Sekvenčne špecifická rekombinácia DNA v eukaryotických bunkách

Číslo patentu: 286034

Dátum: 27.12.2007

Autori: Christ Nicole, Lorbach Elke, Dröge Peter

Je ešte 17 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Je opísaný spôsob sekvenčne špecifickej rekombinácie DNA v eukaryotických bunkách, ktorý zahrnuje zavedenie prvej DNA sekvencie do bunky, zavedenie druhej DNA sekvencie do bunky a vykonanie sekvenčne špecifickej rekombinácie pomocou integrázy Int baktériofága lambda. Výhodne je opísaný spôsob, ktorý ďalej zahrnuje vykonanie sekvenčne špecifickej rekombinácie DNA pomocou Int a Xis faktora. Predkladaný vynález sa ďalej týka vektorov a ich použitia ako liečiv.

Text

Pozerať všetko

Predkladaný vynález sa týka metódy sekvenčne špecifickej rekombinácie DNA v eukaryotických bunkách, ktorá zahrnuje zavedenie prvej DNA sekvencie do bunky, zavedenie druhej DNA sekvencie do bunky a vykonanie sekvenčne špecifickej rekombinácie prostredníctvom baktériofága lambda integrázy Int. Výhodne uskutočnenie podľa vynálezu týkajúce sa metódy ďalej zahrnuje vykonanie sekvenčne špecifickej rekombinácie DNA prostredníctvom lnt a Xis faktora. Predkladaný vynález sa ďalej týka vektorov a ich použitia ako liečiv.Kontrolovaná manipulácia eukaryotických genómov je dôležitou metódou na pozorovanie funkcie(funkcii) špecifických génov v žijúcom organizme. Uvedená manipulácia zohráva úlohu v metódach génovej terapie v medicíne. Z tohto hľadiska je obzvlášť dôležité vytvorenie transgénnych živočíchov,zmena génov alebo génových segmentov (takzvané génové cielenie) a cielená integrácia cudzej DNA do genómu vyšších eukaryotov. V poslednom čase by mohli byť tieto technológie zdokonalené prostredníctvom charakterizácie a aplikácie sekvenčne špecifických rekombinantných systémov.Konzervatívne, sekvenčno špecifické DNA rekombinázy boli rozdelené do dvoch rodín. Členovia prvej rodiny, takzvanej integráza rodiny, katalyzujú štiepenie a spojenie DNA vlákien medzi dvoma definovanými nukleotidovými sekvenciami, ktoré v nasledujúcom texte budú uvádzané ako rekombinantné sekvencie. Rekombinantné sekvencie môžu byť bud dve rozdielne alebo jedna a tá istá molekula DNA vzniknutá pri inter- a intramolekulárnej rekombinácii. V druhom pripade výsledok reakcie závisí od príslušnej orientácie rekombinantných sekvencií navzájom. V prípade inverznej, napr. protiľahlej orientácii rekombinantných sekvencií nastáva inverzia DNA segmentov nachádzajúcich sa medzi rekombinatnými sekvenciami. V pripade priamych, napr. tandemových opakovaní rekombinantných sekvencii na DNA substráte nastáva delécia. V prípade intermolekulárnej rekombinácie, napr. ak obidve rekombinantné sekvencie sú lokalizované na dvoch rozdielnych molekulách, nastáva fúzia dvoch DNA molekúl. Kým členovia integráza rodiny zvyčajne katalyzujú obidve intra, ako aj intermolekuláme rekombinácíe, rekombinázy druhej rodiny takzvané intertázy/resolvázy sú schopne len katalýzy pri intramolekulámej rekombinácii.Rekombinázy, ktoré sú používané v súčasnosti hlavne na manipuláciu eukaryotických genómov,patria do integráza rodiny. Uvedené rekombinázy sú Cre rekombináza bakteriofága P a Flp rekombináza z kvasiniek (Müller, U. (1999) Mech. Develop., 82, pp. 3). Rekombinantnć sekvencie, ku ktorým sa viaže Cre rekombináza sú IoxP. LoxP je 34 bp dlhá nukleotidová sekvencia obsahujúca dva 13 bp dlhé invertované iiukleotidové sekvencie a 8 bp dlhý oddeľovač (spacer) ležiaci medzi invertovanými sekvenciami (Hoess, R. a kol., (1985) J. Mol. Biol., 181, pp. 351). FRT väzbove sekvencie pre Flp narastajú podobne. Ale, sú rozdielne od loxP (Kilby, J. a kol., (1993) Trends Genet., 9, pp. 413). Preto, rekombinantné sekvencie nemôžu byt nahradene inými, napr. Cre nie je schopná rekombinovať FRT sekvencie a FLP nie je schopná rekombinovat IaxP sekvencie. Obidva rekombinantnć systémy sú aktívne cez dlhé vzdialenosti, napr. DNA segment invertovaný alebo deletovaný pomocou dvoch lox P alebo FRT sekvencií môže byt niekoľko 10 000 bázových párov dlhý.Napríklad uvedenými dvoma systémami boli dosiahnuté tkanivová špecifická rekombinácia v myšom systéme, chromozomálna translokácia v rastlinách a kontrolovaná indukcia génovej expresie,prehľadný článok od Müllera, U. (1999) Mech. Develop., 82, pp. 3.) DNA polymeráza B bola vymazaná v špecifických tkanivách myši podľa Gu, H a kol., (1994) Science, 265, pp. 103. Ďalších príkladom je špecifická aktivácia DNA tumorového vírusu onkogénu SV 40 v myších šošovkách vedúca k vzniku tumoru výlučne v týchto tkanivách. Cre-loxP stratégia bola použitá okrem iného v spojitosti s indukovateľnými promótormi. Napríklad expresia rekombinázy bola regulovaná promótorom schopným vyvolať interferón, čo viedlo k delćcii špecifického génu v pečení a nie alebo len nie k jeho zníženiu v iných tkanivách Kühn, R. a kol., (1995) Science, 269, pp. 1427.Dosiaľ dva členy invertáza/resolváza rodiny boli použité na manipuláciu eukaryotických genómov. Mutant bakteriofága Mu invertáza Gin môže katalyzovať inverziu DNA fragmentu v rastlinnom protoplaste bez kofaktorov. Ale, dokázalo sa, že tento mutant je hyperkombinatívny, napriklad katalyzuje štiepenía DNA vlákna tiež pri iných než jeho pôvodných rekombinantných sekvenciách. Toto vedie ku rriimovoľným čiastočným letálnym rekombinantným prípadom v rastlinných protoplastových genómoch. B-rekombináza z Streptococcus pyogenes katalyzuje rekombináciu v myších bunkových kultúrach medzi dvoma rekombinantnýrni sekvenciami ako priame opakovania vedúce k odstrihnutiu segmentu. Ale, súčasne s deléciou bola pozorovaná inverzia, čo robí kontrolované použitie systému na manipuláciu eukaryotických genómov nevhodným.Manipulácia eukaryotických genómov s Cre a Flp rekombinázou má viaceré nevýhody. V prípade delécie, napr. rekombinácía dvoch tandemovo opakovaných loxP alebo FRT rekombinantných sekvencii V genóme je nevratnou stratou DNA segmentu V polohe medzi tandemovýrni opakovaniami. Teda, gén lokalizovaný na tomto DNA segmente sa pre bunku a organizmus trvalo stratí. Preto, rekonštrukcia originálneho stavu pre nové analýzy génovej funkcie, napr. V neskoršom vývojovom štádiu organizmu je nemožná. Neodvolateľnej strate DNA segmentu spôsobenej deléciou je možne sa vyhnúť pomocou ínverzie príslušného DNA segmentu. Gén môže byt inaktivovaný inverziou bez straty a môže byt zapojený znova V neskoršom Vývojovom štádiu alebo V dospelosti živočícha pomocou prostriedkov včasnej regulovanej expresie rekombinázy cez spätnú rekombináciu. Ale, použitie obidvoch Cre a Flp rekombináz V tejto modifikovanej metóde má nevýhodu V torri, že inverzia nemôže byt regulovaná, ak rekombinantné sekvencie nebudú pozmenené ako Výsledok rekombinácie. Teda, opakované rekombinančné prípady spôsobujú inaktiváciu príslušného génu vedúcu k inverzii príslušného DNA segmentu len V niektorých, V najlepšom prípade V 50 cieľových buniek. Existuje snaha odstrániť tento problém aspoň čiastočne pomocou konštrukcie mutantných loxP sekvencií, ktoré nemôžu byť použité na ďalšiu reakciu po jednotlivej rekombinácii. Ale, nevýhodou je špeciñckosť reakcie, napr. neexistuje následná aktivácia prostredníctvom spätnej rekombinácie po inaktivácii génu pomocou inverzie.Ďalšou nevýhodou Flp rekombinázy je jej znížená tepelná stabilita pri 37 °C lirnitujúca účinnosť rekombinantnej reakcie vo vyšších eukaryotoch, napr. myši majú telesnú teplom asi 39 °C. Preto, Flp mutanty by mali byť konštruované s vyššou teplotnou stabilitou ako divý typ rekombinázy, ale stále majú nižšiu rekombinantnú účinnosť než Cre rekombináza.Využitie sekvenčne špecifických rekombináz spočíva ďalej z hľadiska medicíny V génovej terapii,kde rekombinázy budú začleňovať požadovaný DNA segment do genómu príslušnej ľudskej cieľovej bunky stabilným a cieleným spôsobom Obidve Cre a Flp môžu katalyzovať interrnolekulámu rekombináciu. Obidve rekombinázy rekornbinujú plazrnid DNA, ktorý nesie kópiu jej príslušnej rekombinantnej sekvencie so zodpovedajúcou rekombinantnou sekvenciou, ktorá má byť vložená do eukaryotického genómu prostredníctvom homológnej rekombinácie. Ale je žiaduce, že táto reakcia je uskutočniteľná s pôvodne získanou rekombinantnou sekvenciou V eukaryotickom genóme. Ak loxP a FRT sú 34 a 54 nukleotidov dlhé, výskyt týchto rekombinanmých sekvencií ako časti genómu je štatisticky extrémne nepravdepodobný. Aj ked je prítomná rekombinantná sekvencia, nevýhoda skôr opísanej spätnej reakcie naďalej pretrváva, napr. obidve Cre a Flp rekombinázy môžu odstrihnúť Vložený DNA segment po úspešnej integrácii intramolekulárnou rekombináciou.Teda, jeden ciel predkladaného vynálezu je poskytnúť jednoduchý a regulovateľný rekombínantný systém a potrebné pracovné prostriedky. Ďalší ciel predkladaného vynálezu je poskytnutie rekombinantriého systému a potrebných pracovných prostriedkov, ktorými je možné realizovať stabilnú a cielenú integráciu požadovanej DNA sekvencie.Uvedené ciele sú dosiahnuté predmetom vynálezu charakterizovanýrn V patentových nárokoch.Vynález je vysvetlený podrobnejšie pomocou nasledujúcich obrázkov.Prehľad obrázkov na výkresochObrázok l znázorňuje schematické uskutočnenie rekombinantných reakcii, konkrétne integrácie a vystrihnutia katalyzovaných pomocou integrázy Int. Na obrázku je znázornený super špirálový plazmid DNA (zvrchu) nesúci kópiu rekombinantnej sekvencie attP. AttP obsahuje päť takzvaných ramenných väzbových miest pre Int (Pl, PZ, P 1, P 2, P 3), dve jadrové Int Väzbové miesta (C a C zreteľne označené čiernou šípkou), tri Väzbové miesta pre HF (H 1, H 2, H), dve väzbové miesta pre Xis(Xl, X 2) a takzvanú presahovú oblasť (otvorený obdĺžnik), kde aktuálne DNA vlákno zmení miesto. Partnerská sekvencia pre attP, attB je znázornená na lineárnom DNA segmente dole a obsahuje dve jadrové väzbové miesta pre Int (B a B, označené otvorenými šípkami) a presahovú oblasť. Na rekombináciu medzi attB a attP sú nevyhnutné Int a IHF, ktoré umožňujú integráciu plazrriidu do DNA segmentu nesúceho atlB. Týmto sú vytvorené dve nové hybridné rekombinantné sekvencie attL a atzR ako cieľové sekvencie na vystrihnutie. Táto reakcia si vyžaduj e Int a IHF a ďalej kofaktor Xis kódovaný pomocou fágu lambda.Obrázok 2 A schematicky znázorňuje expresné vektory integrázy a obrázok 2 B schematicky znázorňuje metódu západných odtlačkov (Western analysis). (A) Vektor pKEXInt zahmuje divý typ génu integrázy, Vektor pKEXInt-h zahrnuje gén mutantu Int-h a Vektor pKEXInt-h/218 zahmuje gén mutantu Int-h/218. Kontrolný Vektor (pKEX) nezahrnuje žiadny Int gén. Príslušné gény pre divý typ integrázy (Int) a dva mutanty (Int-h a Int-h/218) sú znázornená ako sivé obdĺžniky. Nasledujúce kódovacie oblasti signálnych sekvencií pre RNA proces garantujú zvýšenie intracelulárnej stability prí 10slušnej mRNA (bodkované obdĺžniky) a sú označované ako SV 40, t-Ag viazač a polyA signály. Expresia génov integrázy nastáva prostredníctvom ľudského gytomegalo yírusového (CMV) promótora.(B) Po zavedení príslušného vektora, ako je znázomené, do bunkových línií B 2, boli pripravené B 3 bunkové lyzáty a proteíny boli separované podľa ich molekulovej váhy V SDS. Prítomnosť Int-h proteínu bola vizualizovaná prostredníctvom polyklonálnych myších protilátok proti divému typu Int(čiary 2 a 4). Poloha Int v gély je označená šípkou.Obrázok 3 schematicky znázorňuje substrátové vektory. (A) pGFPatzB/atzP. Zobrazený je Vektor linearizovaný s ApaLI. Veľké čierne šípky označujú polohu a orientáciu dvoch rekombínantným sekvencií attB a attP, ktoré obklopujú GFP (zelený Íluorescenčný proteín) gén, ktorý je umiestnený v prevrátenej orientácii ku CMV promótoru. PA označuje polyA signál. Nový rezistentný gén, ktorý je vyjadrený prostredníctvom SV 40 promótora a umožňuje výber stabilných bunkových línií je dodatočne vnesený do vektora. Rozpoznanć miesta pre reštrikčný enzýnn Ncol sú tiež označené. Integrujúca rekombinácia medzi attB a attP vedie k inverzíi GFP génu a teda, ku jeho expresii. Malé otvorene a uzavreté šípky označujú polohu a orientáciu jednotlivých PCR primérov a sú označené ako pl až p 7.(B) pGFPattL/attR. Vektor je indenticky s pGFPaatB/attP, ale, zahmuje atzL a attR namiesto attB a atzP. GFP gén sa nachádza v 3-5 orientácii ku CMV promótoru. Vyšrafované políčko označuje polohu vzorky, ktorá bola použitá na metódu južných odtlačkov (Southern analysis).Obrázok 4 A až D znázorňuje schematicky detekciu integrujúcej rekombinácie v bunkových líniách pomocou prostriedkov PCT po separácií DNA molekúl v agarózových géloch (1,2 hmotn/objem), v ktorých DNA bola vizualizovaná zafarbením etidium bromidom. (A) Reverzná transkriptáza-PCR(RT-PCR). Vektory pKEX a pKEXInt-h (obrázok 2 A) boli oddelené zavedením do príslušnej bunkovej línie B 1 až B 3 pomocou elektroporácie. Riadenie od izolovanej polyA mRNA RT-PCR analýzou ukazuje očakávaný produkt s primérovým párom p 3/p 4 (obrázok 3) len v prípade, že bunky boli spracované s pKEXInt-h (línie 1,3 a 5). ö-aktínový gén od RNA bol zosilnený ako kontrola obsahu RNA. Línia M DNA rebrík línia O RT-PCR kontrola bez RNA templátu. (B, C) Genómová PCR analýza. Z príslušných bunkových línií bola izolovaná genómová DNA 72 hodín po elektroporácii a zosilnená primérovými pármi p 3/p 4 (obrázok 3) a pl/p 2 (obrázok 3). Číslovanie a označenie línií zodpovedá obrázku 4 A. (D) Delečný test. Izolovaná genómová DNA bola zosilnená primérovým párom p 5/p 6 (obrázok 3). Poloha PCR produktu (420 bp), ktorý je očakávaný po delécii namiesto inverzie je označený šípkou. Číslovanie a označenie línií zodpovedá obrázku 4 A.Obrázok SA a B schematicky znázorňuje detekciu inverzie v bunkových líniách pomocou PCR a južnej hybridizácie (Southern hybridization) po separácií DNA molekúl v agarózových géloch (1,2 hmotn./obj.). (A) PCR analýza. Frakcia genómovej DNA, ktorá bola izolovaná z bunkových línií Bl,B 2, B 3 a BL 60, ktoré boli spracované vektorrni pKEX a pKEXInt-h bola zosilnená primérovými párrni p 3/p 4 a p 5/p 7 (obrázok 3). PCR produkty prejdené späť inverziou na GFP gén katalyzované integrázou sú viditeľné V líniách 1, 3 a 5. Línia M DNA rebrík línia O PCR kontrola bez genómovej DNA. (B) Južná analýza (Southern analysis) Zvyšok frakcie analyzovanej DNA znázornený na obrázku SA bol inkubovaný reštrikčným enzýrnom NcoI, Separovaný v agarózovom géli elektroforézou podľa jeho molekulovej váhy a následne transferovaný na nitrocelulózovú membránu. GFP nesúca DNA fragrnenty bola vizualizovaná prostriedkami rádioaktívne označenej vzorky (obrázok 3 B) na detekciu rekombinácie. Línia 9 nekombinovaná pGFPattB/attP línia 10 rekombinovaná pGFPattB/atzP.Obrázok 6 A znázorňuje sekvencie nukleovej kyseliny obsahujúce attB a attH. Obrázok 6 B znázorňuje čiastočné sekvencie attP a attP. (A) Porovnanie sekvencie medzi attB a attH. lnt jadrové väzbové miesta B a B v attB sú označené prerušovane vpredu sekvencií. Int jadrové väzbové miesta H a H v attH sú označené prerušovanou čiarou vpredu sekvencií. Presah sekvencií bol charakterizovaný otvorenými obdĺžnikmi. Rozdiely v sekvencíách sú označené kolmým dvojnásobným čiarkovaním. Počet zvyškov v jadre a presah oblastí sa týka centra presahu označenćho s O a deñnovaného podľa Landy a Ross 1977), Science, 197, pp. 1147). Sekvencia od -9 do 11 je attB a atrH miesto.(B) Sekvenčne porovnanie medzi čiastočnými sekvenciarni attP a attP zodpovedajú attB a attH. Označenia sú použité ako v obrázku 6 A.Obrázok 7 schematicky znázorňuje detekciu rekombinácie medzi attH a attP na vektore pACH v E. coli po separácií v agarózovom gélí pomocou elektroforézy. Substrátový Vektor pACH bol kotransformovaný spolu s príslušnými prokaryotickýrni expresnými vektorrni na Int, Int-h alebo Inth/218 do E. colí kmeňa CSH 26 alebo CSH 26 delta IHF. Plazmid DNA bol izolovaný 36 hodin po selekcii, inkubovaný reštrikčnýrni enzýmarni HindIIl a AvaI, separovaný a vizualizovaný elektroforézou v agarózovom géli. Poloha reštrikčných fragmentov generovaná inverziou je označená ako inverz. Poloha DNA, ktorá nebola rekombinovaná je označená ako pACH. Línie 1 a 12 DNA rebrík Línie 2 a 3 Vektor expresie a DNA nerekombinovanej pACH Línie 4 až 7 DNA izolovaná z CSH 26 Línie 8 až l 1 DNA izolovaná z CSH delta IHF.Obrázok 8 schematicky znázorňuje stratégiu integrácie vektora pELl 3 do genómového lókusu attH a princíp detekčnej metody. Integračný vektor pELl 3 nesie rezistentný gén (šípka označená s hygr), gén pre Int-h (šípka označená s int-h) pod kontrolou CMV promótora a kópiu attP (otvorený obdĺžnik označený s attP/P 0 P . Int-h je exprimovaná po zavedení vektora do BL 60 buniek pomocou elektroporácie (obrázok ZB). Následne rekombináza katalyzuje interrnolekulámu rekombináciu medzi attP a chromozomálnou attH (šrafovaný obdĺžnik označený s attH/HOH) uskutočňovanú na integráciu vektora pELl 3 do genómu BL 60 buniek. Bunky, ktore sú stabilne začlenené do vektora, môžu byť vybrané a identifikovane pomocou PCR s primérovým párom attXl/B 2 (šípky označené s attXl a B 2). EcoRV a SphI sú označené reštrikčným enzýmom rozpoznávajúcim miesta príslušných reštrikčných enzýmov.Obrázok 9 schematicky znázorňuje detekciu intennolekulámej rekombinácie medzi attP (pELl 3) a attH v BL 60 bunkách. Genómová DNA bola izolovaná a zosilnená primérovým párom attXl/BZ(obrázok 8) z 31 rozdielnych bunkových populácii po elektroporácíi pELl 3 a nasledovala selekcia počas niekoľkých týždňov. PCR produkty sa separovali a vizualizovali elektroporézou v agarózovom géli. Poloha očakávanćho produktu (295 bp) je označená v gćloch šipkou. Následne boli produkty ďalej analyzované DNA sekvenovaním. Na pravom okraji je lokalizovaný DNA rebrík.Termín transformácia alebo premena, ako je používaný v tomto texte, znamená akékoľvek zavedenie sekvencie nukleovej kyseliny do bunky. Zavedenie môže byt napríklad trasfekcia alebo lipofekcia alebo môže byt uskutočňované pomocou kalciovej metódy, metódy elektrošoku alebo oocytovej injekcie. Termín transformácia alebo premena tiež znamená zavedenie vírusovej sekvencie nukleovej kyseliny obsahujúcej napr. rekombinantnć sekvencie a terapeutický gén alebo génový fragment spôsobom, ktorý je pre príslušný vírus prirodzený. Vírusové sekvencie nukleovej kyseliny nemusia byť prítomné ako nahé sekvencie nukleovej kyseliny alebo môžu byť zbalene do vírusovej proteinovej obálky. Teda, termín sa týka nie len metódy, ktorá je zvyčajne známa pod termínom transformácia alebo premena.Termín derivát, ako je používaný v tomto texte, sa týka attB a attP sekvencií a attL a attR sekvencii majúcich modifikácie vo forme jednej alebo viacerých, najviac šiestich, výhodne dvoch, troch,štyroch alebo piatich substitúcií v kontraste s prirodzene sa vyskytujúcimi rekombinantnými sekvenciarrn.Termín homológ alebo homológny, alebo podobný, ako je používaný V tomto texte s ohľadom na rekombinantné sekvencie, sa týka sekvencie nukleovej kyseliny, ktorá je identická na asi 70, výhodne na asi 80 , výhodnejšie na asi 85 , ďalej výhodnejšie na asi 90 , ďalej výhodne na asi 95 a najvýhodnejšie na asi 99 s prirodzene sa vyskytujúcimi rekombinantnými sekvenciami.Termín Vektor, ako je používaný v tomto texte, sa týka prirodzene sa vyskytujúcich alebo synteticky vytvorených konštruktov na proliferáciu, expesiu alebo transmisiu nukleových kyselín, napr. plazmidov, fagemidov, kozmidov, umelých chromozómov, bakteriofágov, vírusov alebo retro vírusov.Integráza (zvyčajne V tomto texte označované ako Int) bakteriofágu lambda patrí podobne ako Cre a Flp do integrázovej rodiny sekvenčne špecifických konzervatívnych DNA rekombináz. Int katalyzuje integmjúcu rekombináciu medzi dvoma rozdielnyrni rekombinantnými sekvenciami konkrétne attB a attP. AttB obsahuje 21 nukleotidov a bola pôvodne izolovaná z genómu E. coli Mizuuchí, M. a Mizuuchí, K. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 3220. Na druhej strane attP majúca 243 nukleotidov je dlhšia a vyskytuje sa prirodzene v genóme bakteriofága lambda Landy, A. a Ross, W.(1977) Science, 197, pp. 1147. Int rekombináza obsahuje spolu sedem väzbových miest v attP a dve v attB. Bíologická funkcia Int je sekvenčne špecifická integrácia kruhového fágovćho genómu do lókusu attB na E. cali chromozóme. Int potrebuje proteínový ko-faktor takzvaný hostiteľský faktor (zvyčajne v tomto texte označovaný ako IHF) na integrujúcu rekombináciu Kikuchi, Y. a Nash, H.(1978) J. Biol. Chem., 253, 7149. IHF je potrebná na kompletáciu funkčného rekombinantného komplexu s attP. Druhý ko-faktor pre integrujúcu reakciu je DNA negatívna super špirála (supercoiling) s attP. Na záver, rekombinácía medzi attB a attP vedie ku vzniku dvoch nových rekombinantných sekvencií, konkrétne attL a attR, ktoré slúžia ako substrátové a rozpoznávacie sekvencie pre ďalšiu rekombinantnú reakciu, excíznu reakciu. Vyčerpávajúce zhrnutie integrácie bakteriofága Iambda je možné nájsť napr. v Landy, A. (1989) Annu. Rev. Biochem., 58, pp. 913.Excízia fágového genómu z bakteriálneho genómu je tiež katalyzovaná pomocou Int rekombinázy. Na tento účel je potrebné pridať ko-faktor ku Int a IHF, ktorý je kódovaný z bakteriofága lambda. Nazýva sa excizionáza (v tomto texte je označovaná ako XIS) a má dve väzbové miesta v azzR Got

MPK / Značky

MPK: C12N 15/85, A61K 31/70, C12N 5/10, C12N 15/87, A61K 48/00, A01K 67/027

Značky: rekombinácia, špecifická, sekvenčné, eukaryotických, buňkách

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/25-286034-sekvencne-specificka-rekombinacia-dna-v-eukaryotickych-bunkach.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Sekvenčne špecifická rekombinácia DNA v eukaryotických bunkách</a>

Podobne patenty