Lyofilizovaná zmes WT-1 obsahujúca CpG

Číslo patentu: E 13102

Dátum: 22.05.2008

Autor: Lemoine Dominique

Je ešte 18 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 Vynález sa týka zlepšených antigénnych zmesí a spôsobov ich použitia na prípravu imunogénnych zmesí. vynález sa osobitne týka Iyoñlizovaných zmesi zahŕňajúcich antigén a agonistu Toll-like receptora 9. Takéto zmesi sa môžu rekonštituovať na imunogénne zmesi na použitie vo vakcinácii s nosičom vybraným zo skupiny nosičov obsahujúcich častice, ktoré sú zložené z Iípozómov. minerálnych soli, emulzii, polymérov a imunostimulačných komplexov (ISCOM). Spôsoby prípravy imunogénnych zmesi z iyoñlizovaných zmesi podla vynálezu a ich použitie v imunizácii sú tiež súčasťou vynálezu.0002 Adjuvantné prostriedky sa niekedy používajú na zlepšenie imunitnej odpovede vyvolanej daným konkrétnym antigénom. Pridanie adjuvantných prostriedkov do vakcíny alebo imunogénnej zmesi však zvyšuje Komplexnosť prípravy komponentov, ako aj Komplexnosť distribúcie a fonnulovania zmesi na vakcináciu. Pripravu každého adjuvantného komponentu, ako aj antígénneho komponentu musia osoby pripravujúce formuláciu zvážiť. Je to zvlášť pravda. pretože napríklad pH adjuvantných komponentov v roztoku sa môže veľmi líšiť od optimálneho pH pre daný antigén a tieto rozdiely je potrebné starostlivo kontrolovať a upravovať, aby sa predišlo napríklad precipitácii alebo strate žiaducich vlastností komponentov. pH antigénu vo vode na injekciu môže mať napríklad hodnotu pH 7, alebo mierne vyššiu, a ked sa pridá adjuvantný prostriedok, pH môže klesnúť až na 6,3. Antigén napríklad nemusí byť stabilný, ak sa dlhší čas skladuje pri tomto pH. 0003 Komponenty sa potom musia formulovať a distribuovať v takej forme, ktorá je čo najstabilnejšia, pretože farmaceutické produkty na ludské použitie musia byť predtým, ako sa schvália pre marketing. dobre charakterizované, stabilné a bezpečné. Z tohto dôvodu sa musia vykonať štúdie finálnej formulácia týkajúce sa dlhodobej stability, aby sa zabezpečila, že formulácia vyhovuje relevantným kritériám. informácie získané z týchto dlhodobých štúdií sa použijú na podporu odoslania kontrolným úradom, ako je napriklad FDA (Federal Drugs Authority - Federálny úrad pre lieky - orgán zodpovedný za schvaľovanie liekov v USA), aby sa preukázalo. že produkt je vhodný na použitie pre ľudí.0004 Sušenie vymrazovaním alebo Iyofilizácia je spôsob, ktorý sa používa na zvýšenie stability a tým aj doby skladovania materiálu včítane farmaceutických materiálov, ako je napríklad antigén použitý vo vakclnach.0005 Zdravotníci často dostávajú Iyofílizované antigénne zmesi na rekonštituovanie s riedidlom(napriklad s vodou na injekciu VVFl, alebo v niektorých prípadoch tekutú adjuvantnú formuláciu) krátko pred podaním pacientovi. Týmto spôsobom sa minimalizuje časové obdobie, v ktorom sa rôzne komponenty finálnej vakcíny nachádzajú blizko vedia seba.0006 Musí sa vziať do úvahy vela faktorov, ak antígény sa Iyotilizujú a vytvoria lyo koláč (suchý produkt lyoñlizácie). Napriklad antigenicitalimunogenita antigénu musí ostať zachovaná aj v Iyolilizovanej forme. Antigén sa v Iyoñlizovanej forme nesmie agregovat alebo degradovať. Lyo koláč musí byť dobre vyformovaný a nesmie skolabovať. Nakoniec antigén musi byť samozrejme vo forme, v ktorej sa po rekonštituovaní rýchlo rozpusti. Ak roztokom na rekonštituovanie nie je jednoducho voda na injekciu, napríklad ak sa antigén rekonštituuje tekutým adjuvantným prostriedkom, potom treba zvážiť vplyv komponentov roztoku na vlastnosti rekonštituovaného produktu.0007 Ako už bolo uvedené, adjuvantné prostriedky sa používajú vela rokov na zlepšenie lmunitnej odpovede na antigénny komponent vakcíny. Osobitne silnou adjuvantnou kombináciou je kombinácia zahŕňajúca 3-deacylovaný-monofosforyl lipid A (3 D-MPL) a saponin, osobitne QS 21,ktorý je vyčistenou frakciou saponinu vyextrahovaného z kôry stromu QuII/aja saponaria Monara. Táto kombinácia sa môže poskytnúť napriklad vo forme emulzie oleja vo vode, v lipozómovej formulácii, alebo podobne.0008 V predchádzajúcich klinických skúškach s antigénmi, napríklad s maláríovýml antigénmi,ako je napríklad RTS. sa poskytuje lyofílizovaný antigén a poskytuje sa aj tekutý adjuvantný prostriedok, napríklad formulácia MPL a QS 21 v emulzii oleja vo vode, alebo Iipozómová formulácia MPL a QS 21 na rekonštituovanie antigénu. Jednotlivé komponenty sa zlúčia tak, aby sa výsledná vakcínová zmes vytvorila krátko pred jej podaním.-2 0009 Určité imunostimuiačné oligonukleotidy obsahujúce nemety|ované CpG dinukleotidy(CpG) sú TLR 9 ligandy a boli identiñkované ako adjuvantné prostriedky, ak sa podávajú systémovým aj slizničným spôsobom (W 096 l 02555. EP 468520, Davis a spol., J. Immunol., 1998,160(2)2870-876 Mccíuskie a Davis, J. Immunol., 1998, 161(9)24463-6). CpG je skratka označujúca motívy cytozínového-guanozinového dinukleotidu, ktoré sú prítomné v DNA. Historicky bolo pozorované, že DNA frakcia BCG by mohla mať protinádorový účinok. V dalších štúdiách bolo dokázané, že syntetické oligonukleotidy odvodené zo sekvencii BCG génu sú schopné indukovať imunostimuiačné účinky (in vitro aj in vivo). Autori týchto štúdií prišli k záveru, že nositeľom tejto aktivity sú určité palindrómové sekvencie, včítane centrálneho CG motívu. Ustredná úloha CG motívu v imunostimulácii bola neskôr objasnená v publikácii Krieg, Nature 374, p 546 1995. Podrobná analýza ukázala, že CG motív musí byť v určitom kontexte sekvencie a že takéto sekvencíe sú bežné v bakteriálnej DNA. avšak sú zriedkavé v DNA stavovcov. lmunostimulačná sekvencia je často purin, purin, C, G, pyrimidin, pyrimidin kde dinukleotidový motív nie je metylovaný, avšak je známe, že aj iné nemety|ované CpG sekvencie majú imunostimuiačné účinky a môžu sa použiť vo vynáleze.0010 Ukázalo sa aj to, že imunostimulačný oligonukleotid si môže zachovať imunologickú aktivitu, ak guanozin zmutuje na 7-deazaguanozinový motív (W 0 03057822).0011 Predpokladá sa, že tieto imunostimuiačné oligonukleotidy majú v roztoku kyslá pH,napríklad nižšie ako pH 7, napríklad 6,3, 6,1. alebo nižšie. Môže byť preto ťažké inkorporovať ich do tekutých vakcínových fomtulácil, pretože sa vo formuláciách líšia od ostatných komponentov. Ako bolo uvedené vyššie, môže to spôsobiť precipitáciu alalebo dlhodobé problémy so stabilitou.0012 Predpokladá sa. že tieto imunostimuiačné oligonukleotidy sú pravdepodobne velmi účinné adjuvantné prostriedky, osobitne vtedy. ak sa použijú v kombinácií s existujúcimi adjuvantnými kombináciami, ako je napriklad 3 D-MPL a QS 21. Predpokladá sa, že takéto adjuvantné prostriedky sa použijú v pripade chorôb, pre ktoré bolo doteraz ťažké poskytnúť účinné vakcíny, ako je napríklad Hlv, rakovina a možno malária.0013 Existuje vela rôznych spôsobov. ktorými sa adjuvantné prostriedky môžu pridať do vakcin,avšak musia sa pridať spôsobom, ktorý nemá vplyv ani na stabilitu ich samotných, ani na stabilitu antigénnej zmesi. a takisto aj spôsobom. ktorý nebude znamenať neprimeranú záťaž na zdravotníckeho pracovníka vykonávajúceho rekonštituovanie vakcíny. Najjednoduchším spôsobom na dosiahnutie tohto cieľa by bolo umiestniť ďalšie komponenty do dalších flaštičiek tak, že by sa držali oddelene až do času tesne pred rekonštituovaním, čim sa minimalizuje čas, počas ktorého by sa komponenty mohli vzájomne ovplyvniť. To znamená, že antigén a imunostimulačný oligonukleotid by sa poskytol v oddelených flaštičkách. Potom, ak sa použijú aj dalšie adjuvantné komponenty, ako je napriklad MPL a QS 21, môžu sa poskytnúť vo forme tekutej zmesi v tretej flaštičke. Avšak zvyšujúci sa počet komponentov vo zvyšujúcom sa počte flaštíčiek vedie ku zvýšeným nákladom. odpadu a nevyhnutne aj ku zvýšenej možnosti výskytu chýb počas rekonštituovanía.0014 Pôvodcovia vynálezu zistili, že ak TLR 9 ligand, napríklad CpG imunostimulačný oligonukleotid má byť súčasťou ímunogénnej zmesi ako adjuvantný prostriedok, uvedený TLR 9 ligand sa môže lyofilizovať spolu s antigénom tak, aby sa poskytla jediná fíaštička obsahujúca antigén a adjuvantný TLR 9 ligand spolu v jednom lyo koláči.0015 Predkladaný vynález preto poskytuje lyofilizovanú zmes zahŕňajúcu jeden alebo viac nepozitivne nabitých antigénov a imunostimulačný oligonukleotid obsahujúci CpG, v ktorom uvedený jeden alebo viac antigénov je WT-1, alebo jeho derivát, alebo fragment. kde tento derívát je dostatočne podobný natívnym antigénom na zachovanie antigénnych vlastností a je pritom stále schopný vyvolať imunitnú odpoveď proti WT-1 a kde tento fragment je dlhý aspoň 8 aminokyselín a je schopný indukovať imunitnú odpoveď, ktorá krížovo reaguje s prirodzene sa vyskytujúcím WT-1. 0016 V jednom aspekte uvedený oligonukleotid obsahujúci CpG zahŕňa sekvenciu purin, purin,C, G, pyrimidín, pyrimidín. V ďalšom aspekte uvedený imunostimulačný oligonukleotid sa voli zo skupiny zloženej zo SEQ lD N 021 SEQ lD N 022 SEQ lD N 023 SEQ lD N 024 a SEQ lD N 025. 0017 Bez viazania sa na nejakú teóriu sa predpokladá, že poskytnutie antigenu aimuno« stimulačneho oligonukleotidu obsahujúceho CpG spolu poskytuje komponent, ktorý je stabilnejšíako je len jednoduché pridanie imunostimulačného olígonukleotidu obsahujúceho CpG do tekutej formulácie MPL a QS 21.-3 0018 Predkladaný vynález poskytuje výhodu, že tam, kde antigén a imunostimulačný oligonukleotid obsahujúci CpG sa rekonštituuje s WFI. je možné poskytnúť len jednu fľaštičku obsahujúcu Iyoñlizovanú formuláciu. Navyše tam, kde WT-1 alebo jeho derivát alebo fragment a imunostimulačný oligonukleotid obsahujúci CpG sa má rekonštituovat s tekutou fonnuláciou, ako je napríklad tekutá adjuvantná formulácia. potom je výhodné byt schopný poskytnúť len dve flaštičky komponentov (namiesto troch). Má to na druhej strane ekonomické prednosti, pričom sa poskytuje produkt vhodný po rekonštituovanl na použitie ako vakcína.0019 Pôvodcovia vynálezu navyše zistili, že súčasná Iyofilizácia CpG s antigénmi, ktoré by v tlmivom roztoku na rekonštituovanie nemali celkový pozitívny náboj, môže po rekonštituovanl bud s vodou na injekciu, alebo s tekutým adjuvantným prostriedkom zvýšiť rozpustnosť týchto antigénov. Preto predkladaný vynález poskytuje aj spôsob zvýšenia rozpustnosti lyotilizovaného antigénu po rekonštituovanl tam, kde antigén by v tlmivom roztoku na rekonštituovanie nemal čistý pozitívny náboj, kde spôsob zahŕňa krok súčasnej lyofilizácie imunostimulačného oligonukleotidu obsahujúceho CpG s antigénom. kde antigénom je WT-1, alebo jeho derivát, alebo fragment. Predkladaný vynález poskytuje aj použitie imunostimulačného oligonukleotidu obsahujúceho CpG na zvýšenie rozpustnosti Iyotilizovaného nepozitlvne nabitého antigénu po rekonštituovaní, kde antigénom je WT-1, alebo jeho derivát, alebo fragment. Pod pojmom nepozitlvne nabitý sa rozumie to, že celkový náboj proteínu nie je pozitívny. Protein môže obsahovat pozitívne aj negatívne náboje,avšak celkový náboj proteínu je bud neutrálny, alebo negatívny.0020 Predkladaný vynález poskytuje aj spôsob prípravy imunogénnej zmesi zahŕňajúcej kroky rekonštituovania Iyotilizovanej zmesi podla opisu vtomto dokumente s vhodným nosičom. V jednom uskutočnení uvedený nosič je lipozómový roztok, alebo emulzia oleja vo vode. Uvedený nosič môže volitelne obsahovať jeden alebo viac imunostimulačných prostriedkov, ktoré sa môžu vybrat zo skupiny zloženej zTLR 4 agonistov, TLR 4 antagonistov, saponlnov, TLR 7 agonistov,TLR 8 agonistov a TLR 9 agonistov. Vjednom uskutočnení uvedený nosič obsahuje dva alebo viac imunostimulačných prostriedkov a v jednom aspekte tieto imunostimulačné prostriedky môžu byt 3 deacylované MPL a QS 21.0021 Predkladaný vynález poskytuje aj spôsob prípravy lyofilizovanej zmesi podla vynálezu, kde spôsob zahŕňa kombináciu jedného alebo viacerých požadovaných antigénov, TLR 9 ligand a vhodne exclpienty a lyoñlizovanie výslednej zmesi.0022 Pôvodcovia vynálezu zistili, že TLR 9 ligandy. ako napríklad CpG oligonukleotidy, sa môžu Iyofilizovať s daným antigénom bez ovplyvnenia antlgenicity alebo stability tohto antigénu. Pojem TLR 9 ligand znamená zlúčeninu, ktorá môže interagovať s TLR 9 receptorom. Bolo ukázaná, že členovia rodiny TolI-like receptorov (TLR), ktoré boli ako prvé objavené uovocných mušiek(Drosophila), sú receptory rozpoznávajúce vzory, pričom každý z členov rozpoznáva a reaguje na rôzne mikrobiálne komponenty s cielom eliminovať/odstrániť mikrobiálnu ínváziu. Naviazanie molekulových vzorov asociovaných s patogénom (PAMP) na TLR indukuja produkciu reakčných kyslíkových adusíkových medzlproduktov, iniciáciu prozápalovej cytokínovej siete a upreguláciu ko-stimulačných molekúl spájajúcich rýchlu vrodenú odpoveď s adaptívnou imunitou. Je známe, že mnohé TLR ligandy sú užitočné ako adjuvantné prostriedky. Bolo dokázané, že TLR 9 reaguje na oligonukleotldové agonisty. Preto TLR 9 ligandy opísané vo vynáleze ako príklady sú imunostimulačné oligonukleotidy. V jednom príklade takéto TLR 9 ligandy obsahujú CpG motív. lmunostimulačné oligonukleotidy obsahujúce CpG podľa vynálezu môžu zahŕňať moditikácie v nukleotidoch. Napríklad W 00226757 a WO 03057822 opisuje modiñkácie v C a v G časti imunostimulačných oligonukleotidov obsahujúcich CpG.0023 V jednom uskutočnení CpG oligonukleotid obsahuje dva alebo viac dinukleotidových CpG motívov oddelených aspoň tromi, podľa možnosti aspoň šiestimi alebo viacerými nukleotidmi. Oligonukleotidy podľa vynálezu sú typicky deoxynukleotidy. Vjednom uskutočnení internukleotidová väzba v oligonukleotide je fosforoditioát, alebo podľa možnosti fosforotioátová väzba,hoci mohol by sa použiť aj fosfodiester e iné internukleotidové väzby včítane oligonukleotidov so zmiešanými internukleotldovými väzbami. Spôsoby produkcie fosforotioátových oligonukleotidov alebo fosforoditioátu sú oplsané v US 5,666,153, US 5,278,302 aWO 95/26204. Do úvahy prichádzajú aj oligonukleotidy zahŕňajúce rôzne internukleotidové väzby. napríklad zmiešané fosforotioátové fosfodiestery. Môžu sa použiť aj iné internukleotidové väzby stabilizujúce oligonukleotid.-4 0024 Príklady CpG oligonukleotidov majú nasledujúce sekvencie. Vjednom uskutočnení tieto sekvencie obsahujú fosforotioátom modifikované internukleotidové väzby.OLIGO 1 (SEQ ID N 01) TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) OLIGO 2 (SEQ lD N 022) TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)OLIGO 3 (SEQ ID N 013) ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG OLIGO 4 (SEQ ID N 014) TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) OLIGO 5 (SEQ ID N 015) TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)0025 Alternatívne CpG oligonukleotidy môžu zahŕňať vyššie uvedené sekvencie s tým. že môžu byť v nich prítomné bezvýznamné delécie alebo adície.0026 CpG oligonukleotidy použité vo vynáleze sa môžu syntetizovať akýmkoľvek spôsobom známym v problematike (napríklad EP 468520). Takéto oligonukleotidy sa môžu výhodne syntetizovať v automatickom syntetizátore.0027 V kontexte tejto špecifikácie pojem antién znamená imunogénny komponent vhodný na vyvolanie špecifickej imunitnej odpovede a vhodný na včlenenie do vakcíny alebo imunogénne zmesi. Antigén môže zahŕňať alebo môže byt zložený z WT-1 exprimovaného génom Wllmsovho nádoru, alebo zjeho N-terminálneho fragmentu WT-1 F zahŕňajúceho približne aminokyseliny 1249. WT 1 je protein. o ktorom sa pôvodne zistilo, že je nadexprimovaný vo Wilmsovom nádore, čo je rakovina obličiek u detí. Antigén, ktorý sa môže použiť, zahŕňa takmer celú dĺžku proteínu ako antigénu. Vjednom uskutočnení antigén môže zahŕňať alebo môže byť zložený z proteínu WT 1 A 10, ktorý je 292 aminokyselín dlhý rekombinantný fúzny protein zložený z 12 mérnej skrátenej tat sekvencie a aminokyselín č. 2-281 zo sekvencie WT 1. Barrett, Clin. Experim. Immunol. 2007. 1482189498, opisuje WT 1 vakcíny s montanidom ako adjuvantným prostriedkom.0028 Vjednom uskutočnení antigén má izoelektrický bod 9,6 alebo nižší. Vjednom uskutočnení antigén má izoelektrický bod 9 alebo nižší. Vjednom uskutočnení antigén má izoelektrický bod 8,5 alebo nižší. Vjednom uskutočnení antigén má izoelektrický bod 8,0 alebo nižší. Vjednom uskutočnení antigén má izoelektrický bod 7,5. Vjednom uskutočnení antigén má izoelektrický bod v rozsahu medzi 7 a 8.0029 Čistý náboj proteínu po rekonštituovaní v tlmivom roztoku závisí od počtu pozitívnych a od počtu negatívnych nábojov v proteine, pričom tento náboj bude samozrejme rôzny, v závislosti od pH tlmivého roztoku na rekonštituovanie. izoelektrický bod je pH, pri ktorom čistý náboj proteínu je neutrálny. Ak pH tlmivého roztoku na rekonštituovanie je pod izoelektrickým bodom antigénu,potom proteín má tendenciu niest čistý pozitívny náboj. Ak pH tlmivého roztoku na rekonštituovanie je nad izoelektrickým bodom antigénu, proteín má tendenciu niesť čistý negatívny náboj. vynález je osobitne užitočný v lyotilizovaní a rekonštituovaní antigenov, ktoré majú izoelektrický bod taký, že v plánovanom tlmivom roztoku na rekonštituovanie by protein niesol čistý negatívny náboj. Vtakýchto podmienkach (pozri príklad 3) prítomnosť CpG v Iyotilizovanej zmesi môže v tlmivom roztoku na rekonštituovanie zvýšiť rozpustnosť antigénu, 0030 Vjednom uskutočnení lyofilizovaný antigén aimunostimulačný oligonukleotid obsahujúci CpG sa poskytuje vo forme jednej dávky, napriklad vjednej fíaštičke.0031 Vjednom uskutočnení lyotilizovaný antigén je prítomný v takom množstve, aby po rekonštituovaní poskytol koncentráciu antigánu v rozsahu 10 až 250 g.0032 Vjednom uskutočnení imunostimuíačný oligonukleotid obsahujúci CpG je prítomný v takom množstve, aby po rekonštituovaní poskytol koncentráciu od 10 do 1000 ug, napriklad 500 g. 0033 Antigén, ktorý je kombinovaný v lyofílizovanej znesi s imunostimulačným oligonukleotidom obsahujúcim CpG, je protinádorový antién. imunogénne zmesi pripravené s Iyoñlizovanou antigénnou zmesou podľa vynálezu sú preto užitočné na imunoterapeutické liečenie nádorov. Napríklad lyofilizovaná zmes sa môže pripraviť s rakovinovými antigénmi, nádorovými antigénmi alebo santigénmi na odhojenie nádorov podľa opisu vo vynáleze, ako sú napríklad proteíny exprimované napríklad v rakovine prostaty, rakovine prsníka, v rakovine hrubého čreva a konečníka, v rakovine pľúc, obličiek, vaječníkov, pečene, a hlavy a krku.0034 Vynález používa vyššie uvedené antigény. imunogénne deriváty a imunogénne fragmenty a fúzne proteíny. ktoré ich zahŕñajúce, aj v aspektoch podla vynálezu.0035 Namiesto prirodzene sa vyskytujúceho antigénu sa antigény asociované s nádormi podľa vynálezu môžu použiť vo forme ich derivátov alebo fragmentov.

MPK / Značky

MPK: C07K 14/47, A61K 39/00

Značky: lyofilizovaná, obsahujúca

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/26-e13102-lyofilizovana-zmes-wt-1-obsahujuca-cpg.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Lyofilizovaná zmes WT-1 obsahujúca CpG</a>

Podobne patenty