Peptid odvodený od regulačného proteínu HIV-1, antigény a ich použitie, vakcínová kompozícia, spôsob detekcie protilátok vyvolaných HIV, súprava na imunologickú skúšku, protilátka a plazmidová DNA

Číslo patentu: 287913

Dátum: 27.02.2012

Autor: Sörensen Birger

Je ešte 19 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Opísané sú modifikované peptidy schopné vyvolať HIV-1 špecifickú imunitnú reakciu bez antagonizácie cytotoxickej aktivity T buniek, aby sa získala účinná profylaktická a terapeutická vakcína proti HIV. Peptidy sú založené na konzervatívnych oblastiach HIV Tat a Rev, regulačných proteínov a Nef, pomocných proteínov. Opisujú sa voľné antigény alebo antigény viazané na nosiči, ktoré obsahujú aspoň jeden z uvedených peptidov, vakcínové kompozície obsahujúce aspoň jeden z antigénov, súpravy na imunologickú skúšku a spôsob detekcie protilátok vyvolaných HIV alebo HIV-špecifickými peptidmi s použitím takýchto antigénov.

Text

Pozerať všetko

Tento vynález sa týka nových peptidov vychádzajúcich z konzervatívnych oblastí regulačných a pomocných peptidov HIV, antigénov voľných alebo viazaných na nosiči, ktoré obsahujú aspoň jeden z uvedených peptidov, vakcínových kompozícii obsahujúcich aspoň jeden z antigénov, súprav na imunologickú skúšku a spôsobu detekcie protilátok vyvolaných HIV alebo HIV-špecifickými peptidmi s použitím takýchto antigénov.Ľudský vírus imunitnej nedostatočnosti typu l (HIV-l), činiteľ spôsobujúci získaný syndróm imunitnej nedostatočnosti (AIDS), predstavuje stále významné ohrozenie zdravia v rozvojových krajinách. V laajinách Západu majú terapeutické stratégie, ktoré sú zacielene na replikáciu HIV a jeho dozrievanie, významný vplyv na progresiu ochorenia. Vysoké náklady na súčasnú liečbu, vysoka toxicita liekov a nedostatok liečiv však spôsobujú, že vývoj bezpečných a účinných vakcín je naďalej rozhodujúci pre udržanie pandémie AIDS pod kontrolou.HIV-l je zložitý retrovírus, ktorý kóduje šesť regulačných a pomocných génov, ktoré sa nenachádzajú v jednoduchých retrovírusoch, menovite tat, rev, nef vzfvpr a vpu (tabuľka l).V eukaryotických bunkách sa len dokonale skombinované mRNA exportujú do cytoplazmy na transláciu. Neskombinovane alebo čiastočne skombinované RNA sa v jadre zadržia a nakoniec sa rozkladajú. Týmto spôsobom prebieha najprv expresía proteínov kódovaných génmi tat, rev a nef(označovaných ako Tat, Rev a Nef) odvodených z viacnásobne skombinovaných druhov RNA a predstavujúcich počiatočnú expresiu génu HIV-l. Na expresiu jednoducho skombinovaných RNA a tiež na prenos genómu neskombinovanej RNA úplnej dĺžky do cytoplazmy na balenie si HIV-l vyvinul prostriedky na prekonanie obmedzení V prenose RNA. Regulačné proteíny Tat a Rev sú kľúčové pri replikácii HIV, pretože mutácie v týchto proteínoch zabraňujú tvorbe HIV-l (Dayton A. I. a kol. (1986) Cell, 44 941 - 947 a Fisher A. G. a kol. (1986) Nature, 320 367 až 371).Pomocné gény sú odvodené z exónov umiestnených výlučne v protismere vývoja génu HIV-l, napríklad víf alebo exónov v protismere od alebo tiež vnútri env, ale v rozličných čítacích rámcoch, napr. tat, rev. Efektívnosť skombinovania sčasti reguluje úrovne génovej expresie rozličných pomocných proteínov.Po integrácii HIV-l provírusovej DNA sa syntetizujú prevažne skrátené formy mRNA bunkovou RNA polymerázou II, ktorá interaguje s polohamí na 5 dlhom terminálnom opakovaní (LTR) provirusovej DNA. tat je jeden z prvých génov, ktorého expresia prebieha a ktorý nesie jadrový lokalizačný signál. Je to účinný aktivátor transldipcie, ktorý zvyšuje transkripciu riadenú LTR až tisíckrát. Nepretržitá expresia Tat zaisťuje kladnú spätnú väzbu pre vysokú úroveň expresie génu. Na rozdiel od bežných aktivátorov transkripcie, ktoré interagujú so sekvenciami DNA, sa Tat viaže priamo na 5 konce všetkých RNA HIV-l pri zvláštnej sekundárnej štruktúre v tvare slučky TAR (prvku transaktivačnej reakcie). Štruktúra tejto slučky je vysoko konzervatívna a je nevyhnutná pre funkciu Tat. Štruktúra interakcie Tat/TAR sa analyzovala s použitím jadrovej magnetickej rezonancie (NMR) (Puglisi a kol. (1992) Science, 257 76 - 80). Tat viaže TAR v spojení s bunkovým proteínom cyklínom T, ktorý zasa viaže CDK 9, ktorý fosforyluje C-terminálnu doménu RNA polymerázy II, čím podporuje predlžovanie transkripcie RNA. Tieto bunkove kofaktory Tat sú prítomné iba v aktivovaných bunkách, ich neprítomnosť potláča transkripciu provirusovej DNA, čim dochádza ku kvázílatencii v T lymfocytoch. Expresia Tat prebieha z dvoch exónov, pričom jadrový lokalizačný signál a väzbová oblasť TAR sú umiestnené v prvom exóne. infikované bunky vylučujú Tat a tento môže pôsobiť heterológnymí účinkami na susedné bunky. K týmto účinkom patrí bunková aktivácia (Hofman a kol. (1993) Blood,82 2774 - 2780), vyvolanie bunkovej a- poptózy (Macho a kol. (1999) Oncogene, 18 7543 - 7551), fungovanie ako vylúčiteľný rastový faktor (Trinh, D. P. a kol. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun., 256 299 až 306) a modulovanie syntézy hostiteľského bunkového proteínu v prospech syntézy vírusového proteínu(Xiao a kol. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun., 244 384 - 389). Terapeutícké stratégie cielene na Tat budú preto mať značný vplyv na infekciu HIV-l.V počiatočných štádíách po inñkovaní majú prevahu malé viacnásobne skombinovane mRNA kódujúce Tat, Rev a Nef. Keď sa dosiahne prahová hladina Rev, neskombinované a jednoducho skombinované RNA sa zhromažďujú v cytoplazme na transláciu, čo umožní pokračovanie rozširovania infekcie. Zlyhanie pri tvorení tejto prahovej hladiny Rev môže prispieť ku kvázilatencii HIV. Rev sa môže viazať len na tie RNA, ktore obsahujú zvláštnu RNA štruktúru RRE (prvok reakcie na Rev), ktorá je umiestnená V env kóduj úcej oblasti genómu. Rev interaguje s RRE ako multimér prostrednictvom zásaditej oblasti bohatej na arginín, ktorá je prítomná v amino terminálnej polovici proteínu. Dôsledkom tejto interakcie je prenos čiastočne skombinovaných RNA, ktoré poskytnú produkty génov, ako sú Env, Víf, Vpu a Vpr, ako aj neskombinovaných RNA,ktoré budú slúžiť ako nové genómy na začlenenie do vytvárajúcich sa častíc. Urobila sa tiež štruktúrna analý 10za interakcie Rev/RRE pomocou NMR (Battiste a kol. (1996) Science, 273 1547 - 1551). Rev obsahuje bohatý exportný signál, čo mu umožňuje byť prenášačom pre nepretržitý transport práve syntetizovaných RNA medzi jadrom a cytoplazmou (Kalland a kol. (1994) J. Virol., 68 1475 - 1485 Meyer Malim, (1994) Genes Dev., 8 1538 - 1547). Týmto spôsobom Rev zabezpečuje, že expresia štruktúmyeh génov prebieha neskôr, až po regulačných génoch. Terapeutické stratégie nasmerované proti Rev prerušia vo včasnom štádiu infekcie životný cyklus vírusu.Aj keď bol pôvodne Nef opisaný ako negatívny faktor, neskôr sa ukázalo, že má pozitívne účinky na replikáciu vírusu a jeho expresia prebieha vo väčšom rozsahu ako Tat a Rev na začiatku aj v priebehu infekcie. Nef sa myristyluje na N konci a je spojený s vnútomou stranou plazmovej membrány. Nef je sčasti zodpovedný za reguláciu znižovanim a za rozklad povrchovej CD 4 endocytózou (Piguet a kol. (1998) EMBO J.,17 2472 - 2481). Odstránenie CD 4 z povrchu bunky zabraňuje superinfekcii inými kmeňmi HIV-l alebo opätovnej infekcii práve uvoľneným vírusom. Nef je tiež zodpovedný za reguláciu znižovanim MHC triedy I,čím ochraňuje infikované bunky pred deštrukciou cytotoxickými lymfocytmi T (Le Gall a kol. (1997) Res. Virol., 148 43 - 47). Nef nie je kľúčovým proteínom vírusu, pretože nie je potrebný pre infekciu in vitro lymfocytov perifćmej krvi alebo bunkových línii T. Delečne mutanty Nef sú však v dlhších časových obdobiach menej patogénne. Nef má tiež zložité vplyvy na prenosová cesty signálu v bunke a obsahuje oblasti bohaté na prolín, ktoré môžu interagovať s doménou SH 3 kináz zúčastňujúcich sa na aktivácii buniek T, čo je vlastnosť potrebná na účinnú replikáciu HIV (Moareñ a kol. (1997) Nature, 385 650 - 653). Vírusy obsahujúce Nef sú schopné syntetizovať viac vírusovej DNA než vírusy s vynechaným génom Nef, čo naznačuje, že Nef priamo alebo nepriamo aktivuje reverzné transkriptázy vírusu. Za tento jav môže byť zodpovedná nizka hladina Nef spojená s viriónmi. Nízke hladiny Nef sa uvoľňujú aj z infikovaných buniek, hoci potenciálny účinok susedných buniek je nejasný. Pretože expresia Nef prebieha na začiatku infekcie a má výrazne účinky na expresiu CD 4 a MHC triedy l, ako aj na progresiu choroby, predstavuje Nef dôležitý cieľ pre budúce terapeutické stratégie.Tat a Nef sa vylučujú a môžu byť prijimane makrofágmi a ich expresia môže prebiehať V spojeni s molekulami MHC triedy Il. To zvyšuje ich stabilitu ako cieľov na terapie na báze peptidov, ktorých expresia by tiež mohla prebiehať v súvislosti s MHC triedy II. Je jasné, že zameranie sa na počiatočné génové produkty,ktoré sú kľúčové pri replikácii HIV-l, ako sú Tat a Rev, by malo dostať prednosť rovnako ako Nef, ktorého expresia prebieha tiež na začiatku a ovplyvňuje progresiu choroby.Gén Protein Názov Expresia Umiestnenie Transaktivátór .ćxktivuje transkripciłu vírusu. Vylu. . . ,. , covany z infikovaných buniek, kde Tat Tat transkripcie viru- Pociatočna Jadro , . . Su moze aktivovať T bunky, mdukovať aotózu a ôsobi ako rastov faktor Exportný faktor P . , Jadierko, nukleop- Riadi spletanie/prenos RNA do cyto, . ociatoena , ,adrove RNA lazma, cytoplazma plazmy. Prenasaci protein.. . . Ňpúšťa endocytózu CD 4. Reguluje Rozličné efekto- . . cytoplľznia vmo znižovanim expresiu MHC triedy 1. Nef Nef , . Počiatočna ny spojene s mem- . . . rove funkcie b , . Viaže sa na kinazy a može ovplyvnoranami . l k.,.Tb .k vať sigria izaciu a a tivaciu unie . Spúšťa vnútrobunkový rozklad CD 4,Vpu Vpu V 1 ľLlSOVý proteín Neskoršia Cytoplazmaąspoje- reguluje znižovaníin lVlHC triedy l,u na s membranami nespeciñcky urychlovac uvol novani retrovírusových častíc. Zvyšuje infekčnosť virusových častíc Vlf V. Faktor ilnfekčnosti Ncskoršia Cytoplazrna, .Inem- bunkovo zlávíslrým spôsobom. Zlvepvirusu branove viriony suje syntezu vírusovej DNA pocas spätnej transkripcie. Prispieva k jadrovému importu predVírusový proteín Hlavne virióny jad- integračného komplexu. Zastavuje Vpr Vpľ r Neskorsla ra bunky vo fáze G 2/M bunkového cyklu.Prirodzene sa vyskytujúce sekvencie HlV v kandidátoch na vakcínu nie sú schopne stimulovať stabilnú a dlhotrvajúcu imunitnú reakciu kvôli vnútomej schopnosti HIV ukryť sa pre imunitný systém zmenou vzhľadu prítomných epitopov. Na prekonanie tohto premenlivého vzhľadu epitopov budú niektoré substitúcie ami 10nokyselín a kombinácie aminokyselín podporovať imunitný systém v objavení a rozpoznávaní týchto antigénov cudzieho vírusu spoľahlivým spôsobom, a preto aj vo väčšej miere.Na základe uvedených známych faktov sme sa rozhodli preskúmať možnosť vytvorenia nových syntetických peptidov, ktoré môžu napodobňovať epitopy z regulačných a pomocných proteínov HIV takým spôsobom, že môžu byť prístupné pre humorálnu, ako aj bunkovú časť imunitného systému, a spĺňali by požiadavky na účinnú terapeutickú a/alebo profylaktickú vakcínu.Počiatočne práce vychádzali z prirodzených sekvencií aminokyselín Tat publikovaných Korberom a kol.,Human Retrovíruses and AIDS (Ľudské retrovírusy a AIDS), 1997, Red. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. Prvý epitop Tat je umiestnený medzi aminokyselinou 1 a aminokyselinou 24 proteínu tatCís. AK Prirodzene sa vyskytuj úce aminokyseliny 1 M SJednopísmenové, rovnako ako trojpísmenove kódy deñnujúce aminokyseliny v sekvenciách uvedených v tejto špeciñkácii sú V súlade s medzinárodnými normami a sú uvedené V učebniciach, napríklad Lehninger A. L., Principles of Biochemistry (Základy biochémie), Worth Publishers Inc., New York, 1982. Aminokyseliny uvedené napravo od ľavého stĺpca predstavujú prirodzené varianty sekvencie. Naše analýzy viedli k sekvencíi obsahujúcej tento modifikovaný epítopCIĚSWVNPRLEPWLHPGSQPNITAŤTN, v ktorom N 1 označuje kyselinu Z-aminohexánovú (norleucín, v skratke Nle v trojpísmenovom resp. N 1 v jednopísmenovom kóde) a cysteínové zvyšky sú v oxidovanom stave, t. j. vytvárajú vnútroreťazcovú disulñdickú väzbu. Pretože cysteínový zvyšok v C-koncovej časti (v polohe 22) peptidu je časťou intramolekulovej disulñdickej väzby mimo tohto zvoleného epitopu, podobná intrapeptidová disulfidická väzba sa vytvorí umiestnením cysteínu do N-koncovej častí zvoleného epitopu. lnou možnosťouje vytvorenie intermolekulovej disulfidickej väzby dimerizáciou sekvenciíĎalšou možnosťou je dimerizácia s iným vybraným epitopom z Tat. Druhý epitop na Tat je umiestnený medzi amínokyselinami 35 a 57 v smere C-konca a je oddelený od prvého epítopu 10 amínokyselinami obsahujúcimi ďalších 5 Cys zvyškov, okrem Cys zvyškov v každom z epitopov. Pomeme veľký počet Cys zvyškov ponúka veľa možností medzimolekulových a vnútromolekulových prepojení. Je pravdepodobne, že táto doména bohatá na Cys bude dominovať V imunologickej expozícii tohto proteínu a tým zabezpečí ukrytíedvoch relevantných epitopov. Výber a modiñkácia týchto dvoch susedných epitopov môže sprístupniť kľúčovú časť proteínu Tat optimálnejším spôsobom.Aby sa obmedzíla pravdepodobnosť vývoja únikových mutantov, počet epitopov sa ďalej zvýšil a vybrali sa dve ďalšie sekvencie peptidov. Tieto sekvencíe sú umiestnené na Rev (zvyšky 58 - 78) a Nef (zvyšky 65 až 85). Prirodzene sekvencie sa publikovali v knihe Human Retroviruses and AIDS 1999 A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences (Ľudské retrovírusy a AIDS, 1999 Prehľad a analýzy sekvencií nukleových kyselín a aminokyselín). Red. Theoretical Bíology and Biophysícs Group, Los Alamos Laboratory, Los AlamosČís. AK Prirodzene sa vyskytujúce aminokyseliny 3 5 P I L T Y VČís. AK Prirodzene sa vyskytujúce aminokyseliny 5 8 R

MPK / Značky

MPK: G01N 33/569, A61P 31/18, A61K 39/12, C07K 14/16, A61K 39/00, C07K 16/08, A61K 9/127

Značky: regulačného, hiv-1, vyvolaných, odvodený, použitie, kompozícia, detekcie, imunologickú, vakcínová, proteínu, spôsob, protilátka, protilátok, súprava, plazmidová, peptid, skúšku, antigény

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/27-287913-peptid-odvodeny-od-regulacneho-proteinu-hiv-1-antigeny-a-ich-pouzitie-vakcinova-kompozicia-sposob-detekcie-protilatok-vyvolanych-hiv-suprava-na-imunologicku-skusku-protilatka-a-pla.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Peptid odvodený od regulačného proteínu HIV-1, antigény a ich použitie, vakcínová kompozícia, spôsob detekcie protilátok vyvolaných HIV, súprava na imunologickú skúšku, protilátka a plazmidová DNA</a>

Podobne patenty