Mikroorganizmy a spôsob výroby amidov

Číslo patentu: 288061

Dátum: 13.03.2013

Autori: Robins Karen Tracey, Nagasawa Toru

Je ešte 18 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Opisujú sa mikroorganizmy rodu Rhodococus, ktoré sú schopné tolerovať aspoň 3M koncentráciu acetonitrilu. Ďalej sa opisuje nový spôsob výroby amidov vzorca (III) zo zodpovedajúcich nitrilov použitím týchto mikroorganizmov. Ďalej sa opisuje použitie týchto mikroorganizmov na odstránenie odpadov acetonitrilu.

Text

Pozerať všetko

Vynález sa týka mikroorganizmov, ktoré sú schopné tolerovať acetonitril v koncentrácii aspoň 3 M, enzýmu s aktivitou nitrilhydratázy, spôsobu výroby amidov použítím týchto mikroorganizmov, prípadne enzýmu a taktiež použitia týchto mikroorganizmov na odstránenie acetonitrilových odpadov.Na výrobu amidov, ako napríklad amidu kyseliny nikotínovej, esenciálneho vitamínu komplexu vitamínu B pre zvieratá a človeka, je známych niekoľko biotechnologických spôsobov.Napríklad EP-A 0 307 926 opisuje premenu 3-kyánpyridinu na amid kyseliny nikotínovej pomocou Rhodococcus rhodochrous J l. Nevýhodou tohto spôsobu je červené zafarbeníe Rhodacoccus rhodochraus Jl,čím dochádza k zafarbeniu produktu. Navyše tento mikroorganizmus má vysokú hodnotu KM vzhľadom na substrát B-kyánpyrídín, má nízku tepelnú toleranciu a malú toleranciu proti 3-kyánpyridinu.W 0 99/5306 opisuje napríklad spôsob výroby amidu kyseliny nikotínovej zo zodpovedajúceho nitrilu pomocou mikroorganizmov rodu Rhodococcus, Amycolatopsis a Actínomadura. Nevýhodou tohto spôsobu je to, že použité mikroorganizmy rodu Amycalatopsís sa pri vyšších teplotách inaktivujú. Navyše majú tieto mikroorganizmy malú toleranciu proti 3-kyánpyrídínu a amidu kyseliny nikotínovej. Mikroorganizmy rodu Rhadococcus, ktoré sa opisujú, majú vysokú hodnotu KM vzhľadom na substrát 3-kyánpyridín a nízku tepelnú stabilitu. Z týchto dôvodov tento spôsob pre veľkovýrobu nie je hospodámy.Úlohou predloženého vynálezu bolo poskytnúť mikroorganizmy, ktoré sú stabilnejšie, majú nižšiu hodnotu KM napríklad pre substrát 3-kyánpyridín a tak sú použiteľné pre hospodárny spôsob výroby amídov. Zodpovedajúci amid sa pritom môže ízolovať vo veľmi dobrom výťažku a čistote. Táto úloha sa rieši pomocou mikrooganizmov podľa nároku l, enzýmom podľa nároku 5 alebo 7 a spôsobom podľa nároku 8.Mikroorganizmy podľa vynálezu sa získajú vhodnou selekciou napríklad zo vzoriek pôdy, kalu alebo odpadových vôd pomocou zvyčajných mikrobiologických techník. Učelne sa mikroorganizmy podrobia selekcii pestovaním s pyridinaldoxímom všeobecného vzorca (I)N (I) alebo s nitrilmi ako zdrojom uhlíka v prítomnosti iónov kobaltu a napríklad extraktom kvasnic a/alebo amónnych solí. Zo získaných kultúr sa potom selektujú také mikroorganizmy, ktoré sú schopné tolerovať acetonitril v koncentrácii aspoň 3 M, a ktoré sú schopné premieňať nitrily, ako napríklad 3-kyánpyridín a acetonitril na zodpovedajúci amid.Ako pyridinaldoxímy sa môžu použiť pyridin-2-, pyridín-3- alebo pyridín-4-aldoxím.Nitrily vhodné na selekciu sú najmä také, ktoré sa majú použiť ako substrát pri neskoršej biotransformácii, napríklad acetonitril (nitril kyseliny octovej), propionitril, butyronitríl, nitril kyseliny krotónovej a nitril kyseliny malónovej.Ako zdroj pre kobaltové ióny sa výhodne používajú tzv. zlúčeniny kobaltu generujúce kobaltové ióny,napríklad soli C 024 alebo Co ako chloridy, sulfáty a acetáty kobaltu. Výhodne sa ako zlúčenina kobaltu použije soľ Coz ako napríklad CoClg. Pestovanie sa však môže uskutočňovať tiež spolu s kovovým kobaltom alebo s inými zlúčenínami kobaltu. Zvyčajne sa kobalt alebo zlúčeniny kobaltu používajú v množstve od 1 do 30 mg/l, výhodne od 1 do 20 mg/l v kultivačnom médiu.Ako amónne soli sa môžu použiť napríklad amónne fosfáty ako (NH 4)2 HPO 4 alebo (NH 4)H 2 PO 4.Mikroorganizmy sa pred vlastnou biotransformáciou pestujú vo vhodných médiách. Vhodné kultivačné médiá sú napriklad médiá, ktoré sa opisujú v tabuľkách 3 alebo 5.Pestovanie sa zvyčajne uskutočňuje pri teplote od 20 do 40 °C a pri hodnote pH medzi 5 a 8, výhodne pri teplote od 25 do 35 °C a pri hodnote pH medzi 6 a 7,5.Počas pestovania sa účelne indukujú účinné enzýmy, nitrilhydratázy, pridaním induktora enzýmu.Ako indikátory enzýmu sa môžu použiť nasýtené alebo nenasýtene alifatické nitrily alebo zodpovedajúce amidy. Ako alifatické nitrily sa môžu použiť všetky Czq-alkán-nitrily, ako napríklad butyronitríl, izobutyronitríl, nitril kyseliny valerovej alebo nitril kyseliny izovalerovej, alebo Cgą-alkénnitrily, ako napríklad metakrylnitril alebo nitril kyseliny krotónovej. Ako alifatické amidy sa môžu použiť všetky CN-alkánamidy, akonapríklad butyramíd, izobutyramid, amid kyseliny valerovej alebo amid kyseliny propiónovej, alebo C 34-alkénamidy, ako napríklad metakrylamid alebo amid kyseliny krotónovej. Výhodne induktory enzýmu sú metakrylamid, butyramíd, izobutyramid, amid kyseliny valerovej, metakrylnitril, amid kyseliny krotónovej,butyronitril alebo izobutyronitril. Obzvlášť výhodný induktor enzýmu je metakrylnitril.Mikroorganizmy podľa vynálezu sú schopné tolerovať koncentráciu acetonitrilu vo výške aspoň 3 M. Tým sa rozumie to, že aktivita enzýmu je stabilná po l hodinovej inkubácii s 3 M acetonitrilom v 0,1 M káliumfosfátovom tlmivom roztoku pri pH 7,0 a 20 °C, to znamená, že strata na aktivite je maximálne 10 . Výhodné mikroroganizmy tolerujú koncentráciu acetonitrilu vo výške aspoň 6 M počas l hodiny za uvedených podmienok pri strate aktivity maximálne 50 . Obzvlášť výhodné mikroorganizmy tolerujú koncentráciu acetonitrilu vo výške aspoň 9 M počas l hodiny za uvedených podmienok pri strate aktivity maximálne 70 . Pri celkom naj výhodnejších mikroorganizmoch je samotná aktivita enzýmu po niekoľkominútovej inkubácii s 15 M a 19 M acetonitrílom (to zodpovedá čistému acetonitrilu) stabilná.Strata aktivity enzýmu je tak pri inkubácii s 15 M acetonitrilom po 10 minútach menej ako 10 .Mikroorganizmy podľa vynálezu majú veľkú termickú stabilitu, to znamená, že majú vyššiu stabilitu pri vysokých teplotách než dosiaľ známe mikroorganizmy. Výhodne predstavuje strata aktivity enzýmu mikroorganizmov podľa vynálezu po jednohodinovej inkubácii v 0,1 M káliumfosfátovom tlmivom roztoku, pH 7,0 pri 60 °C maximálne 10 a strata aktivity enzýmu po dvojhodinovej inkubácii za uvedených podmienok predstavuje maximálne 40 .Pod pojmom aktivita enzýmu sa tu rozumie aktivita nitrilhydratázy, najmä aktivita nitrilhydratázy proti 3-kyanpyridínu ako substrátu.Ďalšími vlastnosťami mikroorganizmov podľa vynálezu sú vysoká tolerancia proti výhodne používanému substrátu S-kyánpyridínu a proti produktu z toho vytvoreného amidu kyseliny nikotínovej a nízka hodnota KM vzhľadom na 3-kyánpyridin. Vynikajúcou vlastnosťou je tiež to, že môžu akumulovať acetamid vo vyššej koncentrácii než zodpovedá koncentrácii roztoku acetamidu nasýtenému pri 30 °C (cca 220-230 g acetamidu v 100 ml vody).Výhodné mikroorganizmy patria k rodu Rhodococcus. Obzvlášť výhodné mikroorganizmy sú kmeň Rhodococcus sp. F Z 4 ajeho funkčne ekvivalentné varianty a mutanty. Pod pojmom funkčne ekvivalentné varianty a mutanty sa rozumejú také varianty a mutanty, ktoré tolerujú acetonitril v koncentráciách najmenej 3 M. Celkom najvýhodnejšie sú pigmentovo-negatívne kmene Rhodococcus, to mamená kmene, ktoré nie sú červené, a ktoré môžu spôsobiť zafarbenie požadovaného produktu. Takéto kmene sa dajú prípadne ľahko vytvoriť z mikroorganizmov tvoriacich pigment mutagenézou pomocou UV žiarenia alebo mutagennými chemikáliami.Kmeň Rhodococcus sp. FZ 4 sa uložil ll. júla 2000 do Nemeckej zbierky mikroorganizmov a bunkových kultúr (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), Mascheroder Weg lb,D-38124 Braunschweig podľa Budapeštianskej zmluvy pod depozítným číslom DSM 13597. Tento mikroorganizmus sa nemohol na základe jeho identifikačných údajov priradiť k žiadnemu dosiaľ mámemu druhu Rhodocaccus a teda sa priradil novému druhu.Funkčné ekvivalentné varianty a mutanty kmeňa Rhodococcus sp. FZ 4 sa môžu vytvoriť bud spontármou mutáciou, alebo napríklad pomocou UV žiarenia, alebo mutagennými chemikáliami. Výhodné varianty a mutanty kmeňa Rhodococcus sp. FZ 4 sú pigmentovo negatívne, to znamená, nemajú červenú farbu, ktorá môže spôsobiť zafarbenie požadovaného produktu.Enzýmový extrakt je moäié získať napríklad otvorením mikroorganizmov, napríklad pomocou ultrazvuku, tlakovým zariadením podľa Frencha alebo pomocou lyzozymovej metódy.Enzýmy podľa vynálezu s aktivitou nitrilhydratázy sa získajú z mikroorganizmov, ktoré sa opisujú skôr. Výhodne sa získajú z mikroorganizmov rodu Rhodococcus, najmä z mikroorganizmov Rhadacoccus sp. FZ 4Tieto enzýmy majú najmä nasledujúce vlastnosti(a) hodnotu KM pre substrát acetonitril 2,84 il,00 mM a pre substrát 3-kyanopyridín 80,5 l 15,0 mM, zakaždým v 0,05 M káliumfosfátovom tlmivom roztoku, pH 7,0 pri 20 °C,(c) natívnu molekulovú hmotnosť 465 l 50 kDa, stanovenú pomocou HPLC.Vlastná biotransformácia sa môže uskutočňovať s mikroorganizmami, ktoré sa opisujú skôr, enzýmovým extraktom z týchto mikroorganizmov alebo s izolovaným enzýmom. Výhodne sa biotransfonnácia uskutočňuje s mikroorganizmami Rhodacaccus sp. FZ 4.Ako substráty na biotransformáciu sa môžu použiť nitrily všeobecného vzorca(I 1)Vo všeobecnom vzorci (II) substituent R znamená Cpó-alkylovú skupinu, CM-alkenylovú skupinu, alebo skupinu všeobecného vzorca (lV)Vo všeobecnom vzorci (IV) X znamená atóm dusíka alebo -CH a substituenty R 2 a R 3 znamenajú nezávisle od seba atóm vodíka, atóm halogénu, Cm-alkylovú skupinu alebo Czó-alkenylovú skupinu.Ako Cm-alkylová skupina sa môže použiť metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, terc- butyl, izobutyl, pentyl a jeho izoméry, ako aj hexyl a jeho izoméry. Ako Czć-alkenylová skupina sa môže použiť napríklad vinyl,alyl, l-propen-l-yl alebo l-propen-Z-yl.Ako halogén sa môže použiť F, Cl, Br alebo I.Výhodnými zástupcami nitrilov všeobecného vzorca (II) sú acetonitril, butyronitril, akrylnitril, propionitril, nitril kyseliny krotónovej, Z-kyánpyridín, 3-kyánpyridín, 4-kyánpyridín, benzonitril, fluórbenzonitñl,chlórbenzonitril a brómbenzonitril. Najvýhodnejšie substráty sú acetonitril a 3-kyánpyridín.Výhodne sa biotransformácia uskutočňuje pri jednorazovom alebo kontinuálnom pridaní substrátu. Ako je odbomíkovi známe, použiteľná koncentrácia substrátu je závislá od rozpustnosti substrátu, ktorý sa použije.Výhodne sa spôsob uskutočňuje s bunkami v pokoji (s nerastúcirni bunkami).Ako médiá na biotranformáciu sa môžu použiť v odbore obvykle médiá, napríklad nizkomolekulové fosfátové tlmivé roztoky, tlmivý roztok HEPES, citrátový tlmivý roztok a borátový tlmivý roztok. Z nízkomolekulových fosfátových tlmivých roztokov je výhodný 0,0 l až 0,5 M fosfátový tlmivý roztok, zvlášť je výhodný 0,05 až O, 25 M fosfátový tlmivý roztok.Výhodne sa biotransformácia uskutočňuje pri teplote od 5 do 50 °C, zvlášť výhodne pri teplote od 20 do 40 °C. Výhodná hodnota pHje medzi 5 a 10, obzvlášť výhodnáje medzi 6 a 7,5.Po premene nitrilu všeobecného vzorca (II) sa potom môžu izolovať zodpovedajúce amidy všeobecného vzorca (III)Rl-CONHZ (m),kde R má už uvedený význam, prípadne po oddelení buniek pomocou zvyčajných metód spracovania, ako napríklad kryštalizáciou alebo rozstrekovým sušením.Ďalším predmetom vynálezu je použitie opisaných mikroorganizmov, najmä rodu Rhodococcus, na odstránenie odpadov acetonitrilu.Acetonitril je rozpúšťadlo, ktoré sa používa napríklad pri HPLC a nakoniec sa musí odstrániť ako odpad. Pri odstránení acetonitrilových odpadov podľa vynálezu môže byť acetonitril prítomný v koncentrácii maximálne až 19 M, čo zodpovedá čistému acetonitrilu. Výhodne sa používa 0,25 až 15,0 M, výhodne l až 10 M roztok, prípadne suspenzía acetonitrilu.Výhodne sa mikroorganizmy používajú na odstránenie acetonitrilových odpadov pri teplote od 5 do 50 °C, výhodne pri teplote od 20 do 40 °C. Hodnota pH je výhodne medzi 5 a lO, výhodne medzi 6 a 8. Čas premeny acetonitrilu na acetamid na odstránenie odpadov závisí od koncentrácie acetonitrilu. Napríklad tento čas je cca 2 hodiny pri výrobe 9,5 M roztoku/suspenzia acetamidu, pri hodnote pH 7,0 a teplote cca 20 °C. Identifikácia kmeňa FZ 4 (DSM 13597)1. Diagnostické aminokyselina pepetidoglykanu kyselina mezo-diaminopimelová.2. Kyseliny mykolové prítomné sú kyseliny mykolové s dĺžkou reťazca od C 40 do C 43.3. Vzorka mastných kyselín prítomné sú lineáme, nasýtené a nenasýtené mastné kyseliny ako i vysoký podiel kyseliny tuberkulostearovej. Na mklade vzorky mastných kyselín sa kmeň FZ 4 identifrkoval ako patriaci k rodu Rhadococcus.Makroskopický vzhľad a morfológia buniek kmeňa FZ 4 sa podobali Rhodococcus rhodochrous. Kolónie kmeňa FZ 4 sú lososovo červené (RAL 3022) a mladé kultúry vyvíjali rozvetvené čiarky (hyfy), ktoré sa vyvinuli do tvaru tyčiniek a kokov.Na základe chemotaxonomických a konvenčných znakov sa kmeň F Z 4 identifíkoval ako patriaci k druhu Rhodacaccus rhodachrous, ale s malým korelačným faktorom.Sekvencia prvých 500 báz l 6 S rDNA ukazuje podobnosť len 97,7 k sekvencii typického zástupcu kmeňa predruh Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus rhodochrous DSM 43241, a 99,1 k inému referenčnému kmeňu Rhodococcus rhodochrous. Pretože podobnosť sekvencie prvých 500 báz l 6 S rDNA krneňa FZ 4 k sekvencii kmeňa Rhodococcus rhodochrous DSM 43241 bola pod 99,5 , nemôže sa kmeň FZ 4 identifikovať ako patriaci k druhu Rhodococcus rhodochrous. Kmeň FZ 4 sa preto ídentiñkoval ako nový druh vnútri rodu Rhodococcus.Prehľad obrázkov na výkresochObr. l Zobrazenáje biotransformácia acetonitrilu na acetamid s bunkami v pokoji Rhodococcus sp. FZ 4.Obr. 2 Zobrazené je teplotné optímum aktivity nitrilhydratázy v bunkách V pokoji Rhodococcus sp. FZ 4.Obr. 3 Zobrazenáje termická stabilita aktivity nitrilhydratázy v bunkách v pokoji Rhodocaccus sp. FZ 4.Obr. 6 Zobrazená je 3-kyanpyridínová tolerancia aktivity nitrilhydratázy v bunkách v pokoji Rhadacaccus sp. FZ 4.Obr. 7 Zobrazená je nikotínamidová tolerancia aktivity nitrilhydratázy v bunkách v pokoji Rhodocaccus sp. FZ 4.Obr. 8 Zobrazený je vplyv koncentrácie acetonitrilu na aktivitu nitrilhydratázy v bunkách v pokoji Rhodococcus sp. FZ 4 pri biotransfonnácii acetonitrilu na acetamid.Obr. 9 Zobrazený je vplyv koncentrácie acetonitrilu na aktivitu nitrilhydratázy v bunkách v pokoji Rhodococcus sp. FZ 4.Obr. 10 Zobrazená je aktivita nitrilhydratázy v bunkách v pokoji Rhodocaccus sp. FZ 4 v závislosti od koncentrácie 3-kyánpyridínu.Obr. 11 Zobrazené je logaritmické vynesenie molekulových hmotnosti nitrilhydratázy a referenčných proteínov oproti príslušnej HPLC retenčnej dobe.Obr. 12 Zobrazené je logaritmické vynesenie molekulových hmotnosti podjednotiek nitrilhydratázy a referenčných proteínov oproti príslušnej hodnote SDS Page RF.Obr. 13 Zobrazená je aktivita čistenia nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ 4 v závislostí od koncentrácie 3-kyánpyridínu.Obr. 14 Zobrazená je aktivita čistenej nitrilhydratázy z Rhodacoccus sp. FZ 4 v závislosti od koncentrácie acetonitrilu.Obr. 15 Zobrazená je termická stabilita čistenia nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. F Z 4.Na stanovenie aktivity nitrilhydratázy sa inkubovala reakčná zmes pozostávajúca z 3-kyánpyridínu (1,0 M 1,0 ml), káliumfosfátového tlmivého roztoku (0,1 M, pH 7,0 0,5 ml) a bunkovej suspenzie (0,5 ml) za miešania pri 20 °C počas 5 minút. Reakcia sa skončila pridaním HCI (5 M 0,1 ml). Po filtrovaní (0,2 m ñlter) reakčnej zmesi sa množstvo vytvoreného amidu kyseliny nikotínovej stanovilo pomocou HPLC (Waters Spherisorb 5 ODS 2 (4,6 x 150 mm) KH 2 PO 4/H 3 PO 4 (10 mM pH 2,8)/acetonitril 9 1 (obj./obj.) 4 mI/min. 230 nm). Celková aktivita sa vyjadruje ako mol vytvoreného amidu kyseliny nikotínovej/(min. x m 1) a špecifická aktivita sa vyjadruje ako mol vytvoreného amidu kyseliny nikotínovej/(mín. x ml x OD 610 nm)~Izolácia kmeňa Rhadococcus sp. FZ 4 (DSM 13597)V Arch. Microbiol. 1998, 170, 85-90 sa opisuje, že kmeň Rhodocaccus sp. YH 3-3 (TPU 3453) metabolizuje 3-pyridinaloxím cez 3-kyánpyridín a amid kyseliny nikotínovej na kyselinu nikotínovú. V tomto prípade sa aktivita aldoximdehydratázy rovnako ako aktivita nitrilhydratázy a amidázy kmeňa Rhodococcus sp. YH 3-3(TPU 3453) indukovala tak rôznymi aldoximami, ako aj nitrilrni.Do obohacovacieho média podľa tabuľky 1 sa inokulovali rôzne vzorky pôd a inkubovali sa 7 až 10 dní pri 37 °C. Takto získané kultúry sa preočkovali do rovnakého média a ešte raz sa kultivovali 7 až 10 dní pri 37 °C. Táto procedúra sa trikrát opakovala. Nakoniec sa kultúry zriedili a rozložili na doštičky. Po 5-dňovej inkubácii dosiek pri 37 °C sa získali jednotlivé kolónie. Jednotlivé kolónie sa testovali na prítomnosť aktivity nitrilhydratázy podľa prikladu l. Týmto spôsobom sa izoloval kmeň Rhodococcus sp. FZ 4 (DSM 13597). Namiesto 3-pyridinaldoxímu sa môžu použiť i nitrily acetonitril, propionitril, butyronitril, nitril kyseliny krotónovej, nitril kyseliny adipovej a nitril kyseliny malónovej ako zdroj uhlíka.

MPK / Značky

MPK: C12N 1/20, C12P 13/02, C12N 9/78

Značky: amidov, mikroorganizmy, spôsob, výroby

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/26-288061-mikroorganizmy-a-sposob-vyroby-amidov.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Mikroorganizmy a spôsob výroby amidov</a>

Podobne patenty