Miestne špecifická inkorporácia aminokyselín do molekúl

Číslo patentu: E 17104

Dátum: 05.03.2007

Autori: Tirrell David, Kwon Inchan, Son Soojin, Tang Yi, Wang Pin

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 Predložený vynález sa uskutočnil za vládnej podpory z grantu č. GM 62523 poskytnutéhoNIH. Vláda Spojených štátov má určité práva na tento vynález. OBLASŤ TECHNIKY0002 Proteínové inžinierstvo predstavuje účinný nástroj modifikácie štruktúmych katalytických a väzbových vlastností prirodzených proteínov a návrhu nových umelých proteínov. Proteínové inžinierstvo je založené na účinnom mechanizme rozpoznávania pre inkorporáciu mutantných aminokyselín do požadovaných proteínových sekvencií. Hoci je tento spôsob veľmi užitočný pri navrhovaní nových makromolekúl s presnou kontrolou kompozície a architektúry, jeho hlavným obmedzením je to, že mutagenéza je obmedzená na 20 prirodzene sa vyskytujúcich aminokyselín. Stále jasnejšie sa však ukazuje, že inkorporácia neprirodzených aminokyselín môže zvýšiť rozsah a vplyv spôsobov proteínového inžinierstva. i 0003 Prirodzene sa nevyskytujúce aminokyseliny nesúce rad rôznych nových funkčných skupín sa používajú na hromadnú náhradu alebo inkorporáciu konkrétnych zvyškov do rekombinantných proteínov. Biosyntetická asimilácia nekanonických aminokyselín do proteínov sa uskutoční predovšetkým pomocou kapacity natívneho syntetického aparátu a použitím analógu prirodzene sa vyskytujúcich aminokyselín (Budisa 1995, Eur. J. Biochem 230 788-796 Deming 1997, J. Macromol. Sci. Pure Appl. Chem A 34 2143-2150 Duewel 1997, Biochemistry 36 3404-3416 van Hest a Tirrell 1998, FEBS Lett 428(l-2) 68-70 Sharma a kol., 2000, FEBS Lett 467(1) 37-40). Existujú však situácie, kedy je potrebná substitúcia alebo inkorporácia prirodzene sa nevyskytujúcej aminokyseliny v jednom mieste. Tento spôsob by umožnil špecificky pripraviť proteín (veľkosť, kyslosť, nukleofilnosť, väzbové vlastnosti s vodíkom a hydrofóbne vlastnosti a pod. aminokyselín) tak, aby spĺňal konkrétnu požadovanú štruktúmu alebo ñinkčnú vlastnosť. Schopnosť miestne špecificky inkorporovať tieto analógy aminokyselín do proteínov by významne rozšírila našu schopnosť racionálne a systematicky upravovať štruktúru proteínov ako na testovanie ñmkcíe proteínov, tak aj na prípravu proteínov s novýmivlastnosťami. Napr. schopnosť syntetizovať veľké množstvo proteínov obsahujúcich ťažkéatómy by mohla umožniť určenie štruktúry proteínov a schopnosť miestne špecificky substituovať fluorofory alebo svetlom štiepiteľné skupiny do proteínov v živých bunkách by mohla poskytnúť účinné nástroje na štúdium funkcie proteínov in vivo.0004 Vnedávnych rokoch sa niekoľko laboratórií zameralo na rozšírenie počtu geneticky kódovaných aminokyselín s použitím nonsense supresorovej tRNA alebo supresorovej tRNA sposunom čítacieho rámca s cieľom inkorporovať nekanonické aminokyseliny do proteínov pri reakcii na kodón amber, resp. kodón o štyroch bázach (Bain a kol., J. Am. Chem. Soc. 111 8013, 1989 Noren a kol., Science 244 182, 1989 Furter, Protein Sci. 7 419, 1998 Wang a kol.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100 56, 2003 Hohsaka a kol., FEBS Lett. 344 171 1994 Kowal a Oliver, Nucleic Acids Res. 25 4685, 1997). Týmito spôsobmi sa vnášajú nekanonické aminokyseliny do kodónových polôh, ktoré normálne ukončujú syntézu natívneho peptidu (napr. stop kodónu alebo mutácie čítacieho rámca). Tieto spôsoby boli úspešné pri inzercii nových aminokyselín do jedného miesta. Avšak ích použitie na viacmiestne polohovo špecifickú (oproti špecifickej pre jeden zvyšok) substitúciu alebo inkorporáciu je obmedzené nízkou (20-60 ) účinnosťou supresie (Anderson a kol., J. Am. Chem. Soc. 124 9674, 2002 Bain a kol., Nature 356 537, 1992 Hohsaka a kol., Nucleic Acids Res. 29 3646, 2001). Toto je čiastočne dané tým,že príliš vysoká účinnost supresie stop kodónu by nepriaznivo ovplyvnila normálnu termináciu translácie niektorých necielených proteínov v organizme. Na druhej strane bude nízka účinnosť supresie pravdepodobne nedostatočná na supresiu viac ako jedného miesta s nonsense mutáciou alebo mutáciou čítacieho rámca cieľového proteínu, takže bude stále náročnejšie alebo menej praktické syntetizovať kompletný cieľový proteín inkorporáciou rastúceho počtu nekanonických aminokyselín.0005 Účinná viacmiestna inkorporácia sa dosiahla náhradou prirodzených aminokyselín v auxotrofných kmeňoch Escheríchia colí, napr. pomocou aminoacyl-tRNA syntetáz s uvoľnenou substrátovou špecificitou alebo pozmenenou editačnou schopnosťou (Wilson a Hatfield,Biochim. Biophys. Acta 781 205, 1984 Kast a Hennecke, J. Mol. Biol. 222 99, 1991 Ibba a kol., Biochemistry 33 7107, 1994 Shanna a kol., FEBS Lett. 467 37, 2000 Tang a Tirrell,Biochemistry 41 10635, 2002 Datta a kol., J. Am. Chem. Soc. 124 5652, 2002 Doring a kol.,Science 292 501, 2001). Aj keď tento spôsob poskytuje účinne viacmiestne inkorporačné analógy, jeho obmedzením je to, že nová aminokyselina musí zdieľať kodóny s jednou z prirodzených aminokyselín. Pri každej danej polohe kodónu, do ktorej je možné vnášať prirodzené aj nové aminokyseliny, je teda okrem pravdepodobnosti inkorporácie veľmi malá relatívna kontrola nad tým, ktorá aminokyselina sa bude nakoniec inkorporovať. Toto môže byťnežiaduce, pretože pri umelo pripravenom enzýme alebo proteíne môže inkorporácianekanonickej aminokyseliny do nezamýšľaného miesta nečakane narušiť funkciu proteínu, zatiaľ čo chýbajúca inkorporácia nekanonickej aminokyseliny do požadovaného miesta nedosiahne požadovaný ciel.0006 Všeobecne sú spôsoby uskutočnenia viacmiestnej substitúcie jednoduché, avšak všetky miesta zodpovedajúce konkrétnej prirodzenej aminokyseline sa nahradia v celom proteíne. Rozsah inkorporácie prirodzených a prirodzene sa nevyskytujúcich aminokyselín môže byť tiež rôzny. Navyše analógy s viacmiestnou inkorporáciou často vedú pri použití buniek k toxicite, čo sťažuje výskum mutantného proteínu vživých bunkách. Predložený vynález tieto prekážky prekonáva umožnením miestne špecifickej mutácie aminokyselín v proteínoch.0007 Niektore tu uvedené uskutočnenia poskytujú nový spôsob inkorporácie náhradných aminokyselín, vrátane prirodzene sa vyskytujúcich aminokyselín alebo neštandardných alebo nekanonických aminokyselín do proteínov, založený na degenerácii genetického kódu. Konkrétne umožňujú niektoré tu uvedené uskutočnenia vysokú vernosť polohovo špecifickej substitúcíe alebo inkorporácie prirodzene sa nevyskytujúcich aminokyselín do proteínov.0008 US 2004/0053390 (Datta a kol.) uvádza spôsoby, reagencie a počítačové nástroje na návrh prirodzene sa nevyskytujúcieh substrátových analógov pre enzýmy, obzvlášť pre návrh analógovneprirodzených aminokyselín pre aminoacyl tRNA syntetázy, ako je napr. Phe tRNA syntetáza. SÚHRN VYNÁLEZU0009 Niektoré tu uvedené uskutočnenia poskytujú kompozície zložiek použitých v aparáte na biosyntézu, ktoré zahŕňajú molekuly externých mutantov aminoacyl-tRNA syntetázy (AARS) prípadne párovanej s mo lekulami extemých mutantov aminoacyl tRNA.0010 Sú tiež poskytnuté spôsoby prípravy avýberu externých mutantov tRNA, externých mutantov aminoacyl-tRNA syntetáz a ich párov schopných inkorporovať aminokyseliny, vrátane prirodzene sa nevyskytujúcich aminokyselín, do polypeptidov alebo proteínov. Určité kompozície konkrétnych uskutočnení zahŕňajú nové extemé mutanty tRNA alebo páry extemých mutantov aminoacyl-tRNA syntetáz. Tieto nové molekuly extemých mutantov tRNA,molekuly AARS alebo páry AARS-tRNA sa môžu použiť na inkorporáciu neprirodzených aminokyselín do polypeptidu in vitro a in vivo. Ďalšie uskutočnenie predloženého vynálezu zahŕňajú výber párov externých mutantov.0011 Kompozície podľa predloženého vynálezu zahŕňajú externého mutanta aminoacyl-tRNA syntetázy, pričom tento extemý mutant tRNA syntetázy výhodne aminoacyluje extemý mutanttRNA neprirodzenú aminokyselinu, prípadne in vivo. V jednom uskutočnení je poskytnutánukleová kyselina alebo polynukleotid kódujúci externý mutant syntetázy alebo ich komplementáme sekvencie nukleovej kyseliny.0012 Niektoré uskutočnenia teda zahŕňajú kompozíciu zahŕňajúcu prvý Vektor obsahujúci polynukleotid kódujúci modifikovanú kvasinkovú aminoacyl fenylalanyl tRNA syntetázu(PheRS), pričom tento polynukleotid sa mutuje V kodónoch kódujúcich aminokyselinu v sekvenčných polohách vybraných zo skupiny pozostávajúcej z aminokyselinových sekvenčných polôh číslo (i) 412 a 415 (ii) 415 a 418 (iii) 415 a 437 (iv) 412, 415 a 437 (v) 415, 418 a 437(vi) 412, 415 a 418 a (vii) 412, 415, 418 a 437 polypeptidu kódovaného sekvenciou SEQ ID N 023 a kde uvedená modifikované syntetáza je schopná pripojiť na molekulu tRNA prirodzene sa nevyskytuj úcu aminokyselinu.0013 Aspoň jedno uskutočnenie ďalej zahŕňa druhý vektor obsahujúci polynukleotid kódujúci molekulu tRNA. Aspoň v jednom uskutočnení je týmto prvým aj druhým vektorom rovnaký vektor. V iných uskutočneniach je týmto prvým a druhým vektorom odlišný Vektor.0014 Aspoň v jednom uskutočnení je tRNA endogénna a aspoň v jednom uskutočnení je tRNA modifikované. Aspoň v jednom uskutočnení je tRNA modifikované tak, že obsahuje mutovaný antikodón, ktorý páruje bázy so zodpovedajúcim kolísavým (wobble) degenerovaným kodónom s afmitou vyššou, ako je afmita prirodzenej tRNA. V niektorých uskutočneniach sú AARS a tRNA z rovnakého alebo odlišného organizmu. Aspoň v jednom uskutočnení je prirodzene sa nevyskytujúca aminokyselina vybraná zo skupiny pozostávajúcej z azidonorleucínu, 3-(l-naftyl)alanínu, 3-(2-naiłyl)alanínu, p-etinyl-fenylalanínu, p-proparglyoxy-fenylalanínu, m-etinyl-fenylalanínu, ó-etinyl-tryptofánu, 5-etinyl-tryptofánu, kyseliny (R)-2 amino-3-(4-etinyl-lH-pyrol-B-ybpropánovej, p-brómfenylalanínu, p-idiofenylalanínu, pazidofenylalanínu, 3-(6-chlórindolyDalanínu, 3-(6-brómindolyl)alanínu, 3-(5-brómindolyl) alanínu, azidohomoalanínu a p-chlórfenylalanínu.0015 Ďalšie uskutočnenie zahŕňa polypeptid zahŕňajúci modiñkovanú kvasinkovú fenylalanyl tRNA syntetázu (PheRS), pričom táto modiñkovaná syntetáza je mutována v polohách aminokyselinovej sekvencie vybraných zo skupiny pozostávajúcej zpolôh aminokyselinovej sekvencie číslo (i) 412 a 415 (ii) 415 a 418 (iii) 415 a 437 (iv) 412, 415 a 437 (v) 415, 418 a 437 (vi) 412, 415 a 418 a (vii) 412, 415, 418 a 437 polypeptidu kódovaného sekvenciou SEQ ID N 013.0016 Určité uskutočnenia zahŕňajú translačné systém zahŕňajúce polynukleotid kódujúci modifikovanú kvasinkovú fenylalanyl tRNA syntetázu, pričom tento modiflkovaný syntetázový polynukleotid sa mutuje vjednom alebo viacerých kodónoch kódujúcich aminokyselinu vsekvenčných polohách vybraných zo skupiny pozostávajúcej z aminokyselinových sekvenčných

MPK / Značky

MPK: C12N 15/09

Značky: aminokyselin, inkorporácia, miestne, špecifická, molekúl

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/224-e17104-miestne-specificka-inkorporacia-aminokyselin-do-molekul.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Miestne špecifická inkorporácia aminokyselín do molekúl</a>

Podobne patenty