Zariadenie a spôsob ošetrenia tekutého média s použitím ultrazvuku na zabránenie rastu hyperproliferatívnych alebo infikovaných buniek

Číslo patentu: E 1765

Dátum: 04.11.2003

Autori: Hannecart Baudouin, Canivet Yves, Cordemans De Meulenaer Eric

Je ešte 14 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Vynález sa týka použitia vysokofrekvenčného, nízkoenergetického ultrazvuku na ošetrenie tekutých médií. Podľa špecifických uskutočnení je možné zariadeniami a spôsobmi podľa vynálezu indukovať významnú apoptózu buniek suspendovaných vo fyziologickej tekutine.Vystavením buniek ultrazvuku je možne bunky poškodiť. Ultrazvuk môže napríklad spôsobiť nevratné poškodenie buniek a indukovať deštruktívne modifikácie bunkovej membrány. Podľa niekoľkých zverejnených prác môže vystavenie buniek ultrazvuku vyvolať ich poškodenie následkom kavitácie vzniknutej kolapsom bublín plynu generovaných akustickými tlakovými poľami. Tiež bol navrhnutý mechanizmus, podľa ktorého kavitácia indukuje pôsobením reziduálneho peroxidu vodíka jednoreťazcové zlomy V DNA.Použitie ultrazvuku na liečenie zhubných nádorových ochorení nadobúda význam. Ultrazvuk sa používa vspojení shypertertniou asfoto-, rádio-, achemoterapiou. Omalígnych bunkách je známe, že sú na tieto kombinovane spôsoby citlivejšie než voči jednotlivým, samostatne použitým spôsobom. Účinok priameho ožiarenia (napríklad ultrazvukom, laserom, svetlom) na určité molekuly (napríklad klasické fotosenzibilizátory asonosenzibilizátory) spočíva vtvorbe vysoko aktívnych druhov kyslíka ako je singletový kyslík, superxoxidové radikály, hydroperoxidy alebo radikály mastných kyselín, ktoré môžu mať dôležitú úlohu pri liečení zhubných nádorových ochorení svoj ím selektívnym účinkom na malígne bunky.Podľa pôvodu zariadenia sa vyššie opísane terapie označujú ako PDT (fotodynamickâ terapia) alebo, pri použití ultrazvuku alebo sonoluminiscencie, ako SDT (sonodynamická terapia). U oboch terapií je nevyhnutné dodanie fotosenzibilizátora. Zatiaľ čo celkové účinky indukovane SDT aPDT sú zhľadíska životaschopnosti buniek rôzne, tak SDT (špecificky ich kavitačné aktivity vyvolané ultrazvukom) ako aj PDT generujú aktívne kyslíkové formy vedúce kredukcii intracelulárnych hladín tiolov. Vprípade PDT spoužitím ultrafialového žiarenia A (UVA) je možné indukovať apoptózu pomocných T lymfocytov sprostredkovanou tvorbou síngletového kyslíka, ale tento efekt nutne závisí na počiatočnej koncentrácii fotosenzibilizátora ana lokálnej koncentrácii kyslíka. V prípade SDT je výsledkom vysokých energií zúčastnených V tomto procese hlavným fenoménom bunková lýza, maskujúca ďalšie účinky na prežívajúce bunky.V patente US 4 971 991 autorov Umemura aspol., je uvedené použitie ultrazvuku na ošetrenie tumorových buniek, ale je založené na ultrazvuku s použitím vysokých energií a taktiež nie je vuvedenom patente opísane použitie mikrobublín. Ďalšie patenty opisujúce ultrazvuk amikrobubliny ako je patent US 5 215 680 autora DArrigo, sa opierajú o využitie kavitačných atepelných účinkov ultrazvuku pôsobiacich voči jednotlivým nádorovým bunkám, kde rozsah týchto účinkov je daný dobou a počtom ošetrení. Tento typ ošetrenia používa vysoké energie a dlhédoby pôsobenia apredovšetkým vyvoláva lýzu anekrózu buniek. Pozri Kondo, Cancer Letters l 78(1), 63-70, (2002).Opis obrázkov na pripojergLch yylcresochObr. 1 znázorňuje jedno uskutočnenie zariadenia na ošetrenie ultrazvukom podľa vynálezu.Obr. 2 znázorňuje tri pohľady na zariadenie na ošetrenie hyperprolíferatívnych buniek vsuspenzii spoužitím ultrazvuku amikrobublín. Vľavo je znázornený pohľad na zariadenie zhora, uprostred je pohľad na zariadenie spredu avpravo je pohľad na zariadenie z boku..2 Obr. 3. je stĺpcový graf znázorňujúci vplyv ošetrenia ultrazvukom na hladiny bunkového glutatiónu. Výsledky sú vyjadrené v percentách buniek, ktoré majú hladinu glutatiónu porovnateľnú s hladinou glutatiónu V neošetľćrłých bunkách. Známmené h°dn°ty znamenajú priemerne hodnoty i SEM ztroch nezávislých pokusov.Obr. 4 je stĺpcový graf znázorňujúci účinky vysokofrekvenčného ultrazvuku na aktivitu bunkovej kapsázy-3.Obr. 5 je stĺpcový graf znázorňujúci účinok expozície na účinnosť klonovania buniek K 562. Výsledky sú vyjadrené ako priemerne hodnoty i SEM z troch nezávislých pokusov.Obr. 6 je stĺpcový graf znázorňujúci podiel apoptotických buniek K 562 v percentách S hodín po l alebo 3 ošetreniach ultrazvukom. Miera apoptózy bola stanovená prietokovou cytometriou po vyfarbení Annexínom-V a výsledky sú vyjadrené ako priemerné hodnotyObr. 7 je bodový graf znázorňujúci zmeny distribúcie fosfatidylserínu v závislosti na čase a na počte po sebe idúcich ošetreniach ultrazvukom. Sú znázornená výsledky jedného reprezentačného pokusu vo forme percentuálneho podielu buniek vyfarbených Annexínom-V-FITC.Obr. 8 je stĺpcový graf znázorňujúci účinok ošetrenia ultrazvukom na apoptózu normálnych mononukleárnych buniek (MNC) a leukemických buniek (Nalm-ó, KGla, HL-60 a primárnych leukemických buniek od 5 pacientov). Výsledky sú znázornená ako priemer a SEM z S nezávislých pokusov.Apoptóza, alebo programovú smrť bunky, je normálnou zložkou vývoja azdravia mnohobunkových organizmov. Apoptóza zaisťuje homeostázu tkanív počas vývoja, obrany hostiteľa, starnutia avyskytuje sa ako reakcia na veľmi rozmanité signály zahrnujúce expozíciu v-žiarenim a ultrafralovým svetlom. Bunky umierajú v odozve na rôzne stimuly, pre apoptózu je typické ich umíeranie riadeným spôsobom. Týmto sa apoptóza odlišuje od inej formy bunkovej smrti nazývanej nekróza, pri ktorej neriadená bunková smrť vedie klýze buniek, zápalovým odozvám apotenciálne vážnym zdravotným problémom. Oproti tomu apoptóza je proces, pri ktorom majú bunky aktívnu úlohu pri svojej vlastnej smrti, apreto sa často označuje ako Samovražda bunky.Prijatím špecifických signálov inštruujúcich bunky k apoptóze sa v bunke obvykle objaví viac zreteľných biochemických a morfologických zmien. Napríklad pre včasné štádia apoptózy je typická aktivácia skupiny proteínov označovaných ako kapsázy. Tieto proteíny rozrušujú alebo štiepia kľúčové bunkove substráty potrebne pre normálnu funkciu buniek Zahrnujúce štrukturálne proteíny vcytoskelete anukleárne proteíny ako sú DNA reparačne enzýmy. Kapsázy môžu tiež aktivovať ďalšie degradačné enzýmy ako sú DNA-ázy, ktoré štiepia DNA V jadre. Všeobecne je zánik bunky apoptózou charakterizovaný včasnými zmenami nukleámej membrány, kondenzáciou chromatínu afragmentáciou DNA. Tieto biochemické zmeny vedú vbunke kmorfologickým zmenám.Poznatky uvedené vtomto opise sú zamerané na zariadenia aspôsoby, ktore môžu neutralizovať hyperproliferatívne bunky prítomné vtekutom médiu (napríklad nádorové bunky),bránit ich rastu aodstraňovať ich. V špecifických uskutočneniach, spôsoby azariadenia podľa vynálezu indukujú apoptózu hyperproliferatívnych buniek obsiahnutých vsuspenzii akú tvorí fyziologická tekutina. Fyziologické tekutiny, ktoré je možne takto ošetriť zahrnujú krv, plazmu,sérum a cerebrospinálnu tekutinu, ktoré je možné odobrat a/alebo podať živočíchom zahrnujúcimVysokofrekvenčné ošetrenie ultrazvukom snízkou energiou podľa vynálezu môže indukovať vhyperproliferatínych bunkách apoptotické účinky. Tieto účinky zahrnujú napríklad vplyv na mitochondriálne membrány (pokles mitochondriálneho potenciálu), stratu asymetrie fosfatidylserínu, provokáciu oxidácie membránových lipidov (zníženie hladiny bunkového GSH),morfologické variácie, fragmentáciu DNA, stratu plazmovej membrány apodobne. Ďalej môže ultrazvukom s nízkou energiou indukovaná apoptóza zahrnovať aktiváciu kapsázy-3, proteolytickú degradáciu kapsázového subsbtrátu PARP a moduláciu pomeru bcl-2/bax v bunkách.Špecifické testy (pozri príklady) potvrdili veľmi rýchlu indukciu apoptózy s obmedzenými podielmí nekrózy.Typy zariadení, ktoré je možné použiť na realizáciu spôsob podľa vynálezu sú opísané v predbežnej patentovej prihláška US 60/423368, US patentovej prihláške 10/358445 a v patente US 6 540 922 autorov Cordemans aspol Opísané zariadenia je možné použiť na aplikáciu spôsobov ošetrenia hyperproliferatívnych buniek. Jedno špecifické uskutočnenie zariadenia Využiteľného na ošetrenie tekutého média, ako je vodné médium (napríklad fyziologické tekutiny) je znázornená na obr. 1. Vniektorých uskutočneniach obsahujú ošetrované tekutiny hyperproliferatívne bunky. V iných uskutočneniach môžu ošetrované tekutiny byť fyziologické tekutiny podozrivé zobsahu hyperproliferatívnych buniek, ako sú napríklad tekutiny odobraté na diagnostické účely. Tiež je možné ošetrovať bunky, ktoré nie sú úplne diferencované, ako sú kmeňové bunky ataktiež roztoky obsahujúce vírusy a/alebo bunky infikované vírusmi. Príklady vírusov, ktoré je možné takto ošetriť, zahrnujú napríklad HIV, HCV, HBV, hepres vírus,hantavírus, víruch chrípky a Ebola vírus.Podľa obr. 1 opísané zariadenie obsahuje komoru 2, ktorá má výhodne valcový tvar alebo obdĺžníkový prierez. V niektorých uskutočneniach môže byť komora 2 spojená so zásobníkom (nie je znázomený) obsahujúcim tekuté médium určené na ošetrenie. V iných uskutočneniach (napríklad ak je ošetrovanou tekutinou fyziologická tekutina človeka alebo zvieraťa) zariadenie podľa vynálezu zásobník neobsahuje, a zásobník je priamo pripojený k telu človeka alebo zvieraťa. Tieto uskutočnenia zahrnujú uskutočnenia, v ktorých fyziologická tekutina je odoberaná a/alebo podávané. (napríklad reinjektovaná) vpríebehu mimotelového ošetrenia ľudského alebo iného živočíšneho organizmu. Podľa vyššie uvedeného je možné živočícha, ako je človek nahradiť v akomkoľvek mieste v tomto texte výrazom zásobník.Podľa ďalších uskutočnení vynálezu je možne hyperproliferatívne bunky ošetrit v zariadeni mázornenom na obr. 2. V tomto uskutočnení sú do suspenzie 22 hyperproliferatívnych buniek obsiahnutej vkomore (alebo vaku) 20 emitované mikrobubliny 5 generované vstupnou trubicou 3 na zavádzanie vzduchu použitou taktiež ako emitor mikrobublín 3. Komora (alebo vak) 20, obsahujúca suspenziu 22, môže byť ponorená do vodného kúpeľa 24, ktorým môže byť napríklad inkubátor.V ďalších uskutočneniach komora 2 obsahuje (napríklad pozdĺž svojej steny alebo pri dne) jeden alebo viac emitorov vysokofrekvenčného ultrazvuku l, ktoré vysielajú ultrazvuk 4 do komory 2 (výhodne do stredu komory 2). V ďalších uskutočneniach môže nádoba taktiež obsahovať jeden alebo viac emitorov mikrobublín 3, ktoré emitujú plynové mikrobubliny 5 a sú usporiadané tak, aby emitovali plynové mikrobubliny 5 do ultrazvukového poľa 4 vytvoreného V komore 2.Výraz mikrobubliny použitý v tomto texte znamená plynové bubliny majúce stredný priemer menší ako 1 mm. V niektorých uskutočneniach vynálezu je tento priemer menší alebo rovný 50 m. Vešte ďalších uskutočneniach majú mikrobubliny priemer menší ako 30 m. Vniektorých uskutočneniach sú mikrobubliny zvolené zo skupiny zahrnujúcej mikrobubliny vzduchu, kyslíka a ozónu alebo ich zmesi. Na zníženie prevádzkových nákladov môže byť výhodné použiť mikrobubliny iné než ozónové, ako sú vzduchove mikrobubliny. Výhodné uskutočnenia vynálezu nie sú založené na generácii tepelného účinku na ošetrenie buniek. Zatiaľ čo v niektorých-4 uskutočneniach vynálezu môže byť použitie stabilizovaných mikrobublín na Ošetrenie buniek výhodné, vo výhodných uskutočneniach je použitie stabilizovaných mikrobublín zbytočné. Príkladom stabilizovaných mikrobublín sú mikrobubliny s lipidovou bariérou.Výraz hyperproliferatívne bunky použité v tomto texte zahrnujú bunky, ktoré sa delia,reprodukujú alebo inak proliferujú relatívne vysokou rýchlosťou a môžu zahrnovat nádorové bunky(napríklad leukemické bunky), prekancerózne bunky, tumorové bunky, bunky kostnej drene a totipopentné bunky.V niektorých uskutočneniach sa výraz tekuté médium vzťahuje na fyziologícké tekutiny, ktoré je možné človeku alebo živočíchom podávať a/alebo človeku alebo Žívočíchom odoberať. V špecifických uskutočneniach sú fyziologické tekutiny po ošetrení opäť reínjektované(napríklad pri ošetrení ex vivo). V niektorých uskutočneniach výraz fyziologické tekutiny môže zahrnovať krv, sérum, cefalorachidián, mozgomiešny mok, plazmu spodobne. Vpatente US 5 401 237 autorov Tachibana a spol., je opísaný spôsob odoberania a opätovného podania fyziologickej tekutiny.V špecifických uskutočneniach, spôsoby azariadenia podľa vynàlezu zahrnujú použitie nízkoenergetického, vysokofrekvenčného ultrazvuku na ošetrenie hyperproliferatívnych buniek. Výraz vysokofrekvenčný použitý v tomto opise zahrnuje frekvencie väčšie ako 100 kHz až do niekoľkých MHz. V určitých uskutočneniach sú použité vysoké frekvencie V rozmedzí 200 kHz a 20 MHz. V rôznych ďalších uskutočneniach môžu byť použité vysoke frekvencie ultrazvuku zvolené z rozmedzia 200 kHz až 10 MHz. Vo výhodnom uskutočnení sa použije frekvencia zvolená z rozmedzia od 200 kHz do 1,8 MHz.V rôznych uskutočneniach zariadenia podľa vynálem je emitor mikrobublín 3 emitujúci mikrobubliny 5 umiestnený vblízkosti základne 11 komory 2 (t.j. pri dne komory 2), takže mikrobubliny sa pohybujú prirodzeným stúpaním alebo zachycovaním plynu do toku tekutiny.V ďalších uskutočneniach zariadenia a spôsoby opísané v tomto opise indukujú apoptózu hyperproliferatívnych buniek. Bolo zistené, že zdravé bunky sú oveľa menej citlivé na vysokofrekvenčný ultrazvuk ako leukemické bunky. Túto diferenciu v chovaní zdravých a leukemických buniek nie je možné pripisovať diferenciám v lokalizácii endogénnych fotosenzibílizátorov, ale pravdepodobne je spôsobená modifrkáciou fundamentálneho bunkového mechanizmu ako je napríklad p 53 status, signálne dráhy arezistencia na oxidačný stres. Špeciflcky je možné indukovať apoptózu unádorových buniek (napríklad leukemických buniek), prekanceróznych buniek, tumotových buniek, buniek kostnej drene, totipotentných buniek a podobne.V špecifických uskutočneniach opísané zariadenia a spôsoby môžu produkovať radíkály,ako sú ROS (reaktívne formy kyslíka), H-, -OH a HOO-, ktoré môžu tiež tvoriť HzOz, kde molekula a/alebo radikály sú toxické voči hyperproliferatívnym bunkám a vyvolávajú ich inaktiváciu a/alebo deštrukciu. Možnými účastníkmi tohto biomechanizmu môžu byť tiež produkty lipoperoxidácie vzniknuté vplyvom oxidačného stresu vyvolaného účinkami ultrazvuku.Aj napriek tomu, že boli podané dôkazy oponujúce tvorbe singletového kyslíka počas sonodynamickej terapie, uvedené údaje sú skutočne konzistentne len s dlhou a vysokoenergetickou expozíciou ultrazvukom vedúcou kakumulácii voľných radikálov odvodených od senzibílizátora buď priamou pyrolýzou alebo reakciami s radĺkálmi H- alebo -OH vzniknutými pyrolýzou vodného rozpúšťadla.O zložkách vzniknutých s použitím spôsobov a zriadení podľa vynálezu sa predpokladá,že sú odvodené z pôsobenia vysokofrekvenčného ultrazvuku na molekulu vody s najväčšou pravdepodobnosťou poskytujúcou (najmä v prítomnosti kyslíka) nasledujúce reakcieEnergiu potrebnú na tvorbu týchto toxických zložiek je možné výhodne zredukovať,

MPK / Značky

MPK: A61K 41/00, A61L 2/02

Značky: infikovaných, hyperproliferatívnych, zabránenie, ošetrenia, zariadenie, spôsob, rastu, ultrazvuku, tekutého, použitím, buniek, media

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/22-e1765-zariadenie-a-sposob-osetrenia-tekuteho-media-s-pouzitim-ultrazvuku-na-zabranenie-rastu-hyperproliferativnych-alebo-infikovanych-buniek.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Zariadenie a spôsob ošetrenia tekutého média s použitím ultrazvuku na zabránenie rastu hyperproliferatívnych alebo infikovaných buniek</a>

Podobne patenty