Spôsob purifikácie dvojvláknovej DNA použitím imobilizovaného oligonukleotidu

Je ešte 16 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Je opísaný spôsob purifikácie dvojvláknovej DNA. Spôsob je založený na tom, že roztok, ktorý obsahuje požadovanú DNA v zmesi s ďalšími zložkami, prechádza cez nosič, na ktorý je kovalentne naviazaný oligonukleotid, ktorý je schopný hybridizovať so špecifickou sekvenciou prítomnou v DNA a vytvárať s ňou trojzávitnicovú štruktúru.

Text

Pozerať všetko

Predkladaný vynález sa týka spôsobu purifikácie DNA. Spôsob podľa vynálezu umožňuje rýchlu purifikáciu farrnakologicky použiteľnej dvojvláknovej DNA. Spôsob puritikácie podľa vynálezu využíva špecifickú hybridizáciu medzi sekvenciou DNA a oligonukleotidom.Doteraj ší stav technikyPostupy génovej a bunkovej terapie zaznamenávajú v súčasnej dobe pozoruhodný rozvoj. Tieto postupy však prinášajú potrebu produkcie veľkých množstiev DNA vo farmaceutickej čistote. V týchto nových liečebných postupoch liek často pozostáva zo samotnej DNA alebo ju obsahuje, a preto je nevyhnutné, aby sa táto DNA mohla vyrábať v potrebnom množstve, a aby sa izolovala a puriñkovala takým spôsobom, aby bola vhodná na použitie v humánnej medicíne.V súčasnosti sa v mnohých publikáciách preukázala možnosť injekcie plazmidovej DNA s cieľom génovej terapie alebo vakcinácie, kde sa preukázalo, že expresné vektory sa môžu prijímať rôznymi typmi buniek a gény kódované týmito plazmidmi sa môžu následne exprimovať (Ledley, 1995, Hum. Gene Ther. 6, 1129).Medzi požadované gény na génovú terapiu alebo vakcináciu patria napríklad nádorové supresorové gény,tzv. samovražedné (apoptotické) gény alebo antisense sekvencie. Môžu to byť tiež gény kódujúce proteíny,ako je napriklad alfa-fetoproteín AFP (Morinaga, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4604), enzýmy,honnóny, cytokíny, rastové faktory, ako je FGF (Jouanneau et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,2893) alebo VEGFB (Olofsson, B. et al., 1996, Proceedings 93, 576), koagulačné faktory ako faktor VIII s B deléciou (B-deleted factor VIII) (Truett et al., 1985, DNA 4, 333), apolipoproteíny, neurotransmítery, neurotrofické faktory, prírodné alebo chimérické imunoglobulíny. Tiež sú to aj reportérové gény, ako napr. gén lacZ kódujúci B-galaktozidázu z Escherichia coli.Hlavnými úlohami, ktoré je potrebné riešiť pri používaní plazmidovej DNA ako vektora na prenos génov v humánnej medicíne, sú i) výroba a ii) čistota produktu ako lieku. Vyvinuli sa technológie na produkciu plazmidových vektorov s vysokým počtom kópií v hostiteľovi Escherichia colí. Plazmidy používané v súčasnosti sú buď plazmidy odvodené od plazmidu ColEl, ako je napriklad pBR 322, pUC alebo pBluescript(Lahijani et al., 1996, Hum. Gene Thcr., 7, 1971), alebo plazmidy pCOR (Soubrier et al., 1999, Gene Therapy, 6, 1482).Druhý súbor problémov spojených s použitím plazmidovej DNA ako vektora na génovú terapiu je čistota plazmídového vektora. Súčasné metódy puriñkácie, ako je napríklad ultracentrifugácia v gradiente CsC 1 alebo chromatografia, môžu byť neúčinné pn odstraňovaní kontaminujúcich zložiek, ako je napríklad hostiteľská genómová DNA a RNA alebo proteíny. Konkrétne, hostiteľská genómová DNA, ktorej chemická štruktúra je veľmi blízka plazmidovej DNA, sa mimoriadne ťažko odstraňuje využitím klasickej chromatograñe. Typické koncentrácie hostiteľskej genómovej DNA, ktoré sú namerané v plazmidových preparátoch získaných pomocou klasickej chromatograñe, sú až 0,5 až 1 . Teda na prípravu plazrnidovej DNA ako bezpečného vektora na humánnu génovú terapiu je potrebná technológia puriñkácie, ktorá zníži obsah hostiteľskej genómovej DNA na oveľa nižšie hladiny, typicky 0,1 alebo 0,001 , alebo dokonca nižšie.Predkladaný vynález opisuje nový, jednoduchý a obzvlášť účinný spôsob puriñkácie DNA. Tento spôsob konkrétne umožňuje dosiałmuť obzvlášť vysokú čistotu súčasne s vysokým výťažkom. Tento spôsob podľa vynálezu je založený V podstate na špecifickej interakcií medzi sekvenciou, ktorá je vložená do DNA, ktorá má byt purifikovaná a oligonukleotidom, ktorý je zložený z prírodných alebo modifikovaných báz.Nedávno sa ukázalo, že niektoré oligonukleotidy sú schopné špecificky interagovať s veľkým (širokým) žliabkom dvojzávitnice DNA, pričom vzniká trojzávitnicová štruktúra, ktorá má za následok inhibíciu transkripcie cieľových génov (Héléne et Toulmé, Biochim. Biophys. Acta 1049 (1990) 99). Tieto oligonukleotidy selektívne rozpoznávajú dvojzávitnicu DNA v oligopurín-oligopyrimidínovej sekvencii, čo sú úseky obsahujúce oligopurínové sekvencie v jednom reťazci a oligopyrimidínové sekvencie v druhom komplementámom reťazci a tam lokálne vytvárajú trojzávitnicu. Bázy tohto tretieho reťazca (oligonukleotidu) vytvárajú vodíkové väzby (Hoogsteenove alebo reverzné Hoogsteenove väzby) s purínmi Watson-Crickových bázových párov. Použitie tohto typu interakcie na izoláciu plazmidu sa už opísalo v predchádzajúcom stave techniky. Ito et al. (PNAS 89 (1992) 495) opisali použitie biotinylovaného oligonnkleotidu schopného rozpoznávať konkrétnu sekvenciu plazmidu a vytvárať s ňou trojzávitnicu. Takto vytvorené komplexy potom prichádzajú do kontaktu s magnetickými perličkarni pokrytými streptavidínom. Interakcia medzi biotínom a streptavidínom potom umožní, aby sa plazmid izoloval pomocou magnetickej separácie perličiek a následnej elúcie. Aj tento spôsob má však niektoré nevýhody. Konkrétne potrebné sú tu dve nasledujúce špecifické interakcie, a to prvá medzi oligonukleotidom a plazmidom a druhá medzi biotinylovaným komplexom a magnetickými perličkami pokrytými streptavidínom. A taktiež môže byť konečný roztok kontaminovaný biotínylovanýmí oligonukleotidrni, ktoré však nesmú byť prítomné vo farmaceutickej kompozícii.Predkladaný vynález opisuje nový, vylepšený spôsob purifikácie DNA založený na tomto type interakcie. Spôsob podľa vynálezu využíva hlavne oligonukleotidy kovalentne naviazané na nosič. Takýto spôsob puriñkácíe je výnimočne rýchly a poskytuje aj výnimočne vysoké výťažky a stupeň čistoty. Navyše umožňuje purifikovať DNA z komplexných zmesí, ktoré obsahujú konkrétne ďalšie nukleové kyseliny, proteíny, endotoxiny (ako sú napriklad lipopolysacharídy), nukleázy a pod. Použitý nosič sa okrem toho môže ľahko recyklovať a DNA získaná spôsobom podľa vynálezu má vylepšené vlastnosti z hľadiska farmaceutickej bezpečnosti. Napokon, na rozdiel od stavu techniky tento spôsob podľa vynálezu predstavuje iba jediný krok.Prvý aspekt predkladaného vynálezu sa týka spôsobu purifikácie dvojvláknovej (t. j. dvojzávimicovej) DNA, ktorý je založený na tom, že sa roztok obsahujúci DNA s ďalšími zložkami filtruje cez nosič, na ktorý je kovalentne navíazaný oligonukleotid schopný vytvoriť trojzávimicu pomocou hybridizácie so špecifickou sekvenciou prítoirmou V DNA. Pritom špecifická sekvencia môže byť sekvenciou prirodzene prítomnou v trojvláknovej DNA alebo umelá sekvencia vnesená do DNA umelým spôsobom.Oligonukleotidy použité v predpokladanom vynáleze sú oligonukleotidmi, ktoré hybridizujú priamo s dvojvláknovou DNA. Tieto oligonukleotidy môžu obsahovať nasledujúce bázy- tymidín (T), ktorý je schopný vytvárať triplety (trojice) s A.T dubletmi (dvojicami bázových párov) v dvojvláknovej DNA (Rajagopal et al., Biochem. 28 (1989) 7859),- adenín (A), ktorý je schopný vytvárať triplety s A.T dubletmi v dvojvláknovej DNA,- guanín (G), ktorý je schopný vytvárať triplety s G.C dubletmi v dvojvláknovej DNA,- protonizovaný cytozín (C), ktorý je schopný vytvárať triplety s G.C dubletmi v dvojvláknovej DNA (Rajagopal et al., pozri skôr),- uracil (U), ktorý je schopný vytvárať triplety s A.U dubletmi alebo A.T dubletmi.Výhodne, oligonukleotid podľa predkladaného vynálezu obsahuje homopyrímidínovú sekvenciu, bohatú na cytozín a špecifická sekvencia prítomná v DNA je homopurín-homopyrirnidínová sekvencia. Prítomnosť cytozínov umožňuje vytvoriť trojzávitnícu, ktorá je stabilná v kyslom pH, kde sú cytozíny protonizované, a je destabilizovaná v zásaditom pH, kde sú cytozíny neutralizované. Na to, aby sa hybridizáciou mohla vytvoriť trojzávitnica, je dôležité, aby oligonukleotid a špecifická sekvencia prítomná v DNA boli komplementárne. Na to, aby sa získal čo najlepší výťažok a dosiahla sa čo najlepšia selektivíta, oligonukleotid a špecifická sekvencia, ktoré sa použili spôsobom podľa predkladaného vynálezu, sú úplne komplementáme. Môže to byť napr. konkrétne oligonukleotid poly(CTT) a špecifická sekvencia po 1 y(GAA). Ako príklad možno spomenúť oligonukleotid so sekvenciouŠ-GAGGCFTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3 (GAGG(CTT)7, sekvencía SEQ ID NO l), v ktorej bázy GAGG netvoria trojzávimicu, ale umožňujú, že oligonukleotid je vzdialený od spojovacieho ramienka. Tiež možno uviesť oligonukleotid, ktorý má sekvenciu(CTT)7 (sekvencia SEQ ID NO 26).Tieto oligonukleotidy sú schopné vytvárať trojzávitnicu so špecifickou sekvenciou, ktorá obsahuje komplementáme jednotky (GAA). Požadovanou špecifickou sekvenciou potom môže byť konkrétne úsek obsahujúci 7, 14 alebo 17 GAA jednotiek, tak ako to je opísané v príkladoch.Ďalšou sekvenciou, ktorá je zaujímavá z hľadiska predkladaného vynálezu, je špecificky nasledujúca sekvencia5-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3 (sekvencia SEQ ID NO 5).Táto sekvencia vytvára trojzávitnicu s oligonukleotidrni SĽAAGGAGAGGAGGGAGGGAA-f (sekvencia SEQ ID NO 6) aleboSĽTTGGTGTGGTGGGTGGGTT-Š (sekvencia SEQ ID NO 7).V tomto prípade sa oligonukleotid viaže k polypurínovému reťazcu v antiparalelnej orientácii. Tieto trojzávitnice sú stabilné iba v prítomnosti Mg (Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251, Beal a Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363).Tak, ako už bolo uvedené, špecifickou sekvenciou môže byť sekvencia prirozene prítomná v dvojvláknovej DNA alebo umelá sekvencia, umelo vnesená do DNA. Obzvlášť výhodný je podľa predkladaného vynálezu oligonukleotid schopný vytvoriť trojzávitnicu so sekvenciou prirozene prítomnou v dvojvláknovej DNA,naprildad v počiatku replikácie plazmidu alebo V rnarkerovom géne. V tejto súvislosti sa uskutočňovali analýzy plazmidových sekvencií a ukázalo sa, že niektore úseky týchto DNA, konkrétne v počiatku replikácie,môžu obsahovať homopurín-homopyrimidínové úseky. Syntéza oligonukleotidov, ktoré sú schopne vytvárať trojzávitnicu s týmito prírodnými homopurín-homopyrimidinovými úsekrni, výhodne umožňuje, aby sa spôsob podľa predkladaného vynálezu aplikoval na nemodífikované plazmidy, konkrétne komerčne dostupné plazmidy typu pUC, pBR 322, pSV a pod. Medzi homopurín-homopyrirnidínové sekvencie prirozene prítomné V dvojvláknovej DNA patria napríklad sekvencie obsahujúce celú alebo časť sekvencie5-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3 (sekvencia SEQ ID NO 2), 10prítomnú na počiatku replikácie X plazmídu E. colí ColEl. V tomto prípade oligonukleotid vytvárajúci trojzávitnicu má sekvenciuSĽGAAGGGCTTCCCTCTTTCC-T (sekvencia SEQ ID NO 3) a viaže sa striedavo k dvom reťazcom dvojzávitnice, tak ako to bolo opísané v Beal and Dervan (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976-4982) a Jayasena and Johnston (Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288). Tiež je možné uviesť sekvenciu5-GAAAAAGGAAGAG-3 (sekvencia SEQ ID NO 4)Dve ďalšie Cieľové sekvencie, ktoré môžu vytvárať trojzávitnicové štruktúry s konkrétnymi oligonukleotidmi, boli identiñkované v počiatkoch replikácie ColEl a pCOR. Plazmidy odvodené z ColEl obsahujú homopurínový 12-mér (ktorý má sekvenciu 5-AGAAAAAAAGGA-3, sekvencia SEQ ID NO 27), ktorý leží v protismere (upstream) od RNA-II transkriptu zúčastňujúceho sa na replikácii plazmídu (Lacatena et al.,1981, Nature, 294, 623). Táto sekvencia vytvára stabilnú trojzávitnicovú štruktúru s komplementámym 12-mérnym oligonukleotidom so sekvenciou 5-TCTTTTTTTCCT-3 (sekvencia SEQ ID NO 28). Kostra pCOR obsahuje homopurínový úsek 14 nerepetitívnych báz so sekvenciou (5-AAGAAAAAAAAGAA-3)(sekvencia SEQ ID NO 29), ktorý je lokalizovaný v AT bohatom segmente y počiatku replikónu pCOR(Levchenko et al., 1996, Nucleic Acids Res., 24, 1936). Táto sekvencia vytvára stabilnú trojzávimicovú štruktúru s komplementárnym 14-mérnym olígonukleotidom so sekvenciou 5-TTCTTTIIIIICTT-3 (sekvencia SEQ ID NO 30). Zodpovedajúce oligonukleotidy 5-TCTIITTTTCCT-3 (sekvencia SEQ ID NO 28) a 5-TTCTTTTTTTľCTT-3 (sekvencia SEQ ID NO 30) účinne a špecificky rozpoznávajú svoje zodpovedajúce komplementárne sekvencie, ktoré sú lokalizované v počiatku replikácie ColEl ori alebo pCOR (ori 7). Skutočne jednoduchá nekanonická triáda (TGC alebo CAT) môže mat za následok úplnú destabilizáciu trojzávitnicovej štruktúry.Použitie oligonukleotidu schopného vytvoriť trojzávitnicu so sekvenciou, ktorá je prítomná v počiatku replikácie alebo v markerovom géne, je obzvlášť výhodné, keďže to umožňuje pomocou rovnakého oligonukleotidu purifikovať akúkoľvek DNA obsahujúcu uvedený počiatok replikácie alebo uvedený markerový gén. Teda nie je nutné modifikovať plazmid alebo dvojvláknovú DNA tak, aby do nej bola vložená umelá špecifická sekvencia.Napriek tomu, že úplne komplementárne sekvencie sú výhodné, je zrejmé, že niektore nezhody(mismatches) medzi sekvenciou oligonukleotidu a sekvenciou pritomnou v DNA sa môžu tolerovať,ak nemajú za následok príliš veľkú stratu afinity. Ako príklad je možné uviesť sekvenciu 5-AAAAAAGGGAATAAGGG-3 (sekvencia SEQ ID NO 8) prítorrmú v géne B-laktamázy V E. calí. V tomto prípade tyrnín, ktorý prerušuje polypurínovú sekvenciu, môže byť rozpoznávaný guanínom tretieho reťazca, čím sa vytvorí GTA triplet, ktorý je stabilný, keď je obklopený dvomi tripletmi TAT (Kiessling et al.,Biochemistry, 1992, 31, 2829-2834).Podľa konkrétneho uskutočnenia vynálezu, oligonukleotidy obsahujú sekvencie (CCT), sekvencie (CT) alebo sekvencie (CTT), kde n je celé číslo l až 15, vrátane. Obzvlášť výhodné je použitie sekvencie typu(CT) alebo (CTT). Pôvodca vynálezu ukázal, že výťažok puriŕikácie bol ovplyvnený množstvom (počtom) C V oligonukleotide. Konkrétne, tak ako je to ukázané v príklade 7, výťažok purifikácie sa zvyšuje, keď oligonukleotid obsahuje menej cytozínov. Je jasné, že oligonukleotidy podľa vynálezu môžu aj kombinovaťOlígonukleotidy môžu byť podľa vynálezu prírodné (zložené z nemodifikovaných prírodných báz) alebo chemicky modifikované. Predovšetkým oligonukleotidy môžu výhodne obsahovať určité chemické modifikácie, ktoré im poskytujú rezistenciu proti nukleázam alebo zosilňujú ochranu proti nukleázam, alebo zvyšujú afmitu ku špecifickej sekvencii.Oligonukleotid podľa predkladaného vynálezu znamená tiež akýkoľvek sled nukleozidov, v ktorom bola modifikovaná kostra s cieľom, aby bol odolnejší proti nukleázam. Medzi takéto modifikované oligonukleotidy patria fosfotioátové oligonukleotidy, ktoré sú schopné vytvárať trojzávitnice s DNA (Xodo et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322-3330) a tiež oligonukleotidy obsahujúce formacetálovú alebo metylfosfonátovú kostru (Matteuccí et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, 1 13, 7767-7768). Je tiež možné použiť oligonukleotidy syntetizované z a-anomérov nukleotidov, ktoré tiež vytvárajú trojzávitnicu s DNA (Le Doan et aL, Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749-7760). Ďalšou modifikáciou kostry je fosforamidátová väzba. Napríldad N 3 -PSV internukleotidová fosforamidátová väzba, ktorú opisali Gryaznov and Chen, poskytuje oligonukleotidy, ktoré vytvárajú obzvlášť stabilnú trojzávitnicu s DNA (J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 3143-3144). K ďalším modifikáciám kostry patrí použitie ribonukleotidov, 2-O-metylribózy, fosfodiesterov a pod. (Sun and Héléne,Curr. Opinion Struct. Biol., 116, 3143-3144). V neposlednom rade možno uviesť, že kostra založená na fosfore môže byť nahradená polyarnidovou kostrou, tak ako v pripade PNA (peptidové nukleové kyseliny), ktoré môžu tiež vytvárať trojzávitnicu (Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500, Kim et al., J. Am. Chem. Soc., 1993, I IS, 6477-6481), alebo kostrou založenou na guanidíne, tak ako to je pri DNG (deoxyribonukle 10oguanidín, pozri Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101), alebo polykatiónovýrni analógmi DNA,ktoré tiež môžu vytvárať trojzávitnicu.Tymín tretieho reťazca sa môže tiež nahradiť S-brómuracílom, ktorý zvyšuje añnitu oligonukleotidu k DNA (Povsic and Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1989, lll, 3059-3061). Tretí reťazec môže tiež obsahovat iné ako prírodné bázy, ku ktorým patrí napríklad 7-deáza-2-deoxyxantozín (Milligan et al., Nucleic Acids Res.,1993, 21, 327-333), l-(2-deoxy-(B-D-ribofuranozyl)-3-metyl-5-amino-lH-pyrazolo 4,3-dpyrirr 1 ídín-7-ón(Koh and Dervan, T, Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470-1478), 8-oxoadenín, Z-aminopurín, 2-O-metylpseudoizocytidín alebo akékoľvek ďalšie modifikácie, ktoré sú odborníkom známe (kvôli prehľadu pozri Sun and Héléne, Curr. Opinion Suuct. Biol., 1993, 3, 345-356).Další typ modifikácií oligonukleotidov má za cieľ obzvlášť zlepšenie interakcie a/alebo añnity medzi oligonukleotidom a špeciñckou sekvenciou. Najvýhodnejšia modifrkácia podľa vynálezu je metylácia cytozínového oligonukleotídu (pozri príklad 5). Takto metylované oligonuldeotidy majú pozoruhodnú vlastnosť a to,že vytvárajú stabilnú trojzávitnicovú štruktúru so špeciñckou sekvenciou pri pH blízkom neutrálnemu ( 5). To teda umožňuje pracovať pri vyšších hodnotách pH, ako to umožňovali oligonukleotidy zo stavu techniky,inými slovami pri takých hodnotách pH, kde je riziko degradácie plazmídovej DNA oveľa menšie.Dlžka oligonukleotidu použitého v spôsobe podľa vynálezu je aspoň 3 bázy a výhodne 5 až 30 báz. Výhodne sa používa oligonukleotid s dĺžkou väčšou ako 10 báz. Dĺžku si môže odbomík ľahko upraviť pre každý jednotlivý prípad podľa požadovanej selektivity a stability interakcie.Oligonukleotidy sa môžu syntetizovať podľa vynálezu akoukoľvek známou technikou. Konkrétne sa môžu pripravovať pomocou syntetizátorov nukleových kyselín. Ale samozrejme sa môžu použiť akékoľvek ďalšie spôsoby známe odborníkom.Aby bola možná kovalenmá väzba na nosič, oligonukleotid je podľa vynálezu všeobecne funkcionalizoVaný. Teda je modiñkovaný tiolovou, amínovou alebo karboxylovou terrninálnou skupinou na 5 alebo 3 konci. Konkrétne pridanie tiolovej, amínovej alebo karboxylovej skupiny umožňuje napríklad kondenzáciu oligonukleotidu na nosič nesúci disulñdovú, maleimidovú, amínovú, karboxylovú, esterovú, epoxidovú,bromkyánovú alebo aldehydovú skupinu. Ku kondenzácii dochádza tým, že sa vytvárajú disulñdové, tioéterové, esterové, amidové alebo amínové väzby medzi olígonukleotidom a nosičom Samozrejme sa môže použiť akýkoľvek ďalší spôsob známy odbomíkovi, ako je napríklad použitie bifunkčného kondenzačného činidla.Navyše sa môže výhodne použiť oligonuldeotid obsahujúci sekvenciu báz zvanú ramienkď (arm) a oddeľovač (spacer , aby sa zlepšila hybridizácia s naviazaným oligonukleotidom. Použitie ramienka umožňuje, aby sa oligonukleotid naviazal vo zvolenej vzdialenosti na nosič, čo zlepšuje podmienky interakcie s DNA. Rarnienko výhodne pozostáva z lineárneho uhlíkového reťazca, obsahujúceho 1 až 18, a výhodne 6 alebo 12 skupín (CHg) a amínovú skupinu, ktorá umožňuje väzbu na kolónu (nosič). Ramienko je naviazané na fosfát oligonukleotidu alebo spacera, ktorý je zložený z báz, ktoré neinterferujú s hybridizáciou. Teda spacer môže obsahovať purínové bázy. Ako príklad možno uviesť spacer obsahujúci sekvenciu GAGG. Ramienko výhodne pozostáva z lineámeho reťazca obsahujúceho 6 alebo 12 atómov uhlíka.Na realizáciu predkladaného vynálezu sa môžu použiť rôzne typy nosičov. Môžu to byť funkcionalizované chromatografrcké nosiče, voľné alebo naplnené v kolóne, funkcionalizované povrchy plastov alebo funkcionalizované latexové perličky, magnetické alebo iné. Výhodne sa použijú chromatografrcké nosiče. Napríklad ako chromatografrcké nosiče sa môžu využiť agaróza, akrylamid alebo dextrán, ako aj ich deriváty (ako je Sephadex, Sepharose, Superose atdĺ), polyrnéry ako je napríklad poly(styrén/divinylbenzén) alebo napríklad štepená alebo neštepená silika. Chromatograñcká kolóna môže potom pracovať difúznym alebo perfúznym spôsobom.Na dosiahnutie lepšieho výťažku puriñkácie je špeciálne výhodné použitie sekvencií na plazmide, ktoré obsahujú niekoľko pozícií hybridizujúcích s oligonukleotidom. Prítomnosť niekoľkých hybridizujúcích pozícií má za následok stimuláciu interakcie medzi danou sekvenciou a oligonukleotidom, čo spôsobuje zlepšenie výťažku puriñkácíe. Teda pre oligonukleotid, ktorý obsahuje n opakovaní (repetícií) motívov (CCT), (CT) alebo (CTT), je výhodne použitie DNA sekvencíe, ktorá obsahuje aspoň n komplementámych motívov, a výhodne nl komplementámych motívov. Sekvencia nesúca nl komplementárnych motívov umožňuje dve pozície hybridizácie s oligonukleotidom. Výhodne DNA Sekvencia obsahuje až ll hybridizačných pozícií, teda n 10 komplementárnych motívov.Spôsob podľa predkladaného vynálezu sa môže použiť na puriñkáciu akéhokoľvek typu dvojvláknovej DNA. Napríklad kruhovej DNA, ako je napríklad plazmid, ktorý všeobecne nesie jeden alebo viac génov,ktoré majú terapeutický význam. Plazrnid môže tiež niesť počiatok replikácie, markerový gén a pod. Spôsob podľa vynálezu sa môže aplikovať priamo na bunkový lyzát. V tomto uskutočnení sa plazrnid, amplifikovaný transformáciou a následnou kultiváciou buniek, puriñkuje priamo po lýze buniek. Spôsob podľa vynálezu sa môže tiež aplikovať na číre lyzáty, teda na supematant získaný po neutralízácii a centrifugácii buukového lyzátu, Môže sa tiež samozrejme aplikovať na roztok prepurifrkovaný niektorou zo známych metód. Spôsob podľa predkladaného vynálezu tiež umožňuje, aby sa lineárna alebo lauhová DNA, ktorá nesie požadované

MPK / Značky

MPK: C12N 15/00, A61K 48/00, C12Q 1/00

Značky: purifikácie, imobilizovaného, použitím, spôsob, oligonukleotidu, dvojvláknovej

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/24-287662-sposob-purifikacie-dvojvlaknovej-dna-pouzitim-imobilizovaneho-oligonukleotidu.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob purifikácie dvojvláknovej DNA použitím imobilizovaného oligonukleotidu</a>

Podobne patenty