Inžinierske systémy, spôsoby a optimalizované návodné prostriedky na sekvenčnú manipuláciu

Číslo patentu: E 18624

Dátum: 12.12.2013

Autori: Hsu Patrick, Cong Le, Ran Fei, Zhang Feng

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 Táto prihláška sa všeobecne týka systémov, spôsobov a prostriedkov používaných na kontrolu génovej expresie zahŕňajúcich zacieľovanie sekvencie, ako sú narušenie genómu alebo editácie génov, ktoré môžu využívať vektorové systémy odvodené od Zoskupených pravidelne rozmiestnených krátkych palindromatických repetícií (Clustered Regularly InterspacedPREHLÁSENIE TÝKAJÚCE SA VLÁDOU SPONZOROVANÉHO VÝSKUMU0002 Tento vynález bol dosiahnutý vďaka podpore vlády udelenej Národným ústavom zdravia (the National Institutes ofHealth), NIH Pioneer Award DPlMH 100706. Vláda má určité práva k0003 Nedávne pokroky V technikách sekvenácie genómu a analyzačných metódach významne urýchlili schopnosť katalogizovať a mapovať genetické faktory asociované so širokým rozpätím biologických funkcii a ochorení. Sú potrebné precízne technológie zacieľovania genómu, aby bolo umožnené systematické reverzné inžinierstvo kauzálnych genetických variácií umožnením selektívneho narušenia jednotlivých genetických elementov,rovnako ako aby boli umožnené pokroky v syntetickej biológii,biotechnologických a lekárskych aplikáciách. Aj keď sú na uskutočnenie cielených úprav genómu dostupné techniky editácie genómu, ako sú dizajnové zinkové prsty, efektory podobné aktivátorom transkripcie (transcription activator~likeeffectors, TALES) alebo navádzacie (homing) meganukleázy, zostáva potreba nových technológií na úpravy genómu, ktoré sú dostupné, ľahko zostaviteľné, rozšíriteľné a prispôsobiteľné nazacielenie mnohých pozícií v eukaryotickom genóme.0004 Existuje naliehavá potreba alternatívnych a robustných systémov a techník na zacieľovanie sekvencií s širokým rozsahom použitia. Tento vynález sa zameriava na túto potrebu a poskytuje s ním spojené výhody. CRISPR/Cas alebo CRISPR-Cas systém (oba termíny sú v tejto prihláške používané zameniteľne) nevyžaduje vytvorenie proteínov na mieru na zacielenie špecifických sekvencií, ale namiesto toho môže byť jediný enzým Cas naprogramovaný krátkou RNA molekulou na rozpoznanie špecifického DNA cieľa, inými slovami môže byť Cas enzým navedený na špecifický DNA cieľ pomocou uvedenej krátkej RNA molekuly. Pridanie CRISPR-Cas systému do repertoáru techník sekvenácie genómu a analyzačných metód môže významne zjednodušiť metodiku a urýchliť schopnosť katalogizovať a mapovať genetické faktory asociované so širokým rozpätím biologických funkcií a ochorení. Na účinné použitie CRISPR-Cas systému na editáciu genómu bez nežiaducich účinkov je nevyhnutné porozumieť aspektom prípravy a optimalizácie týchto nástrojov na úpravu genómov, čo sú aspekty nárokovaného vynálezu.0005 V jednom aspekte tento opis poskytuje vektorový systém obsahujúci jeden alebo viac vektorov. V niektorých uskutočneniach tento systém obsahuje a) prvý regulačný element operatívne spojený so sekvenciou párujúcou sa s tracr (tracr mate sequence) a jedným alebo viacerými inzerčnými miestami na vloženie jednej alebo viacerých riadiacich (guide) sekvencií pred sekvenciu párujúcu sa s tracr, kde, pokiaľ je exprimovaná,riadi riadiaca sekvencia sekvenčne špecifickú väzbu CRISPR komplexu na cieľovú sekvenciu v bunke, napr. eukaryotickejbunke, kde CRISPR komplex obsahuje CRISPR enzým V komplexe s 1)riadiacou sekvenciou, ktorá je hybridizovaná s cieľovou sekvenciou, a 2) sekvenciou párujúcou sa s tracr, ktorá je hybridizovaná s tracr sekvenciou a b) druhý regulačný element operatívne spojený so sekvenciou kódujúcou enzým kódujúci uvedený CRISPR enzým obsahujúci jadrovú lokalizačnú sekvenciu kde sú zložky a) a b) umiestnené na rovnakom vektore alebo na rôznych vektoroch tohto systému. V niektorých uskutočneniach zložka a) ďalej obsahuje tracr sekvenciu za sekvenciou párujúcou sa s tracr pod kontrolou prvého regulačného elementu. V niektorých uskutočneniach zložka a) ďalej obsahuje dve alebo viaceré riadiace sekvencie operatívne spojené s prvým regulačným elementom, kde, pokiaľ sú exprimované, každá z týchto dvoch alebo viacerých riadiacich sekvencií riadi sekvenčne špecifickú väzbu CRISPR komplexu na rôzne cieľové sekvencie v eukaryotickej bunke. V niektorých uskutočneniach tento systém obsahuje tracr sekvenciu pod kontrolou tretieho regulačného elementu, ako je promótor polymerázy III. V niektorých uskutočneniach vykazuje tracr sekvencia aspoň 50, 60, 70, 80, 90, 95 alebo 99 sekvenčnú komplementaritu so sekvenciou párujúcou sa s tracr,pokiaľ sú optimálne porovnané. V niektorých uskutočneniach obsahuje CRISPR komplex jednu alebo viac jadrových lokalizačných sekvencií s dostatočnou silou, aby sa dosiahla akumulácia uvedeného CRISPR komplexu v detekovateľnom množstve v jadre eukaryotickej bunky. Aj keď si neprajeme byť zviazaní nejakou teoriou, predpokladáme, že jadrová lokalizačná sekvencia nie je nevyhnutná na aktivitu CRISPR komplexu v eukaryotoch, avšak začlenenie týchto sekvencií zvyšuje aktivitu tohto systému,hlavne na zacieľovanie molekúl nukleových kyselín v jadre. V niektorých uskutočneniach je CRISPR enzýmom enzým typu II CRISPR systému. V niektorých uskutočneniach je CRISPR enzýmom Cas 9 enzým. V niektorých uskutočneniach je Cas 9 enzýmom Cas 9 z S. pneumoniae, S. pyogenes nebo S. thermophilus a môže zahŕňať mutovaný Cas 9 odvodený od týchto organizmov. Týmto enzýmom môžebyť homológ alebo ortológ Cas 9. V niektorých uskutočneniach jeCRISPR enzým kodónovo optimalizovaný na expresiu V eukaryotickej bunke. V niektorých uskutočneniach CRISPR enzým riadi rozštiepenie jedného alebo dvoch reťazcov v mieste cieľovej sekvencie. V niektorých uskutočneniach CRISPR enzýmu chýba aktivita štiepiaca DNA reťazec. V niektorých uskutočneniach je prvým regulačným elementom promótor polymerázy III. V niektorých uskutočneniach je druhým regulačným elementom promótor polymerázy II. V niektorých uskutočneniach je riadiaca sekvencia dlhá aspoň 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 nukleotidov, alebo medzi 10 a 30, alebo medzi 15 a 25, alebo medzi 15 a 20 nukleotidmi. Všeobecne, a V tomto opise, odkazuje termín Vektor na molekulu nukleovej kyseliny schopnú transportovať ďalšiu nukleovú kyselinu, ku ktorej bola pripojená. Vektory zahŕňajú okrem iného molekuly nukleovej kyseliny, ktoré sú jednoreťazcové,dvojreťazcové alebo čiastočne dvojreťazcové molekuly nukleovej kyseliny, ktoré obsahujú jeden alebo viaceré voľné konce,neobsahujú voľné konce (napr. sú cirkulárne) molekuly nukleovej kyseliny, ktoré obsahujú DNA, RNA alebo obidve a dalšie varianty polynukleotidov známe V odbore. Jedným typom vektoru je plazmid, ktorý odkazuje na cirkulárnu dvojreťazcovú DNA slučku, do ktorej môžu byť vložené ďalšie DNA segmenty, ako potreba štandardných techník molekulárneho klonovania. Ďalším typom vektoru je vírusový Vektor, kde sú DNA alebo RNA sekvencie odvodené od vírusu prítomného vo vektore na zbalenie do vírusu(napr. retrovírusy, replikačne defektné retrovírusy,adenovírusy, replikačne defektné adenovírusy a adeno-asociované vírusy). Vírusové vektory tiež obsahujú polynukleotidy nesené vírusom na transfekciu do hostiteľskej bunky. Určité vektory sú schopné autonómnej replikácie V hostiteľskej bunke, do ktorej sú zavedené (napr. bakteriálne vektory s bakteriálnym začiatkom replikácie a epizomálne cicavčie vektory). Ďalšie vektory (napr. neepizomálne cicavčie vektory) sú po zavedení do hostiteľskej bunky integrované do genómu hostiteľskej bunky a sú tak

MPK / Značky

MPK: C12N 15/63

Značky: spôsoby, inžinierske, návodné, systémy, sekvenčnú, prostriedky, manipuláciu, optimalizované

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/210-e18624-inzinierske-systemy-sposoby-a-optimalizovane-navodne-prostriedky-na-sekvencnu-manipulaciu.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Inžinierske systémy, spôsoby a optimalizované návodné prostriedky na sekvenčnú manipuláciu</a>

Podobne patenty