Spôsob detekcie imunoglobulínov založený na alergénovom čipe

Číslo patentu: 286541

Dátum: 19.11.2008

Autori: Müller Manfred, Hiller Reinhard, Harwanegg Christian

Je ešte 14 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Predkladaný vynález sa týka spôsobu detekcie imunoglobulínu, ktorý sa viaže na alergén vo vzorke, pričom spôsob spočíva v tom, že jeden alebo viacej alergénov je imobilizovaných na (mikro)maticovom čipe, vzorka sa inkubuje s alergénmi imobilizovanými na čipe tak, že imunoglobulíny špecifické pre alergény sa naviažu na špecifické alergény a potom sa detegujú imunoglobulíny naviazané na špecifické imobilizované alergény. Vynález sa ďalej týka spôsobu in vitro diagnostiky alergií u pacientov.

Text

Pozerať všetko

Predkladaný vynález sa týka spôsobu detekcie imunoglobulínu, ktorý sa viaže na alergén vo vzorke, a taktiež spôsobu in vitro diagnostiky alergií u pacientov.Doteraj ší stav technikyAlergia je reakcia vytvárané telesným imunitným systémom na látku, ktoré by bola normálne považovaná za neškodnú. Je to práve táto reakcia, ktorá spôsobuje symptómy, ktoré sú klasiñkované ako alergické reakcie. Alergia teda nie je prejavom zlyhania imunitného systému, ale naopak jeho nadmernej aktivity. Reakcia alergickej osoby na alergén môže viesť k celému radu rozmanitých symptómov. Niektorí ľudia trpia symptómami, ako je napríklad astma, ekzćm, vyrážka, svrbenie očí, sinusitída, upchatý alebo stále vlhký nos a senná nádcha, ale môžu sa objaviť aj vážnejšie symptómy. Pri alergiách ako napriklad alergiách na jedy, orechy a niektoré mäkkýše, môže napríklad nastať potenciálne život ohrozujúci stav nazývaný anafylaktický šok. K tomu dôjde, ak organizmus vytvára reakciu tak silnú, že dôjde k napuchnutíu hrdla, poklesne krvný tlak a postihnutá osoba má dýchacie ťažkosti. V niektorých prípadoch môže byt tento typ reakcie aj fatálny.Výskyt alergii sa výrazne zvyšuje v rozvinutých krajinách (t. j, v Európe, Sevemej Amerike a Japonsku). Odhadujc sa, že 20 až 50 populácie je postihnutých alergiarni. Teraz je už známe, že alergie sú výsledkom nerovnováhy v kompartrnente T lymfocytov imunítriého systému. Presnejšie povedané, alergie sú sprevádzané zvýšením aktivity tzv. pomocných T lymfocytov 2 (Th 2) vzhľadom na aktivitu pomocných T lyinfocytov l (Thl), čo vedie k zvýšeniu tvorby IgE.lgE (imunoglobulin E) je prinajmenšom jedna z látok, ktoré spôsobujú alergické reakcie. IgE špecifický pre alergén nie je normálne v krvi detegovaný a tvorí sa jedine vtedy, keď je osoba senzibilizovaná určitou látkou (stane sa citlivou ná látku). Látky spôsobujúce alergie (nazývané alergény) vedú k tvorbe špecifického IgE, ktorý je unikátny a bude reagovat jedine s látkou, ktoré jeho tvorbu vyvolala. Táto reakcia medzi lgE a alergénom sa modelovo znázorňuje ako zámok a kľúč. Keď je IgE spojený s alergénom, pôsobí na bunky tak,že sa uvoľňujú chemické zlúčeniny (napr. histamín), ktoré spôsobujú symptómy alergie. Jedna osoba môže mat Špecifické IgE pre viac ako jednu látku. Výsledky testovania na IgE sú vyjadrované ako stupeň, ktorý ukazuje, ake množstvo lgE špecifického pre testovanú látku je prítomné v krvi. Čím vyšší stupeň, tým viac je pravdepodobné, že pacient je alergický. V uplynulých desaťročiach sa alergické choroby diagnostikovali iba s použitím hrubo purifikovaných extraktov pochádzajúcich z hlavných zdrojov alergénov. Je však zrejmé, že tieto surové zmesi sú komplexné a z hľadiska zloženia značne variabilné. V dôsledku tohto diagnostický potenciál týchto extraktov je taktiež premenlivý a môže viesť aj k vzniku falošne negatívnych výsledkov. To sa pripisovalo najmä nestálosti alergénov v extraktoch. Ďalšou nevýhodou použitia takýchto extraktov pri diagnózach alergií je zlá štandardizácia komerčne dostupných produktov, pokial ide o ich alergénové zloženie. Jednotky, ktorými sa vyjadruje sila alergénu a taktiež spôsoby výpočtu, sú rôzne pre rôzne komerčné spoločnosti. V dôsledku toho môžu byť diagnostické produkty od rôznych firiem iba ťažko porovnávané.Najdôležitejšie zložky súvisiace s ochorením, t. j. hlavné alergény, boli identifikované v uplynulých desaťročiach, ale ich kvantifikácia nie je používaná ako východisko pre štandardizáciu alergénových extraktov. Monoklonálne protilátky sú teraz dostupné proti väčšine hlavných alergénov.Testy na alergie metódami podľa známeho stavu techniky nie sú jednoduchým postupom. Tieto metódy môžu byt užitočné za predpokladu, že je uskutočnené anamnéza, aby bolo možné určiť, ktoré testy by boli najvhodnejšie. Ale doteraz existuje iba veľmi málo lekársky uznávaných testov, ktoré môžu identifikovať alergie, a ako všeobecne pravidlo platí, že tieto testy sú obmedzené na klinické laboratóriá alebo špecializované centrá. Zatiaľ čo diagnóza atopie alebo alergie u kvalifikovaného praktika alebo špecialistu na alergiu môže byť relatívne ľahko uskutočnené, na potvrdenie sú často vyžadované ďalšie testy.Ďalej sú uvedené pre priklad rôzne typy testov na alergie. 1. Test podkožnou injekciou Podozrivý alergén sa inj ikuje pod povrch kože a reakcia sa pozoruje kvalifikovanou ošetrovateľkou alebolekárom. Ako sa reakcia vyvíja, vzniká zóna sčervenania, a čim silnejšia je reakcia, tým väčšia je táto zóna. Kožný test je pomeme citlivý, aj ked nie všetky alergie môžu byt identifikované týmto spôsobom.Náplasťový test môže byť užitočný v pripade kontaktnej dermatitidy. Testovacie látky sú zvyčajne aplikované na kožu pokrytú náplasťou a ponechané na mieste počas 48 hodin. Kladná reakcia vytvára malú oblasť ekzému. Rovnako ako v predchádzajúcom prípade reakcia sa pozoruje kvalifikovanou ošetrovateľkou3. Alternatívny test na alergiu Existujú mnohé alternatívy testov na alergie a bohužiaľ iba máloktore sú dostatočne presné alebo uznávané lekárrni. Tieto altematívne testy sú často klamné a veľakrát aj veľmi nákladné.Test Vega je elektrický test opisovaný ako bioenergetická regulačná technika. Prístroj meria vodivosť Wheatstonovým obvodom. Elektródy sú pripojené na akupunktúme body, alebo ich pacient drží v rukách. Rôzne roztoky sa potom umiestňujú na kovový podnos. Prístroj je potom kalibrovaný tým, že sa na podnos umiestní sklenená fľaštička obsahujúca toxickú látku. Fľaštička vyvolá zníženie elektrickej vodivosti. Ďalšie látky sú potom umíestňované na podnos a ak dávajú podobnú hodnotu, potom ide o alergickú reakciu alebo citlivosť na látku. Táto technika je veľmi rozšírená, najmä V obchodoch s tzv. zdravýnní potravinami, ale jej hodnota doteraz nebola dokázaná a neboli uskutočnené žiadne platné klinické skúšky, ktoré by podložili tieto tvrdenia.5. Test na toxícítu pre leukocyty (leukocytotoxicitu)Tento test zahŕňa zmiešanie bielych krviniek pacienta s extraktmí so špecifických jedál a potom meranie bunky (rôznymi spôsobmi), aby sa zistila nejaká forma zmeny. Tu dochádza k vysokému počtu falošne pozitívnych a falošne negatívnych reakcii a Americká Akadémia Alergie došla k uzáveru, že doteraz neexistuje žiadny dôkaz, že by tento test bol účinný pre diagnózu alergie na jedlo alebo inhalovanú látku.Ďalšou formou testovania je vlasová analýza. Vlasy môžu byť analyzovane na prítomnosť toxických kovov, ako je napríklad olovo, ortuť a kadrnium alebo nízke hladiny selénu, zinku, chrómu, mangánu a horčika. Otravy ťažkými kovmi sú dobre známe a dokumentované v kriminalístíckej vede a analýza vlasov môže skutočne indikovať expozíciu týmto kovom. Ale analýza vlasov ako prostriedok na diagnózu alergií, ani použitím metódy ako napríklad prútíkárčenie, nebola nikdy potvrdená.Vzorky potravín sú umiestnené pod jazykom alebo držané v sklenenej nádobke v ruke pacienta. Pacient je potom požiadaný, aby tlačil svojou voľnou rukou proti ruke ošetrujúcej osoby examinátora. Ak je detegovaná alergická reakcia, tak sa prejaví ako redukovaná svalová reakcia a pacient má náhle problém zdvihnúť svoju pažu. Táto technika celkom prepadne pri uskutočnení dvojitej slepej klinickej štúdie.Okrem toho existujú rôzne in vitro metódy diagnostiky alergií, kde sa deteguje prítomnost IgE alebo lgG protilátok v krvi.8. Zvyčajné metódy ako je ELISA alebo Westem blot Tieto testy sa používajú na detekciu protilátok (IgE) prítomných v sére pacienta pomocou (rekombínantných) alergénov.V tomto postupe je špecifický alergén kondenzovaný na papierovom disku a imunošpeciñcký IgE, ak je prítomný v testovanom sére (t. j. v sére od pacienta), sa bude viazať na disk, pričom následne sa uskutoční detekcia pomocou rádioaktívne značenej anti-IgE. Používajú sa rôzne hodnotiace (skórovacie) systémy porovnávajúce výsledky testu s absolútnou väzbou negatívnej kontroly. Všeobecne modifikovaný postup RASTTM je nasledovaný inkubáciou cez noc a umožňuje detekciu s vyššou citlivosťou.10. Kvantitatívne experimenty inhibície IgE založené na RASTV tomto teste je extrakt alergćnu nabodkovaný (nanesený v malých škvrnkách) na prúžkoch nitrocelulózy. Alikvóty séra sú preínkubované so zmesou špecifických rekornbinantných alergénov, a potom je táto zmes inkubovaná s nitrocelulózovýrni prúžkami. Naviazaný IgE je detegovaný pomocou protilátky antihumánnej IgE. V poslednom kroku sa vypočíta percento inhibície väzby IgE prírodnými extraktmí po preabsorpcii s rekombínantnými alergénmi.11. Stimulačný test bunkových antigénovov (CAST) Bazofilné bunky pacienta sú stimulované interleukínom-3 a alergénom a potom nasleduje meranie ELISA de novo vytvoreného a uvoľňovaného su 1 f 1 do 1 eukotriénu(SLT).12. Test UníCAP Rekombinantné alergény sú imobilizované na pevnej fáze a potom sa deteguje väzba protilátok, ktore sú prítomné V sére pacienta, na alergény.Ale všetky tieto metódy vyžadujú rrmožstvo jednotlivých experimentálnych krokov, aby bolo možné testovať väčší počet (napr. 100) rôznych alergénov. Okrem toho, uvedené testy neprejavujú dostatočne vysokú citlivosť a spoľahlivosť a sú veľmi náročné na čas. Taktiež množstvá vzoriek (napr. séra pacienta) a taktiež purifikovaných, často rckombinantných a nákladných alergénov, ktoré sú potrebné na uskutočňovanie týchto testov, sú veľké.Patent US 4 444 879 sa týka metódy a zariadenia na imunotesty na určenie celkových imunoglobulínov a IgE. Tu sú alergény extrahované a imobilizované v jamkách mikrotitračnej doštičky potiahnutej polymérom. Vzorka, ktorá má byť analyzovaná, je potom pridaná do jamiek, a je uskutočnený zvyčajný imunotest.V patente EP 0 556 745 A 1 je opísaný spôsob detekcie IgE protilátok proti pšeníčnému proteínu v telesných tekutinách, pričom extrakt pšeničného alergénu je imobilizovaný na pevnej fáze, ktorou je napríklad chromatografický alebo kapilámy materiál alebo vlákna, sklo, nylon, celulóza alebo jej deriváty vo forme perličiek, mikročastíc, listov alebo jamiek mikrotitračnej doštičky. Taktiež tu sa uskutočňuje zvyčajný imunotest na detekciu protilátok vo vzorke od pacienta.Patent US 3 720 760 sa týka spôsobu analýzy telesných tekutín na imunoglobulíny. Taktiež tu je alergén obsahujúci extrakt, ktorý je komerčne dostupný, naviazaný na vo vode nerozpustný polymćr, na ktorom je potom uskutočnený zvyčajný imunotest.Patent US 4 849 337 sa taktiež týka spôsobu identifikácie hladiny IgE špecifického pre alergén v sére pacienta tým, že sa konjuguje IgE v sére s alergénmi naviazanýini na nerozpustnom nosiči. Tu je alergénom opäť extrakt alebo alergén pochádzajúci priamo z peľu, prachu, zvierat a podTieto konvenčné imunotesty ale nie sú použiteľné na testovanie pacientov pokiaľ ide o prítomnosť alergií,pretože počet rôznych alergii presahuje mnoho stoviek alergií a stále sa zvyšuje. Čas a práca nutné na analýzu pacíentovho séra na všetky možne a taktiež vzácne alergie sú príliš vysoke a preto takéto analýzy nemôžu byt uskutočňované v laboratóriách, kde musia byť denne analyzované vzorky z niekoľkých stoviek pacientov.Cieľom predkladaného vynálezu je preto poskytnúť spôsob detekcie imunoglobulínu, ktorý sa viaže na alergén vo vzorke, takýto spôsob nemá uvedené nevýhody a môže byť uskutočňovaný v krátkom čase a iba s malým množstvom vzorky a alergénu, je veľmi spoľahlivý a citlivý a navyše, čo je najdôležitejšie, umožňuje detekciu prakticky neobmedzeného počtu alergénov v jednom jedinom teste.Ďalej predkladaný vynález poskytuje spôsob in vitro diagnózy alergií u pacienta bez uvedených nevýhod.Spôsob podľa vynálezu je charakterizovaný tým, že jeden alebo viacero alergénov sú imobilizované na čipe s niikrornaticou, na ktorom je inkubovaná vzorka s imobilizovanými alergćnmi, takže imunoglobulíny,ktoré sú špecifické pre alergény, sa viažu na špecifické alergény, a potom sú detegované imunoglobulínmi,ktoré sú naviazané na špecifické imobilizované alergény.Mikromatice (microarrays), príp. mikromaticové čipy, boli nedávno použité na celý rad postupov manipulácie s DNA, pričom tieto postupy boli už dávno používané vedeckou komunitou. Tieto čipy s mikromaticou DNA, tzv. DNA čipy, sa stali bežne dostupnými v mnohých rôznych formátoch a nakoniec viedli k podstatriej zmene spôsobov navrhovania a uskutočňovania v bežnej laboratómej praxi. In vitro DNA diagnostika je teraz menej časovo náročná a menej prácna, pretože tieto nové technológie umožňujú komplexné testy vo vysokovýkonnom a vysokokapacitnom formáte (high-throughput). V dôsledku toho aj v oblasti proteomického výskumu boli klasicke substráty pevnej fázy, ako napríklad mikrotitračné doštičky, membránové filtre a mikroskopické sklíčka, nahradené formátom mikrornatíc s vysokou hustotou. Nová a všestranná technológia proteínových matíc nakoniec umožňuje aj hígh-throughput skríning génovej expresie a molekulárnych interakcií (Walter a kol., Curr. Opin Microbiol 2000 Jun, 3(3)298-302, Emili Cagney, Nat Biotechnol 2000 Apr, 18 (4) 393-7). Nedávno bol taktiež koncept proteínovej matice použitý na imunologické testy.Biočip je opisovaný ako čip vhodný na vysokovýkonnú (HT, hígh-throughput), mnohopočetnú analýzu s enzýmom naviazaným na imunosorbent (ELISA). Takéto biočipy môžu pozostávať napríklad z opticky plochej sklenenej doštičky obsahujúcej 96 jamiek vytvorených vložením hydrofóbnej teílónovej masky, ale sú známe a používané aj iné látky a formy biočipov. Experimenty ukazujú, že špecifická mnohopočetná detekcia proteínových antigénov usporiadaných v matici na sklenenom nosiči je uskutočniteľná. Dalšie možnosti použitia tohto nového vysokovýkonného testovacieho (HTS, high-throughput screening) formám zahrnujú priame stanovenie profilov expresie bunkových proteínov, nmohopočetne testy na detekciu infekčných agens a diagnostiku nádorov (Mendoza LG a kol., Biotechníques 1999 Oct, 27 (4)778-80).Ale pri použití týchto známych čipov s mikromaticou na testovanie proteínov sú protilátky imobilizované na mikromaticový čip. Prekvapivo sa zistilo, že je možné naviazať na mikromaticový čip nielen protilátky,ale taktiež alergény, ktoré sú antigénmi zodpovedajúcimi špecifickým protilátkam, konkretne IgE a IgE, vdanom poradí. Tento fakt je zvlášť prekvapujúci, pretože funkčné alergény majú zvláštnu sekundárnu štruktúru, ktorá môže byť modifikované, keď sú naviazané k pevnej fáze v takej vysokej hustote ako na mikromaticový čip. Takáto modifikácia štruktúry alergénu by narušila väzbu protilátka-alergén, čo by viedlo k falošne negatívnym výsledkom. Protilátky, fragment protilátok alebo peptidy sú relatívne malé a majú vysokú stabilitu, preto protilátky majú väčšiu stabilitu v roztoku v porovnaní s im zodpovedajúcimi antigénrni. Ale ked sú imobílizované na pevnej fáze dokonca aj v prípade protilátok, iba malé percento ich ostáva neporušených a účinných.Článok Haab a kol. (Genom Biologie 2000, l (6) pre-print 0001,1-000 l,22) ktorý bol prijatý 9. septembra 2000, sa týka proteínových mikromatíc na detekciu a kvantífikáciu proteínov a protilátok v roztoku. Výsledky analýz uskutočňovaných podľa tejto publikácie ukázali, je iba 50 antigćnov V matici a 20 protilátok v matici poskytlo špecifické a presné merania zodpovedajúcich alergénov.Navyše rozmanitosť možných alergénov je samozrejme omnoho vyššia ako rozmanitosť protilátok, čo sa týka spracovania proteínov, najmä irnobilizácie a značenia takejto série štrukturálne rôznorodých alergénov. Ale bolo prekvapivo ukázané, že alergény imobilizované na mikromaticový čip mali vysokú spoľahlivosť a senzitivitu pri detekcii imunoglobulínov vo vzorke.Tento spôsob dovoľuje uskutočniť test na mnoho imunoglobulinov, ktoré viažu špecifický alergćn, v jednom experímentálnom kroku, pričom test môže byt taktiež atomizovaný viac ako 100 rôznych alergénov môže byť testovaných bez toho, aby sa uskutočňovalo nmoho individuálnych experimentálnych krokov, ako ked sa uskutočňuje test v zvyčajnej mikrotitračnej fonne. Okrem toho, tento test má vysoký stupeň senzitivity a spoľahlivosti. Taktiež výsledky z testu uskutočňovaného týmto spôsobom sa môžu získať v krátkom časovom období, napr. približne za tri hodiny, čo skracuje čas potrebný na test V porovnaní so zvyčajnými testami RAST alebo ELISA.Okrem toho, mikromaticový test je vysoko reprodukovateľný, keď sa uskutočňujú opakované experimenty s čipmi obsahujúcimi vzorky od rôznych osôb, napr. s maskou podobnou rnikrotitračnej doštičke, keď každá jamka obsahuje niekoľko rôznych alergénov a vzorka jednej osoby je pridaná do jamky. Ďalej výhodou spôsobu podľa predkladaného vynálezu je skutočnosť, že veľký počet rôznych sond zaujíma relatívne malú plochu, ktorá je obsadená vysokou hustotou. Malá povrchová plocha matice umožňuje existenciu mimoriadne jednotných väzbových podmienok (teplotná regulácia, obsah solí a pod), zatial čo mimoriadne veľký počet sond Umožňuje súbežne spracovanie veľkého počtu hybridizácii. Pretože matice s vysokou hustotou obsahujú tak veľký počet sond, je možné poskytnúť súčasne viaceré kontroly, a to vrátane napríklad kontroly pre variácie alebo mutácie konkrétneho alergénu, kontroly pre celkové hybridizačné podmienky,kontroly pre podmienky prípravy vzorky a zámenu kontroly pre nešpecifickú väzbu alebo skríženú hybridízaciu.Ďalej spôsob testu podľa vynálezu vyžaduje iba minimálny zlomok látky (alergénu aj vzorky) v porovnaní so zvyčajnými testovacími systémami. To znamená, že s rovnakým množstvom východiskového materiálu je možné vyrobit orrmoho väčší počet testovacích súprav, ked sa použije mikromaticová forma, a taktiež môže byť odobraté menšie množstvo vzorky pre väčšie množstvo imunoglobulínov, ktore viažu alergény. Taktiež vďaka malému objemu sa väzba uskutoční veľmi rýchlo.Prírodné intaktné imunoglobulíny alebo protilátky sú tvorené všeobecne tetramémou molekulou v tvare Y majúcou väzbové miesta pre antigén na konci každého homého ramena. Väzbové miesto pre antigén sa skladá z variabilnej domény ťažkého reťazca spojenej s variabilnou doménou ľahkého reťazca, Konkrétne protilátkové väzbove miesto pre antigén je v podstate tvorené 3 CDR (úsekmi určujúcimi komplementaritu) variabilnej domény ťažkého reťazca (VH) a 3 CDR variabilnej domény ľahkého reťazca (VL).Všeobecne sa termín antigén týka látky schopnej vyvolať imunitnú reakciu a bežne je to taktiež látka použitá na detekciu zodpovedajúcej protilátky v jednej z mnohých in vitro a in vivo imunologických metód na demonštráciu interakcie antigén - protilátka.Podobne, termín alergćn označuje antigén, ktorý má schopnost indukovať špecifickú protilátku (t. j. IgE), a taktiež sa na ňu viazať, pričom ide o protilátku zodpovcdnú za bežne alergie. Ale táto druhá definícia nevylučuj e možnosť, že alergćny môžu taktiež indukovať reaktívne protilátky, ku ktorým patria imunoglobulíny iných tried ako IgE.Imobilizácia v kontexte s proteímni alebo peptidmi sa týka naviazania alebo napojenia proteínu/peptidu na pevný nosič zvyčajným známym spôsobom, buďto s dodatočnou spojkou (spacer) medzi pevnou fázou a alergénom alebo bez nej. Imobilizácia peptídu/proteínu na nosič je v odbore dobre známa, do rozsahu predkladanćho vynálezu spadá akýkoľvek spôsob imobilizácie, napr. kovalentnou alebo nekovalentnou väzbou,najmä hydrofóbnou interakciou, napríklad na membrány a syntetické povrchy, v danom poradí a pod.Mikromatica je matica určitých prvkov (napr. bodov alebo škvmiek) majúca hustotu jednotlivých prvkov aspoň približne ló/cmz, výhodne aspoň približne 64/cmZ, ešte výhodnejšie približne 96/cm 2 a najvýhodnejšie aspoň približne 1000/cm 2. Prvky rnikromatice majú charakteristické rozmery, napr. priemery, v rozsahu medzi približne 10 až 2000 m, výhodne približne 50 až 500 m, ešte výhodnejšie približne 150 až 250 m, a sú oddelené od iných prvkov v rnatici približne rovnakými vzdialenosťami. Preto mikromatica

MPK / Značky

MPK: G01N 33/68

Značky: čipe, detekcie, imunoglobulínov, založený, alergénovom, spôsob

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/22-286541-sposob-detekcie-imunoglobulinov-zalozeny-na-alergenovom-cipe.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob detekcie imunoglobulínov založený na alergénovom čipe</a>

Podobne patenty