Použitie protilátkovej molekuly, ktorá sa viaže na aminokyselinovú sekvenciu WFGNRWHEGYR, na výrobu liečiva na liečenie karcinómov skvamóznych buniek

Je ešte 14 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Je opísané použitie protilátkovej molekuly, ktorá sa viaže na aminokyselinovú sekvenciu WFGNRWHEGYR na výrobu liečiva na liečenie karcinómov dlaždicového epitelu, ktorý je založený na väzbe molekuly protilátky na epitop, ktorý je kódovaný variabilným exónom v6 génu CD44. Vo výhodnom uskutočnení sa v uvedenom spôsobe použije v6-špecifická protilátková molekula, najmä monoklonálna protilátka BIWA-1 (VFF-18).

Text

Pozerať všetko

Vynález sa týka použitia protilátkovej molekuly, ktorá sa viaže na aminokyselinovú sekvenciu WFGNRWHEGYR na výrobu liečiva na liečenie karcinómov skvamóznych buniek, ktorý je založený na väzbe molekuly protilátky na epitop, ktorý je kódovaný variabilným exónom V 6 génu CD 44.Nedávno sa preukázalo, že expresia variantov povrchových glykoproteínov CD 44 je potrebná a postačujúca, aby sa vyvolalo takzvané spontánne metastázovanie nielen V nemetastázovanej bunkovej línii adenokarcinómu potkana,ale aj v nemetastázovanej fibrosarkómovej bunkovej línii potkana (Günthert et al., 1991). Kým najmenšia izoforma CD 44, štandardná fomia CD 44, je všeobecne exprimovaná v rade rozličných tkanív vrátane epitelových buniek, určite štepné varianty CD 44 (CD 44 v) sú exprimované iba jednou podskupinou epitelových buniek. Uvedené izoformy CD 44 sa vytvoria altemativnym štepením tak, že sekvencíe 10 exónov (v 1 až v 10) v génoch CD 44 sa úplne vystrihnú, jednako však pri vyšších variantoch môžu nastávat rôzne kombinácie (Screaton el al., 1992 Heider et al., 1993 Hofmann et all., 1991). Varianty sa rozlišujú tým, že na určitom mieste mimobunkových častí proteínov sú vložené rozdielne aminokyselinové sekvencíe. Také varianty možno dokázať v rôznych ľudských nádorových bunkách a ľudskom nádorovom tkanive. Tak sa nedávno zistila expresia variantov CD 44 v priebehu kolorektálnej karcinogenézy(heider et al., 1993). Expresia variantov CD 44 chýba v normálnom ľudskom kolónovom epiteli, a dokázateľná je iba slabá expresia v proliferovaných bunkách krýpt. V neskorších štádiách rozvoja nádoru, napríklad v adenokarcinómoch, všetky malígne odrody exprimujú varianty CD 44. Ďalej sa nedávno preukázala expresia štepných variantov CD 44 v aktivovaných lymfocytoch ako aj v neHodgkinových lymfómoch (Koopman et al., 1993).Známe sú pokusy o využití rozdielov v expresii variantných exónov génov CD 44 v nádoroch a v nonnálnych tkanivách na diagnostické a terapeuticke účely (W 0 94/02633, W 0 94/12631, W 0 95/00658, W 0 95/00851,EP 0 531 300).Expresia variantných CD 44-mo 1 ekúl v karcinómoch dlaždicového epitelu bola tiež už skúmaná. Sami et al.(1993) našiel pomocou vó-špecifickej protilátky Var 3.l úbytok v 6-expresíe v nádorových bunkách v porovnani s normálnymi bunkami. Brooks et al.(1995) dosiahol pomocou vő-špecifickej protilátky 11.9 heterogénne vyfarbenie nosohltanového karcinómu. Iba v 2/12 prípadov sa dosiahlo silne vyfarbenie, zatial čo vo väčšine prípadov sa mohol dosiahnuť iba slabý fokálny imunohistologický dôkaz.Úlohou tohto vynálezu preto bol vývoj nového spôsobu diagnózy a terapie karcinómov dlaždicového epitelu, ako aj príprava prostriedkov na uskutočnenie daného spôsobu.Podstatou vynálezu je použitie protilátkovej molekuly,ktorá sa viaže na aminokyselinovú sekvenciu WFGNRWHEGYR na výrobu liečiva na liečenie karcinómov skvamóznych buniek, ktorý je založený na väzbe molekuly protilátky na epitop, ktorý je kódovaný variabilným exónom V 6 génu CD 44. Molekuly protilátky so zodpove dajúcou špecifickosťou sú vhodne najmä ako nosič, aby selektívne dosiahli karcinóm dlaždicového epitelu in vivo.Výhodne sú take použitia, ktore sa vyznačujú použitím molekuly protilátky, ktorá rozoznáva aminokyselinovú sekvenciu QWFGNRWHEGYRQT, výhodnejšie aminokyselinové sekvencíe WFGNRWHEGYR. Výhodná je pritom najmä monoklonová protílátka BIWA-l (klon VFF -18),ktorá je odvodená z hybridómovej bunkovej línie, ktorá bola 7. 6. 1994 uložená v DSM (- Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheorder Weg lb, D - 38 124 Braunschweig, BRD) pod úložným číslom DSM ACC 2174, alebo deriváty tejto protilátky.Ďalším predmetom vynálezu je aj farmaceutický prostriedok na liečenie uvedených chorôb.Nukleová a aminokyselinová sekvencia variantných exónov v 6 génov CD 44 je známa (Screaton et. al., 1992 Tölg et al., 1993). Jestvovanie degenerovaných alebo všetkých variantov nie je z hľadiska uskutočnenia tohto vynálezu podstatné také varianty sú vo vynáleze preto výslovne zahmuté.Sekvencia exónu v 6 ľudských génov CD 44 jeQATPSSTTEETATQ rccca ACT cca AGT AGT ACA ACC can cm ACA GCT ACC CAGK E Q W F G N R W H E G Y R Q MG ona CAG rss m ce AAC Ami mo cm GAG GGA TAT orsc CAAT P R E D S H S l T G T A ACA CCC AGR GN C-AC TCC CAT FCG ACA ACA GFG ACA GCT G.Vynález sa môže uskutočniť s polyklonovými alebo s mnoklonovými protilátkami, ktoré sú špecifické pre jeden epitop, kódovaný s exónom v 6, najmä pre epitop v rozsahu aminokyselinovej sekvencíe QWFGNRWHEGYRQT, najvýhodnejšie v rozsahu aminokyselinovej sekvencíe WFGNRWHEGYR. Príprava protilátky proti známym aminokyselinovým sekvenciám sa môže vykonať spôsobmi,ktoré sú známe (Catty, 1989). Peptid s touto sekvenciou sa napríklad môže pripraviť synteticky a môže sa použiť v imunizačnom protokole ako antigén. Iným spôsobom možno prípravu uskutočniť tak, že sa pripraví fúzovaný proteín,ktorý obsahuje vyžadovanú aminokyselinovú sekvenciu,tak, že nukleová kyselina (syntetická alebo pripravená z vhodnej vzorky napríklad polymerázovou-reťazovou rekaciou(PCR, kódujúca pre uvedenú sekvenciu, sa integruje do vektora expresie a fúzovaný proteín sa exprimuje v hostiteľskom organizme. Podľa potreby čistený, fúzovaný protein sa potom môže použit ako antigén alebo ako inzert špecifickej protilátky v imunizačnom protokole, alebo - v prípade monoklonovej protilátky - môže sa hybridom, ktorý včlenenenú špecifickú protilátku exprimuje, môže sa vhodným spôsobom selektovať. Takéto spôsoby sú v rámci doterajšieho stavu techniky známe. Heider et al. (1993,199621) a Koopman et al. (1993) opísali prípravu protilátky proti variantnému epitopu z CD 44.V spôsobe podľa tohto vynálezu môžu sa jednako použiť tiež molekuly protilátky, ktoré sú odvodené of poly- alebo monoklonových protilátok, napríklad fragment Fab alebo fragmenty F(ab)2 imunoglobulínu, rekombinantne pripravená jednoreťazová protilátka (scF v), chimérová alebo humanizovaná protilátka, ako aj ine molekuly, ktoré sa špecificky viažu na epitop, ktorý je kódovaný exónom v 6. Protilátka BIWA-l (VFF-18) alebo iné protilátky, napríklad fragmenty Fab alebo F(ab)2 sa môžu získať z úplného imunoglobulinu (Kreitman et al., 1993). Popri uvedenom je odbomik v danej oblasti schopný vytvoriť molekuly rekombinantnej vó-špeciñckej protilátky. Podľa analýzy a SK 284378 B 6minokyselinovej sekvencie protilátky BlWA-l (VFF-IS) a/alebo s použitím hybridómovej bunkovej línie, ktorá túto protilátku produkuje, najmä ktorá obsahuje genetickú informáciu, môže odbomík pripraviť molekuly rekombinantnej protilátky s rovnakým idiotypom, ako je BlWA-l(VFFl 8), to znamená molekuly protilátky, ktorá má v oblasti antigćnového väzbového miesta (complementaritydetermining regions, CDR) rovnakú aminokyselinovú sekvenciu ako protilátka BIWA-l (VFF-IS). Vhodné spôsoby sú v rámci doterajšieho stavu techniky známe. Uvedené molekuly rekombinatnej protilátky môžu napríklad byť humanizovaná protilátka (Shín et al., 1989 Güssov et Seemann, 1991), bišpecifická alebo bifunkčná protílátka(Weiner er al., 1993 Goodwin, 1989 Featherstone, 1996),jednoreťazová protilátka (scFv, Johnson et Bird, 1991),úplný alebo fragmcntovaný imunoglobulín (Coloma et al.,1992 Nesbiot et al., 1992 Barbas et al., 1992), alebo pomocou chain shujjling pripravená protilátka (Winter et al., 1994). Humanizovaná protilátka sa môže pripraviť napríklad CDR-štepmí (EP 0 239 400). Môžu sa tiež modifikovať rámcové oblasti (EP 0 519 596 W 0 90 07 861). Na humanizovanie protilátok sa dnes používajú spôsoby, ako je PCR (pozri napríklad EP O 368 684 EP O 438 310 W 0 92 07 075), alebo počítačové modelovanie (pozri napríklad W 0 92 22 653). Ďalej sa môžu tiež pripraviť a použit fúzované proteíny, napríklad jednoreťazovou protilátkou/toxínom fúzovaný protein (Chaudhary et al., 1990 Friedman et al., 1993). Pod uvádzaný pojem protilátka a molekula protilátky patria všetky v tejto časti diskutované zlúčeniny bez polyklonových a monoklonových protilátok, ako aj ďalšie zlúčeniny, ktoré možno štruktúme odvodiť od imunoglobulinu a sú pripraviteľné známymi spôsobmi.Pri známom epitope (porovnaj obr, 1, obr. 4) protilátky BlWA-l (VFF-IS) je priememý odbomík V danej oblasti schopný rovnako pripraviť ekvivalentnú protilátku s rovnakou väzbovou špecifickosťou. Take protilátky sú preto rovnako zahmuté v rozsahu tohto vynálezu.Na diagnostické účely sa môžu molekuly protilátky,výhodne molekuly protilátky BIWA-l, jej fragmenty alebo molekuly rekombinantnej protilátky rovnakého idiotypu viazať s rádioaktívnymi izotopmi, ako je napriklad 1251, m 1,m 1, wmTc alebo rádioaktívnymi zlúčeninami (Larson et al., 1991 Thomas et al., 1989 Srivastava, 1988), enzýmami, ako je napriklad peroxidáza alebo alkalická fosfatáza(Johnson, 1989), alebo s molekulami biotinu (Guesdon et al., 1979). Na terapeuticke použitie sa môžu molekuly špecifickej v 6- protilátky, výhodne molekuly protilátky B 1 WA-l (VFF-18), alebo od VFF-18 odvodené molekuly protilátky, napríklad jej fragmenty alebo molekuly rekombinantnej protilátky s rovnakým idiotypom, viazať s rádioizotopmi, ako sú WY, ml, mRe, msm, 67 Cu, mBi,mBí, WLu (Quadri et al., 1993 Lenhard et al., 1985 Vriesendorp et al., 1991 Wilbur et al., 1989 Maraveyas et al., 1995, Jurcic et Scheinberg, 1994), toxinmi (Vitetta et al., 19091 Vitetta et lliorpe, 1991 Kreitman et al.,1993, Theuer et al., 1993), cytostatikmi (Schrappe et al.,1992), proliečivami (Wang e al., 1992 Senter et al.,1989), s fotoaktivovateľnými látkami (Hemming et al.,1993), s molekulou protilátky s inou špeciñckosťou, alebo s rádioaktívnymi zlúčeninami. Molekula protilátky môže byť ďalej viazaná s cytokínom alebo iným imunomodulujúcim polypeptidom, napríklad s tumorovým nekrotickým faktorom, lymfotoxinom (Reisfeld et al., 1996), alebo s interleukinom-Z (Becker et al., 1996). Molekuly protilátkysa na použitie v systémoch s cieľovaním (pretargeting systems) môžu modifikovať tiež napriklad streptavidínom alebo bíotínom (Goodwin, 1995).V diagnostických spôsoboch podľa tohto vynálezu sa môžu výhodne vyšetrovať vzorky odobrate pacientom, napríklad z bíopsií, pri ktorých je podozrenie na karcinóm dlaždicového epitelu, alebo už s existujúcou diagnózou, alebo s nádorom, pri ktorých sa vyžaduje bližšie spresnenie. Dôkaz variantných molekúl CD 44, obsahujúcich aminokyselinovú sekvenciu, kódovanú variabilným exónom v 6, sa môže vykonať pomocou protilátky na proteínovej úrovni,alebo na úrovni nukleových kyselín, pomocou špecifických sond nukleových kyselín, alebo pomocou primérov na polymerázovú - reťazcovú reakciu (PCR).Vyná 1 ez sa preto týka tiež molekúl protilátok a nukleových kyselín, ktoré sú vhodné na použitie v uvedených spôsoboch ako sondy alebo priméry, a použitia takých protilátok a nukleových kyselín na diagnózu a analýzu karcinómov dlaždicového epitelu. lmunohistochemicky s protilátkami sa napriklad môžu vyšetrovať rezy tkanív pomocou známych spôsobov. Extrakty získané zo vzoriek tkanív, alebo telové tekutiny sa ďalej môžu vyšetrovať ďalšími imunologickými spôsobmi s použitím protilátok, napríklad pijakovanim (western blots), pri enzýrnovej imunoadsorbcntovej analýze (ELISA,Catty at Raykundalia, 1989), rádioimunoanalýze (RIA,Catty et Murphy, 1989), alebo v podobných imunoanalytických spôsoboch. Vyšetrovania sa môžu vykonávať kvalitatívne, semikvantitatívne alebo ako kvantitatívne analýzy.Popri diagnostike in vitro sú molekuly protilátky so špecifickosťou podľa tohto vynálezu vhodné tiež na diagnostiku karcinómov dlaždicového epitelu in vivo. Ak bude molekula protilátky nosičom detegovateľnej značky, potom sa detekcia značky môže využívat na diagnostické účely,napríklad na zviditeľnenie nádoru in vivo (zobrazovanie Imaging), alebo napríklad pri rádiochirurgii (radioguided surgery). Pri použití rádioaktívnymi izotopmi konjugovanej protilátky na imunoscintilografiu sa napríklad získa celý rad záznamov, na základe ktorých odbomík môže vyvodiť vyžadované závery (Siccardi er al., 1989 Keenan et al.,1987 Perkins et Pimm, 1992 Colcher et al., 1987 Thompson et al., 1984).Dôkaz a/alebo kvantifikácia zvýšenej hladiny expresie variantných CD 44 epitopov v 6 môže vyústiť do diagnózy a prognózy stavu. Výhodne sa môžu pritom využiť kombinácia s ďalšími prognostickými parametrami, napríklad s určením stupňa nádoru (mit dem Tumorgrad).Molekuly protilátky so špecifickosťou podľa tohto vynálezu, prípadne viazané s cytotoxickým činidlom sa môžu výhodne použit na terapiu karcinómov dlaždicového epitelu, Použitie môže pritom byť systémové alebo topikálne,napríklad intravenózne (ako bolus alebo infúzia), intraperitoncálne, intramuskulárne, subkutánne a ine injekcie/infúzie. Protokoly podávania konjugovaných alebo nekonjugovaných protilátok (či už ako úplné imunoglobulíny,fragmenty, rekombinantně humanizované molekuly alebo iné) sú v súčasnom stave techniky známe (Mulshine et al.,1991 Larson et al., 1991 Vitetta et lhorpe, 1991 Vitetta et al., 1991 Breitz et al., 1992, 1995 Press et al., 1989 Weiner et al., 1989 Chata et al., 1989 Sears et al.,1982). Terapeutícké použitie môže byt napríklad obdobné,ako sa používajú protilátky 1.1 ASML (Seiter et al., 1993). Nemodiñkovaná monoklonová protilátka sa môže terapeuticky použit priamo, ak je pre cytotoxický účinok vhodná ako efektor, napriklad pre komplementáme-indukovanú alebo protilátkovo-indukovanú bunkovú cytotoxickosť ( Riethmüller et al., 1994). Vhodnou monoklonovou proti SK 284378 B 6látkou na uvedene použitie sú protilátka izotyp lgG 2 a myši a protilátka typu lgGl človeka. Nemodifikované protilátky sa môžu ďalej použit na indukciu vlastnej protinádorovej reakcie pacienta anti-idiotypovým mechanizmom (Baum et al. 1993 Khazaeli et al., 1994).Výhodná forma uskutočnenia terapeutického použitia záleží od toho, že sa spojí humanizovaný vó-špeciñcký imunoglobulín alebo jeho fragment F(ab)z s 9 °Y (Quadri et al., 1993 Vriesedorp et al., 1995), mi (Maraveyas et al.,1995 a, l 995 b Juweid et al., 1995 Press et al., 1995 Thomas et al., m Catty 1985, strany 230 až 239), SGRe(Breitz et al., 1992, 1995), alebo s iným vhodným rádioizotopom a použije sa na rádioimunoterapiu karcinómov dlaždicového epitelu. Napríklad sa môže spojiť protilátka BlWA-l, alebo humanizovaná verzia protilátky BlWA-l,alebo fragment F(ab)2 protilátky BIWA-l alebo humanizovanej protilátky s °°Y s použitím chelátotvomého linkera ako je ICTB-DTPA (izotiokyanátbenzyl-dietylentriaminopentaacetát), pričom sa má dosiahnut špecifická aktivita 5 až 20 mCí.mg 1, výhodne 10 mCi.mg 1 Uvedená účinná látka sa potom podáva pacientovi s antigén-pozitivnym nádorom v dávkach od 0,1 do l mCi.kg telesnej hmotnosti,výhodne 0,3 až 0,5 Mci.kgl telesnej hmotnosti. Ak je molekula protilátky viazaná s mi, môže sa pri špecifickej aktivite 2 mCLmg dávkovat napríklad podľa schémy 2 x 150 mCi, s odstupom 6 týždňov. Odbomík v tejto oblasti môže pomocou známych spôsobov stanoviť maximálne možné dávkovanie (Maraveyas et al., 1995 a, 1995 b). Ak sa má podať celkové množstvo proteínu od 2 do 5 mg, môže sa podávať vo forme rýchlej intravenóznej injekcie. Pri väčších množstvách podávaného proteínu môže byt vhodnou formou podávania infúzia. Pri podávaní monoklonových protilátok môže byt nevyhnutné, aby sa účinná látka pred podávaním zmiešala s nadbytkom (napriklad desaťnásobným molovým nadbytkom) nerádioaktímej protilátky v tomto prípade sa podávanie uskutoční lepšie vo forme intravenóznej infúzie, napríklad počas 15 minút. Použitie sa môže opakovat. Terapia sa môže kombinovat s terapiou vonkajším ožarovaním. Terapia sa ďalej môže podporiť transplantáciou kostnej drene táto je potom nevyhnutná najmä vtedy, ak sa pri terapíi dosiahla v kostnej dreni dávka 1,6 Gy.Molekuly protilátky podľa tohto vynálezu sa ďalej môžu použit tiež ex vivo na čistenie CD 34-pozitívnych základných aj priebežných bunkových preparátov (Immunopurging). Terapia ožarovaním a chemoterapia karcinómov dlaždicovćho epitelu sa môže podporiť autológnou transplantáciou kostnej drene. Pritom použité hematopoietické základne a priebežné bunkové preparáty musia byt bez nádorových buniek. Možno to dosiahnut inkubáciou s molekulami protilátok z tohto vynálezu, napríklad inkubáciou s konjugátmi protilátka-toxín (Myklebust et al., 1994 DE P 196 48 209.7).Molekuly protilátky podľa tohto vynálezu sa môžu ďalej použit vo fonne rekombinantného konštruktu, do ktorého bol vložený bunkový T-receptor T-lymfocytov. Týmto spôsobom reprogramované T-lymfocyty sa selektivnc viažu na nádorove bunky, exprimujúce antigén a vyvolávajú cytotoxický účinok preto ich možno použit v terapíi karcinómov dlaždícového epitelu (PCT/EP 96 04 631 Altenschmidt et al., 1996).Prehľad obrázkov na výkresochObr. 1 Stanovenie epitopovej špecifickosti protilátky BIWA-l väzbou na syntetický peptid, odvodený z CD 44-v 6 sekvencie človeka. Zodpovedajúci peptid CD 44-v 6 potkana bol skúšaný s protilátkou 1.1 ASML. Väzba sa určovala pomocou ELISA (enzýmovou imunoadsorbentovou analýzou), pričom sa peptid ímobilizoval na mikrotitračnej platni (porovnaj Heider et al., l 996 b, obr. 2 - nijaká väzba /- slabá väzba silná väzba.Obr. 2 Imunohistochemická analýza karcinómu dlaždicového epitelu hrtanu (a) a pečeňovej metastázy karcinómu pažeráka (b) s CD 44-v 6-špeciñckou monoklonovou protilátkou BlWA-l. V obidvoch prípadoch možno vidiet reaktivitu protilátky s membránou nádorových buniek. Pôvodné zväčšenie bolo 40 x, protivyfarbovanie hematoxylínom.Obr. 3 Porovnanie väzby antigénu rôznych CD 44-v 6 špecifických monoklonových protilátok. Väzba štyroch rôznych CD 44-v 6-špeciñckých mAb na ľudské SCC A 431-bunky sa merala pomocou ELISA. Monoklonová protilátka BIWA-l má vyššiu afinitu pre nádorové bunky ako ostatné monoklonové protilátky.Obr. 4 Podrobnejšie epitopově mapovanie mAb BIWA-l. Kompetitívnym meraním spôsobom ELISA sa merala väzba protilátky BlWA-l na rôzne prekrývajúce sa syntetické peptidy, ktorých aminokyseliny 18 až 32 CD 44 vó kódovanej oblasti sú zmenené. Minimálna väzbová sekvencia (peptid v 6(19 ~ 29) je podčiarknutá.Obr. 5 Biodistribúcia 51 - BIWA - 1 v A-431 xenotransplantovaných mláďatách myší. Je znázomená akumulácia ako 1 D. g (stredná hodnota i štandardná odchýlka) po 4, 24, 48, 120 a 168 hodinách po injekcii.lmunohistochemícky sa pomocou mAb BlWA-l (klon VFF-18) analyzovalo spolu 126 v paratine zaliatych vzoriek nádorov na expresiu CD 44-v 6. Vzorky zahíňali 31 prípadov primámych karcinómov dlaždicověho epitelu (15 prípadov z hrtanu, 16 prípadov kože), 91 prípadov metastáz lymfatických uzlín (hrtan, n 38 pľúca, n 27 pažerák, n 11 ústna dutina, n 11 tonzily, n 4) a 4 prípady metastáz pečene.Z ľudskej keratínocytovej-CDNA sa polymerázovoureťazcovou reakciou (PCR) z CD 44 v ampliñkovala úplná variantná oblast typu HPK 11 (Hofmann et al., 1991). Obidva PCR priméry 5 -CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3 v polohe 25 až 52, a ľ-TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3 V polohe 1013 až 984 variantnej LCLC 97 oblasti, ako opisuje Hofmann et al. obsahujú rozoznávacie miesto EcoRl, ktoré je nevyhnutné na to, aby sa klonoval PCR-produkt priamo do vektora pGEX-2 T (Smith et al., 1988). Výsledný konštrukt (pGEX CD 44 v HPKII, v 3 - V 10) kóduje pre fúzovaný proteín o približne 70 kD, pozostávajúci z glutatíon-S-transferázy z Schistosoma japanicum a z exónov v 3 až V 10 humánnej CD 44 (Obr. 1 Heider et al., 1993). Fúzovaný proteín bude exprimovaný v E. coli a následne añnitne čistený cez glutatiónovú agarózu (Smith et al., 1988).Samičky myši Balb/c sa potom intraperitoneálne imunízovali s afinitne vyščisteným fúzovaným proteínom podľa schémyImunizácie sa vykonávali vždy s odstupom 4 týždňov. l 4 dni po poslednej imunizácii sa zvieratá ešte tri po sebe nasledujúce dni imunizovali s lO g fúzovaného proteínu v PBS. Na nasledujúci deň sa bunky sleziny zvieraťa s vysokým titrom protilátky fúzovali s bunkami myelómu myši P 3.X 63-Ag 8.653 pomocou polyetylénglykolu 4000. Hybridómové bunky sa potom vyselektovali na mikrotitračnej platni v prostredí HAT (Köhler et Milstein, 1975 Kearney et al., 1979).Stanovenie titrov protilátok v sére, prípadne vytriedenie prestamutých hybridómov sa vykonalo pomocou ELISA. Pri tejto skúške sa na mikrotitračných platniach najprv vytvoril povlak fúzovaného proteínu (GST-CD 44 v 3-vl 0), alebo povlak iba z glutatión-S-transferázy. Následne sa inkubovali v sérii zriedení vzorky séra, respektíve vzorky prestarnutých hybridómov a stanovovala sa špecifická protilátka proti myšaciemu imunoglobulínu pomocou peroxidázy, konjugovanej s protilátkou. Hybridómy, ktoré reagujú iba s glutatión-S-transferázou, sa zvrhli. Ostávajúca protilátka sa najprv charakterizovala pomocou ELISA s doméno-špeciíickými fúzovanými proteínmi (exon v 3, exon v 5 v 6, exon v 6 v 7, exon v 8-vl 0) (Koopman et al.,1993). Jej imunohistochemická reaktivita sa skúšala na rezoch ľudskej kože.BIWA-l (VFF-l 8 prípravu a vlastnosti pozri tiež v WO 95/33 771) sa viazala iba na fúzované proteiny, ktore obsahovali domény, kódovane exónom v 6. Aby sa ďalej ohraničil epitop protilátky, použili sa pri ELISA rôzne syntetické peptidy, predstavujúce časti vó-domény (obr. l). Najsilnejšíu väzbu mal l 4 aminokyselinový peptid v 6 D. Preto epitop protilátky BIWA-l leží čiastočne alebo celkom v sekvencii QWFGNRWHEGYROT domény, ktorá je kódovaná exónom v 6. Táto sekvencia je homológna k väzbovému epitopu protilátky l.lASML, ktorá sa použila v terapeutickom modeli na potkanoch a ktorá je špecifická na CD 44 v 6 potkana (obr. l).Pred inkubáciou s primámou protilátkou sa parafínové rezy (4 m) odparafinovali v Rotíhístole (Roth, BRD) trikrát vždy po l 0 minút a potom V stúpajúcom alkoholovom rade rehydrovali. Potom sa rezy krátko opláchli destilovanou vodou a potom sa trikrát povarili v prostredí 0,0 l M tlmivého roztoku Na-citranu, vždy počas dobu l 0 minút, v mikrovlnnej rúre (Sharp, Model R-6270) pri 600 W. Po každej mikrovlnnej inkubácii sa rezy nechali 20 minút vychladnúť. Po poslednom povarení sa nosič opláchol v PBS v predinkuboval v normálnom kozom sére (10 -né v PBS). Po troch premytiach v PBS sa rezy inkubovali s primámou protilátkou (BIWA-l 5 g.ml myšací IgG (izotyp zodpovedajúci negatívnej kontrole) 5 g.mll v PBS/ l °/u BSA) počas l hodiny. Ako pozitívna kontrola sa pri farebnej reakcii použili normálne ľudské kožné rezy, keďže keratínocyty exprimujú izoformu CD 44, obsahujúcu v 3 v 10. Endogénne peroxidázy sa blokovali 0,3 -ným roztokom HZO v PBS a rezy sa inkubovali s biotinylovanou sekundárnou protilátkou (proti-myšací lgG-F(ab)2, DAKO Corp.) počas 30 minút. Na vyfarbenie sa rezy inkubovali 30 minút s chrenovou peroxidázou, ktorá bola viazaná na biotín ako streptavidínový-biotínový-peroxidázový komplex.Rezy sa potom inkubovali v 3,3-amino-9-etylkarbazolovom substráte (Sigma Immunochemjcals) počas 5 až l 0 minút, reakcia sa zastavila H 2 O a rezy sa protivyfarbili hematoxylínom. Vyhodnotenie sfarbenia sa vykonalo svetelným rnikroskopom (Axioskop, Zeiss) a sfarbenie sa vyjadrila nasledovne , silná expresia , miema expresia , slabá expresia -, nejednoznačná alebo žiadna detegovateľná expresia. Ako pozitívne sa vyhodnotili iba nádorové bunky s jasným sfarbením membrány. Percentuálny podiel pozitívnych nádorových buniek v každom reze sa určil hrubým odhadom tak, že sa bunky rozdelili do dvoch skupín fokálne pozitívne nádory (menej ako 10 nádorových buniek zreagovalo s protilátkou) a pozitívne nádory (l 0 alebo viac pozitívnych nádorových buniek). Ak reagovalo s protilátkou menej ako 80 Vo nádorových buniek z pozitívnych buniek, potom sa vyjadruje zodpovedajúci podíel v percentách.Pomocou CD 44-v 6-špecif 1 ckej monoklonovej protilátky BIWA-l sa analyzovalo 126 prípadov karcinómov dlaždicového epitelu rôzneho pôvodu. Vo všetkých okrem jednej vzorky nádoru, pozorovali sa izoformy s expresiou CD 44-v 6. Veľká časť vzoriek vykázala expresiu antigénu v 80 až 100 nádorových bunkách, vyfarbenie bolo obmedzene na membránu nádorových buniek. V tkanivách strómy, lymfocytov, svalových buniek a endotelu sa nepozorovala žiadna reakcia.Na kvantifikáciu expresie CD 44-v 6 molekúl uvedených nádorových buniek sa paralelne s nádorovými rezmi vyfarbovali rezy normálnej ľudskej kože. Normálne kožné keratínocyty exprimujú vysokú hladinu izoforiem CD 44 a počítajú sa k nim CD 44-v 6, najviac exprimujúce normálne bunky, aké boli doteraz opísané. Z toho dôvodu sa keratinocytové vyfarbenie považuje za porovnávacie a v tomto vyhodnocovacom systéme sa označuje ako silne (). Vo väčšine skúmaných vzoriek nádorov bolo sfarbenie nádorových buniek porovnateľné alebo aj silnejšie ako sfarbenie kožných keratínocytov iba v málo prípadoch bolo sfarbenie nádorov slabé (3 prípady metastázovaných lymfatických uzlín), alebo stredné (2 primáme karcínómy, 10 metastáz). Farebná reakcia bola v rezoch daných nádorov veľmi homogénna, pričom väčšina nádorových buniek rezov mala rovnakú intenzitu sfarbenia. Medzi primámymi nádormi a metastázami neboli v expresii CD 44-v 6 pozorované nijaké významné rozdiely. Podrobne zhmutie výsledkov je v tabuľke l, príklady sú znázomené na obr. 2.IRĽ- muj EZEZĺ EZEEEZ hrtan ĺ EŠĺ Ľ

MPK / Značky

MPK: G01N 33/574

Značky: ktorá, liečivá, sekvenciu, wfgnrwhegyr, skvamóznych, aminokyselinovú, viaže, liečenie, výrobu, molekuly, buniek, použitie, karcinómov, protilátkovej

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/22-284378-pouzitie-protilatkovej-molekuly-ktora-sa-viaze-na-aminokyselinovu-sekvenciu-wfgnrwhegyr-na-vyrobu-lieciva-na-liecenie-karcinomov-skvamoznych-buniek.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Použitie protilátkovej molekuly, ktorá sa viaže na aminokyselinovú sekvenciu WFGNRWHEGYR, na výrobu liečiva na liečenie karcinómov skvamóznych buniek</a>

Podobne patenty