmi špecifickými pre sekvenciu, aby sa pomocou digitálnej PCR vygenerovali špecifické amplikóny. Lokusy nukleových kyselín, ktoré sa majú zacieliť, a druhy alebo panel primérov špecifických pre sekvencie, ktoré sa majú začlenit do reakcii, sa určia alebo vyberú pred analýzou nukleových kyselín.0009 Klinicky sa to ukázalo užitočné na detekciu straty heterozygocity (LOH) vo vzorkách DNA tumorov (Zhou, W. et al., Lancet 359, 219-225 (2002. Pre analýzu výsledkov digitálnej PCR,predchádzajúce štúdie prijali testovanie pomeru sekvenčnej pravdepodobnosti (SPRT) na klasiñkovanie experimentálnych výsledkov, ako naznačujúcich alebo nenaznačujúcich prítomnost LOH vo vzorke (El Karoui at al., Stat Med 25, 3124-3133 (2006.0010 V metódach použitých v predchádzajúcich štúdiách je množstvo dát zozbieraných v digitálnej PCR dost nízke. Čiže možno znížit presnosť kvôli malému počtu dátových bodov a typickým štatistickým fluktuáciám.0011 Preto je žiaduce, aby neinvazívne testy mali vysokú citlivosť a špeciñčnosť, aby sa minimalizovali falošné negative, resp. falošné pozitíva. Avšak fetálna DNA je prítomná v nízkej absolútnej koncentrácii a predstavuje zanedbatelnú časť všetkých DNA sekvencii v materskej plazme a sére. Preto je taktiež žiaduce mat metódy, ktoré dovoľuje neinvazívnu detekciu fetálnej chromozomálnej aneuploidie maximalizovaním množstva genetických informácií, ktoré by sa odvodili z obmedzeného množstva fetálnych nukleových kyselín, ktoré existujú ako zanedbatelná populácia v biologickej vzorke. ktorá obsahuje materské pozaďové nukleové kyseliny.0012 Tento vynález uvádza spôsoby určenia či existuje nerovnováha sekvencii nukleových kyselín (napríklad Chromozómové nerovnováha) v biologickej vzorke získanej od tehotnej ženy. Toto určenie možno robit pomocou parametre množstva klinicky relevantnej chromozomálnej oblasti vo vzťahu k iným klinicky nerelevantným chromozomálnych oblastiam (pozadovým oblastiam) v biologickej vzorke. Taktiež sa uvádza počítačom čitatelné médium kódované s množstvom inštrukcií na riadenie počítačového systému, aby sa spôsoby vykonali. V jednom aspekte množstvo chromozómov sa určuje zo sekvencovania molekúl nukleových kyselín v materskej vzorke, ako je moč, plazma, sérum a iné vhodné biologické vzorky. Molekuly nukleových kyselín biologickej vzorky sa náhodne sekvencujú tak, že sa sekvencuje frakcia genómu. Zvolí sa jedna alebo viac medzných hodnôt na určenie, či existuje zmena v porovnaní s referenčnou kvantitou (t.j. nerovnováha), napríklad vzhladom na pomer množstiev dvoch chromozomálnych oblastí (alebo súborov oblastí).0013 Podla vynálezu biologická vzorka, získaná od tehotnej ženy s plodom, sa analyzuje, aby sa vykonala prenatálna diagnóza fetálnej chromozomálnej aneuploidie. Biologická vzorka obsahuje bezbunkové molekuly nukleových kyselín. Cast z množstva molekúl nukleových kyselín, obsiahnutých v biologickej vzorke, sa náhodne sekvencuje. V jednom aspekte je množstvo získaných genetických informácií dostatočné na presnú diagnózu, avšak nie nadmerne rozsiahle, aby zahŕňalo náklady a množstvo požadovanej vstupnej biologickej vzorky. Vopred určený počet sekvencii sa získa z náhodného sekvencovania a každá sekvencia sa zoradi s ľudským genómom pomocou počítačového systému.0014 Určl sa prvé množstvo sekvencii identifikovaných ako zoradené s prvým chromozomom a druhé množstvo sekvencii identifikovaných ako zoradené s jedným alebo viacerými druhými chromozómami. Z prvého množstva a druhého množstva sa určí parameter, pričom parameter predstavuje relatívne množstvo medzi prvým a druhým množstvom a potom sa porovná s jednou-3 alebo viacerými medznými hodnotami. Na základe porovnania sa určí klasiñkácia, či pre prvý chromozóm existuje fetálna chromozomálna aneuploidia. Sekvencovanie výhodne maximalizuje množstvo genetických informácií, ktoré by sa odvodili z obmedzeného množstva fetálnych nukleových kyselín, ktoré existujú ako minoritná populácia v biologickej vzorke, ktorá obsahuje materské pozaďové nukleové kyseliny.0015 Podla jedného príkladu uskutočnenia vynálezu sa analyzuje biologická vzorka získaná od tehotnej ženy, aby sa vykonala prenatálna diagnóza fetálnej chromozomálnej aneuploidie. Biologická vzorka obsahuje molekuly nukleových kyselín. ldentiñkuje sa percento fetálnej DNA v biologickej vzorke. Na základe percenta sa vypočíta počet N sekvencií, ktoré sa majú analyzovať na základe požadovanej presnosti. Náhodne sa sekvencuje najmenej N molekúl nukleových kyselín obsiahnutých v biologickej vzorke.0016 Ďalšie uskutočnenia vynálezu sú nasmerované na počítačom čitatelné médiá, súvisiace s tu oplsanými metódami.0017 Lepšie pochopenie povahy a výhod tohto vynálezu možno získat s odkazom na nasledujúci detailný opis a priložené výkresy.0018 Obrázok 1 je bloková schéma spôsobu 100 na vykonávanie prenatálnej diagnózy z fetálnej chromozomálnej aneuploidie v biologickej vzorke získanej od tehotného ženského subjektu.0019 Obrázok 2 je bloková schéma spôsobu 200 na vykonanie prenatálnej diagnózy z fetálnej chromozomálnej aneuploidie pomocou náhodného sekvencovania podľa tohto vynálezu.0020 Obrázok 3 A zobrazuje priebeh percentuálneho zastúpenia sekvencií chromozómu 21 vo vzorkách materskej plazmy, zahŕňajúce trizómiu 21 alebo euploidné plody podľa jedného uskutočnenia tohto vynálezu.0021 Obrázok 3 B zobrazuje koreláciu medzi koncentráciou frakcii fetálnej DNA materskej plazmy určenej masívnym paralelným sekvencovaním a mikrofluidnou digitálnou PCR podľa jedného uskutočnenia tohto vynálezu.0022 Obrázok 4 A zobrazuje priebeh percentuálnej zastúpenia zoradených sekvencií na chromozóm podľa jedného uskutočnenia tohto vynálezu.0023 Obrázok 4 B zobrazuje priebeh rozdielu () v percentuálnom zastúpení na chromozóm medzi prípadom trizómie 21 a euploidným prípadom zobrazeným na obrázku 4 A.0024 Obrázok 5 zobrazuje koreláciu medzi stupňom nadmerného zastúpenia sekvencií v chromozóme 21 a koncentráciou frakcii fetálnej DNA v materskej plazme, zahŕňajúce plody s trizómiou 21 podľa jedného uskutočnenia tohto vynálezu.0025 Obrázok 6 zobrazuje tabulku časti ľudského genómu, ktorá sa analyzovala podľa jedného uskutočnenia tohto vynálezu. T 21 označuje vzorku získanú z tehotenstva zahŕñajúceho plod s trizómiou 21.0026 Obrázok 7 zobrazuje tabuľku množstva sekvencií vyžadovaných na diferencovanie euploidu z plodov s trizómiou 21 podľa jedného uskutočnenia tohto vynálezu.0027 Obrázok BA zobrazuje tabulku vrchných desiatich východiskových pozícií sekvencovaných tagov zoradených voči chromozómu 21 podla jedného uskutočnenia tohto vynálezu.0028 Obrázok 8 B zobrazuje tabulky vrchných desiatich východiskových pozícii sekvencovaných tagov zoradených voči chromozómu 22 podľa jedného uskutočnenia tohto vynálezu.0029 Obrázok 9 zobrazuje blokovú schému príkladu výpočtového prístroja použitelného so systémom a spôsobmi podľa uskutočnení tohto vynálezu.0030 Pojem biologická vzorka ako sa tu používa, označuje akúkoľvek vzorku, ktorá je odobratá zo subjektu (napriklad človeka akým je tehotná žena) a obsahuje jednu ale viac záujmových molekúl nukleových kyselín.0031 Pojem nukleová kyselina alebo polynukleotid označujú kyselinu deoxyribonukleovú(DNA) alebo kyselinu ribonukleovú (RNA) a ich polymér buď jedno- alebo dvojvláknovej formy. Pokým nie je špecificky obmedzený, pojem zahŕňa nukleové kyseliny, ktoré obsahujú známe analógy prirodzených nukleotidov, ktoré majú podobné väzobné vlastnosti ako referenčná nukleová kyselina a sú metabolizované spôsobom podobným prirodzene sa vyskytujúcim nukleotidom. Pokým nie je naznačené ináč, konkrétna sekvencia nukleových kyselín taktiež implicitne zahŕňa jejkonzervativny modifikované varianty (napríklad degenerované kodónové substitúcie), alely,ortológy, SNP a komplementárne sekvencie, ako aj explicitne uvedené sekvencie. Špecificky degenerované kodónové substitúcle možno dosiahnut generovaním sekvencií, ktorých tretia pozícia jedného alebo viacerých vybraných (alebo všetkých) kodónov je substituovaná so zmiešanými bázickými a/alebo deoxyinozinovými rezíduami (Batzer at al., Nucleic Acid Res. 1925081 (1991) Ohtsuka et al., J. Biol. Chenz. 2602605-2608 (1985) a Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8291-98 (1994. Pojem nukleová kyselina sa používa vzájomne zamenitelne sgénom,cDNA, mRNA, malou nekódujúcou RNA, mikro RNA (miRNA), s piwi interagujúca RNA a krátkou vlásenkovou RNA (shRNA - short hairpin RNA) kodované génom alebo Iokusom.0032 Pojem gén znamená segment DNA zapojený do produkovania polypeptidového reťazca. Môže obsahovat oblasti, ktoré sú pred a za kodujúcou oblasťou (vedúca (leader) a koncová(traiIer, ako aj intervenujúce sekvencie (intróny) medzi jednotlivými kódujúcimi segmentmi0033 Pojem reakcia, ako sa tu používa, označuje akýkoľvek proces zahŕňajúci chemické,enzymatické, alebo fyzikálne pôsobenie, ktoré indikuje prítomnost alebo absenciu konkrétnej záujmovej polynukleotidovej sekvencie. Príkladom reakcie je ampliñkačná reakcia, ako je polymerázová reťazové reakcia (PCR). Ďalším príkladom reakcie je sekvencovacia reakcia bud syntézou alebo Iigáciou. Informatívna reakcia je reakcia, ktorá naznačuje prítomnost jednej alebo viacerých konkrétnych záujmových polynukleotldových sekvencií a v jednom prípade, kde je prítomná len jedna záujmová sekvencia. Pojem jamka ako sa tu používa, označuje reakciu na vopred určenom mieste v stiesnenej štruktúre, napriklad v liekovke, bunke, alebo komore tvaru jamky v poli PCR.0034 Pojem klinicky relevantnà sekvencia nukleových kyselín, ako sa tu používa, označuje polynukleotidovú sekvenciu zodpovedajúcu segmentu väčšej genomickej sekvencie, ktorej potenciálna nerovnováha sa testuje, alebo voči samotnej väčšej genomickej sekvencií. Jedným príkladom je sekvencia chromozómu 21. Ďalšie príklady zahŕňajú chromozóm 18, 13, X a Y. Ešte ďalšie príklady zahŕňajú mutované genetické sekvencie, alebo genetické polymorfizmy, alebo variácie počtu kópií,ktoré plod môže zdedit od jedného alebo oboch svojich rodičov. Ešte dalšie príklady zahŕňajú sekvencie, ktoré sú mutované, delétované, alebo amplifikované v malígnom tumore napríklad sekvencie, v ktorých nastáva strata heterozygocity, alebo génovej duplikácie. V niektorých uskutočneniach vynálezu možno použiť viaceré klinicky relevantné sekvencie nukleových kyselín,alebo ekvivalentne viacnásobné markery klinicky relevantnej sekvencie nukleových kyselín na zabezpečenie dát pre detegovanie nerovnováhy. Napríklad, dáta piatich nie postupných sekvencií na chromozóme 21 možno použit aditlvnym spôsobom na určenie možnej nerovnováhy chromozómu 21, čo efektívne znižuje potrebu objemu vzorky na jednu pátinu.0035 Pojem pozaďová sekvencia nukleových kyselín, ako sa tu používa, označuje sekvenciu nukleových kyselín, ktorej normálny pomer voči klinicky relevantnej sekvencií nukleových kyselín je známy, napríklad pomer 11. Ako jeden príklade pozaďová sekvencia nukleových kyselín a klinicky relevantné sekvencia nukleových kyselín sú dve alely z rovnakého chromozómu, ktoré sú rozdielne kvôli heterozygocite. V ďalšom príklade pozaclová sekvencia nukleových kyselín je jedna alela,ktorá je heterozygotná voči inej alele, ktorá je klinicky relevantnou sekvenciou nukleových kyselín. Navyše niektorá z pozaďovej sekvencie nukleových kyselín a klinicky relevantná sekvencia nukleových kyselín môžu pochádzať od rôznych jednotlivcov.0036 Pojem referenčná sekvencia nukleových kyselín, ako sa tu používa. označuje sekvenciu nukleových kyselín, ktorej priemerná koncentrácia na reakciu je známa, alebo ekvivalentne sa zmerala.0037 Pojem nadmerne zastúpená sekvencia nukleových kyselín, ako sa tu používa, označuje sekvenciu nukleových kyselín medzi dvomi záujmovými sekvenciami (napríklad klinicky relevantnou sekvenciou a pozadovou sekvenciou), ktoráje hojnejšia než iná sekvencia v biologickej vzorke. 0038 Pojem založený na, ako sa tu používa, znamená založený najmenej čiastočne na a označuje jednu hodnotu (alebo výsledok), ktorá sa používa pri určovaní inej hodnoty tak ako nastáva vo vzťahu vstupu metódy a výstupu tejto metódy. Pojem odvodiť, ako sa tu používa,taktiež označuje vzťah vstupu metódy a výstupu tejto metódy, ako nastáva ked odvodenie je výpočet vzorca.0039 Pojem kvantitatívne dáta, ako sa tu používa, znamená dáta, ktoré sa získajú z jednej alebo viacerých reakcií a ktoré poskytujú jednu alebo viac numerických hodnôt. Napríklad počet jamiek,ktoré vykazujú fluorescenčný marker pre konkrétnu sekvenciu, by boli kvantitatívne dáta.

MPK / Značky

MPK: G06F 19/00, C12Q 1/68

Značky: chromozomálnej, sekvencovania, aneuploidie, genómu, použitím, diagnostika, fetálnej

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/28-e16032-diagnostika-fetalnej-chromozomalnej-aneuploidie-pouzitim-sekvencovania-genomu.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Diagnostika fetálnej chromozomálnej aneuploidie použitím sekvencovania genómu</a>

Podobne patenty