Izolovaná DNA sekvencia, vektor, hostiteľská bunka, spôsob výroby homogénneho gp350 proteínu, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie

Číslo patentu: 283446

Dátum: 27.06.2003

Autori: Spaete Richard, Jackman Winthrop

Je ešte 13 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Predkladá sa kompozícia obsahujúca variant DNA gp340, sekvencie aminokyselín, ako sú vektory, a hostiteľské bunky obsahujúce uvedené sekvencie. Predkladá sa tiež rekombinantný spôsob prípravy homogénneho gp350 proteínu bez vzniku proteínu, ďalej farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje uvedený proteín, a jeho profylaktické použitie.

Text

Pozerať všetko

Epsteinov-Barrov vírus (EBV), ktorý patrí do skupiny herpesových vírusov, vyvoláva u ľudí infekčnú mononukleózu. Táto choroba postihuje viac ako 90 populácie. Analytici V odvetví zdravotníctva stanovili, že V Spojených štátoch amerických si táto choroba vyžaduje náklady 100 miliónov amerických dolárov ročne. Uvedený vírus sa primáme prenáša slinami osôb, ktoré sú nositeľmi tohto vírusu. Deti nakazenć EBV sú Väčšinou bez príznakov ochorenia, alebo majú iba veľmi slabe symptómy nákazy. U dospievajúcich a dospelých, ktorí sa nakazili uvedeným vírusom, sa prejavujú typické príznaky infekčnej mononukleózy, vyznačujúce sa horúčkou, príznaky faryngitídy a adenopatie. Nakazené osoby si zachovávajú proti-EBV protilátky po celý svoj život a sú imúnne voči ďalšej infekcii. Vakcína EBV nie je doteraz komerčne dostupná.Navyše k infekčnému charakteru EBV sa zistilo, že EBV transformuje lymfocyty na rýchlo sa deliace bunky a dáva sa preto do súvislosti s viacerými rôznymi lymfómami vrátane Burkittovho lymfómu a orálnej masívnej leukoplakie. EBV sa tiež zistil vo Vzorkách tkanív nazofaryngeálnych nádorov. V celosvetovom rozsahu sa stanovilo, že nazofaryngeálnou rakovinou je postihnutých 80 000 osôb,pričom nákaza prevažuje v populáciách čínskych etnlk.Vývoj živej, oslabenej vakcíny pre EBV je ešte stále problematický. Výskumníci sú pri používaní živých vakcín EBV značne zdržanliví v dôsledku potenciálnej onkogenity, spojenej s EBV.Predkladaný vynález prekonáva problémy spojené s vývojom živej vakcíny vynájdením spôsobov a kompozícii pre subunitálnu vakcínu, čo nevyžaduje použitie potenciálne onkogénnych živých vírusov. V subunitálnej vakcíne sa využíva jeden alebo viac antigćnnych proteínov z uvedeného vírusu, ktoré vyvolajú imunitnú reakciu a Vznik imunity.Dva z najdôležitejších antigénnych EBV proteínov sú glykoproteín(y) gp 350/300 a gp 220/200, ktore vytvárajú časť membrànového obalu vírusu a umožňujú vírusovým časticiam Viazať sa a vstupovať do ľudských cieľových buniek interakciou s bunkovými membránovými proteinmi CD 21. Pozri Nemerow, J. Virology Q, 1416 (1987). Už dlho sa sústreďovala pozomosť na možné subunitálne vakcíny, ale ťažkosti spojené so ziskavaním antigénne účinného proteínu, získaného čistením z prírodných zdrojov a nízke výťažky z rekombinantne pripravených zdrojov obmedzovali snahy výskumníkov a vývojárov vakcíny. V uvedenej literatúre sú tieto proteíny uvádzané V rôznych rozmedziach relatívnych molekulových hmotnosti (350 alebo 300 kilodaltonov (kD) pri jednom z uvedených proteinov a 220 alebo 200 kD pri druhom proteíne). Potom sa v tomto texte uvedený protein gp 350 alebo 300 uvádza ako proteín gp 350, proteín 220 alebo 200 je tu uvádzaný ako proteín gp 220. Obidva proteíny spoločne sa V tomto texte označujú ako proteín(y) gp 350/220.Voliteľne strihnutý samotný gén kóduje uvedené gp 350/220 a dáva vznik gp 350 a gp 220 m-RNA transkriptov v prírode nie sú známe odchýlky V mieste strihu gp 350/220. Gén produkuje dva exprímovane produkty,proteín gp 35 O a proteín gp 220. Otvorený rámec čítaniaDNA sekvencie gp 350/220 je 2721 párov báz (V ďalšom texte bp). Úplný čítací rámec kóduje 907 aminokyselín proteínu gp 350. Pozri patent USA číslo 4 707 358 od Kieffa (1987). Strihnutá verzia čítacieho rámca zahŕňa 2130 báz a translátov do gp 220 proteínu, 710 aminokyselinovú sekvenciu. Teoretické molekulové hmotnosti proteínu gp 350 a proteínu gp 220 sú 95 kD a 70 kD. stanovené molekulové hmotnosti exprimovaného gp 350 proteínu a proteínu gp 220 boli premenlivé, ale boli približne 350 kD a 220 kD. Rozdiel medzi predpokladanými a skutočne stanovenými molekulovými hmotnosťami je V dôsledku rozsiahlej glykolyzácie uvedených proteínov. V každej bunke sa produkujú proteíny gp 350 a gp 220 v molovom pomere v rozmedzí od 6 1 až po l 1. V bunkách 895-8, ktoré sú trvale nakazenć s EBV, sa uvedený pomer mení, ale niekedy napríklad dosahuje hodnotu 6 l. Pozri Miller, Proc. Natl. Acad. Sci. Q, 383 (1972).Rekombinantná príprava uvedených glykoproteínov doteraz zvyčajne vyústila do produktu, ktorý obsahoval zmesi proteínov gp 350 a gp 220. Doteraz sa proteíny gp 350/220 exprimovali V hypofýze krýs, V bankách Vaječníka čínskeho škrečka, V bunkách VERO (mláďa africkej zelenej opice), ako aj bunkách kvasiniek. Pozri Whang, J. Vírol. § 1, 1796 (1982), Motz, Gene 44, 353 (1986) a Emini, Vírology É, 387 (1988). Na prípravu proteínov gp 350/220 vo fibroblastových bunkách myši sa použil tiež systém expresie bovinného vírusu papiloma. Pozri Madej,Vaccine Q, 777 (1992). Na expresiu proteínov gp 350/220 sa použili laboratóme a vakcínovanć kmene vírusu Vaccinia. V odbore je známa tiež modifikované rekombinantná verzia EB vírusovej gp 350/220 DNA a proteínu. Bližšie,pripravili sa rekombinantné odrezané konštrukty génu gp 350/220, V ktorých chýba membránová premosťujúca sekvencía. Uvedené konštrukty stále produkujú zmes uvedených dvoch gp 350 a gp 220, ale delecia membránovej premosťujúcej oblasti umožňuje sekréciu proteínov. Pozri Finerty, J. Gen. Virology Ľ, 449 (1992) a Madej, Vaccína Q, 777 (1992). Tak sa rekombinantne pripravili rôzne reštrikčnć fragmenty a fúzové proteíny, obsahujúce rôzne gp 350/220 sekvencie a exprimovali sa do E. coli. Pozri európsku patentovú prihlášku 0173 254, publikovanú 24. júla 1991.Podľa uvedeného sa výskum EBV Vo vzťahu k gp 350/220 doteraz sústredil buď na dosiahnutie účinnej expresie prírodnej sekvencie gp 350/220, alebo na modifikovanú sekvenciu bez transmembrànovej domény, čoho výsledkom bola zmes uvedených dvoch alternatívnych verzií prírodného proteínu či proteínu bez transmembránovej domény, alebo na prípravu epitopických fragmentových sekvencií V B-galaktozidázových fúzových proteínoch.Sú známe čiastočne čistené prípravky gp 350/220. Pozri Finerty, J. Gen. Virology, 13, 449 (1992) (rekombinantne pripravené, čiastočne Vyčistené). Čo sa týka prírodného gp 350/220 proteínu, vo väčšine prípadovje postup čistenia spojený s inaktiváciou antigenicity proteínu, čím sa proteín stáva nevhodným na použitie v subunitálnej vakcíne. Vo vedeckej literatúre však boli opísané vysoko čistené pripravky antigénne účinného proteínu gp 3 50 z prírodných (to znamená nerekombinantných) zdrojov Pozri David, J. Immunol. Methods, Q, 231 (1988). Dalej, na očkovanie cottontop tamarins proti lymfómom, vyvolaných EBV sa použil rekombinantný Vakcínový vírus, exprimujúci proteín gp 350/220. Pozri Morgan, J. Med. Virology Ľ, 189(1988), Mackett, EMBO J., 4, 3229 (1985) a Mackett,VACCINES 86, strana 293 (Lemer R.A., Chanock RM.,Brown F., Eds., 1986, Cold Spring Harbor Laboratory). Vírusová gp 350/220 DNA sekvencia Však doteraz nebola zo SK 283446 B 6strojená tak, aby bola schopná exprimovať samostatne jednu z altematívnych strihových verzií génu, pričom by bola schopná a zabezpečovala by produkciu čistého gp 350 alebo gp 22 O proteínu. Nebol pripravený ani rekombinantný alebo mutantný vírus, ktorý by exprimoval jeden alebo druhý z uvedených proteínov gp 350 alebo gp 220.Strihové miesta vo všeobecnosti uľahčujú spracovanie pre-mRNA na mRNA. Na účinnú akumuláciu nových mRNA sú pri víruse polyoma nevyhnumé strihové miesta. striedanie 3 a 5 strihových polôh pri víruse polyoma vedie k zníženej alebo celkom zablokovanej akumulácii mRNA. Pozri Treisman, Nature E, 595 (1981). Pri víruse SV 40 odštiepiteľne sprostredkujúce sekvencie uľahčujú prechod von z jadra a stabilizáciu mRNA v jadre a pretože tieto intrónové/exónové spojovacie sekvencie uľahčujú viazanie malých, jadrových, RNP častíc usudzuje sa, že prestrihové mRNA sa počas procesu nemusia vhodne spájať. Ukázalo sa, že bodové mutácie v exónovej/intrónovej strihovej polohe znižujú exónovú/intrónovú štiepateľnosť a môžu prerušiť priebeh spracovania pre-mRNA, jadrový transport a znížiť stabilitu. Pozri Ryu, J. Virology Q, 4386 (1989) a Gross, Nature Ě, 634 (1980).Až do tohto vynálezu bol preto vplyv úpravy miesta strihu na ñąnkčnú expresiu a antigénnu účinnosť proteínov,kódovaných s EBV sekvenciou gp 350/220 prinajlepšom neznámy a nepredpovedateľný.Následne sa uvádzajú údaje z ďalšej literatúry, súvisiace s predmetom vynálezu. Biológia EBV a ním vyvolaná choroba sú prehľadne spracované v Straus, Annal. of Int. Med. L 8, 45 (1993). Opis EBV BLLFI otvoreneho čítacieho rámca možno nájsť v Baer, Nature , 207 (1984). Opisy Epsteinovej-Barrovej vírusovej gp 350/220 DNA a aminokyselinových sekvencií možno nájsť v článkoch Beisela, J. Virology g, 665 1985), a Biggina EMBO J. 3,1083 (1984) a v patente USA číslo 4,707,358 od Kieffa a kol. (1987). Porovnanie DNA sekvencií kódujúcich gp 350/220 v Epsteinovom-Barrovom víruse typu A a B je opísané V Lees, Virology g, 578 (1993). Monoklonové protilátky, ktoré prejavujú neutralizačnú účinnosť proti gp 350/220 glykoproteínu EBV sa opisujú v ľhorley-Lawson, Proc. Natl. Acad. Sci. ZZ, 5307 (1980). Nakoniec, súlad strihových miest sekvencií pre donorové a akceptorové strihovć miesta opisuje Mount, Nucleic Acid Res. m, 459Z jedného hľadiska predkladá tento vynález nestrihové varianty DNA sekvencie gp 350/220 EBV. DNA sekvencie podľa tohto vynálezu môžu zahŕňať izolovanú, samostatnú sekvenciu DNA, ktorá kóduje expresiu homogénneho proteínu gp 350. Uvedená DNA sekvencia, kódujúca pre proteín gp 350 sa vyznačuje tým, že obsahuje rovnakú alebo v podstate rovnakú nukleotidovú sekvenciu, ako je na obr. 1,v ktorej uvedené prírodné nukleotidy v donorových a akceptorových strihových polohách sú nahradené nie prírodnými nukleotidmi, a jej fragmenty. Táto DNA sekvencia môže zahŕňať 5 a 3 nekódujúce sekvencie, lemujúce bočne kódujúcu sekvenciu, a ďalej môže zahŕňať terrninálovú amínovú signálnu sekvenciu. Obr. l znázorňuje nekódujúce sekvencie a hviezdičkou sa vyznačuje koniec predpokladanej signálnej sekvencie. Je zrejmé, že DNA sekvencie podľa tohto vynálezu môžu však vylučovať niektoré alebo všetky uvedené bočné alebo signálne sekvencie. Nestrihové variantné DNA sekvencie podľa tohto vynálezu sa pripravia vložením mutácie do DNA sekvencie z obr. l do donorových a akceptorových strihových polôh génu, kódujúceho gp 350/220. Tento zásah eliminuje produkciu proteínu gp 220 tak, že sa pripraví iba proteín gp 350.Z iného hľadiska tento vynález zahŕňa homogénne gp 350 proteiny a spôsob prípravy uvedených proteínov pomocou expresie nestrihových variantov gp 350 DNA sekvencie EBV vo vhodnej prokaryotickej alebo eukaryotickej hostiteľskej bunke pod kontrolou vhodnou, expresiu riadiacou sekvenciou. Výraz homogénny, ktorý sa tu používa vo vzťahu k gp 350 proteínom znamená, že gp 350 je bez alebo V podstate bez gp 220 proteínu. Poznamenávame, že homogénny gp 350 proteín pripravovaný rekombinantne v bunkách cicavcov alebo hmyzu nebol podľa našich vedomostí v odbornej literatúre doteraz opísaný.Z ďalšieho hľadiska vynález zahŕňa homogénne gp 350 proteiny, ktoré majú navyše delécie. Uvedené delécie zahŕňajú bud odstránenie transmembránovej oblasti alebo odstránenie transmembránovej oblasti a zostávajúceho C-konca gp 350. Takto navyše upravené DNA sekvencie a uvedené nimi kódované proteiny tvoria ďalší aspekt tohto vynálezu.Predkladá sa tiež rekombínantná DNA molekula, obsahujúca vektorovú DNA a sekvenciu DNA, kódujúcu homogénny gp 350 proteín. Uvedená DNA molekula poskytuje gp 350 sekvenciu v operatívnom spojení s vhodnou regulačnou sekvenciou, schopnou riadiť replikáciu a expresiu homogénneho gp 350 vo vybranej hostiteľskej bunke. Týmto vymálezom sa tiež predkladajú hostiteľské bunky transformované s uvedenými DNA molekulami na použitie pri expresii rekombinatného homogénneho gp 350.Uvedené DNA molekuly a transformované hostiteľske bunky podľa tohto vynálezu sú využité v ďalšom aspekte tohto vynálezu, v novom spôsobe prípravy rekombinatného homogénneho proteínu gp 350 alebo jeho fragmentu. V tomto spôsobe prípravy sa kultivuje bunková línia, transformovaná s DNA sekvenciou, kódujúcou homogénny gp 350 proteín alebo jeho fragment (alebo rekombinantná molekula DNA ako je opísaná skôr) v operatívnom spojení s vhodnou regulačnou alebo expresiu ovládajúcou sekvenciou, schopnou riadiť expresiu proteínu vo vhodných podmienkach, umožňujúcich expresiu rekombinantnej DNA. Exprimovaný proteín sa potom vhodným známym spôsobom oddelí od hostiteľskej bunky alebo z kultivačného prostredia. Uvedený spôsob prípravy sa môže využívať na prípravu celého radu buniek, známych ako hostiteľské bunky v súčasnosti sa dáva prednosť bunkám cicavcov a bunkám hmyzu.Sekvencie DNA a proteiny podľa tohto vynálezu sú užitočné pri príprave terapeutických a imunogénnych látok,obsahujúcich EBV determinanty. Tieto zlúčeniny nachádzajú uplatnenie v subunitálnych vakcínach na profylaktickú liečbu a prevenciu chorôb, súvisiacich s EBV, ako je mononukleóza, Burkittov lymfóm a nazofaryngeálny karcinóm. Z uvedeného vyplýva ďalší aspekt tohto vynálezu,zahŕňajúci terapeutícké a/alebo imunogénne farmaceutické kompozície na prevenciu a liečbu stavov súvisiacich s EBV a chorôb ľudí, ako je nákazlivá mononukleóza, Burkettov lymfóm a nazofaryngeálny karcinóm. Uvedené terapeutické a/alebo imunogénne farmaceutické kompozície obsahujú imunogénnosť vyvolávajúce účinné množstvo jedného alebo viacerých homogénnych gp 350 proteínov podľa tohto vynálezu v zmesi s farmaceutický prípustným nosičom, ako je hydroxid hlinitý, soľný roztok a soľný roztok tlmený fosforečnanom, teda s nosičmi, ktoré sú v danom odbore známe. Výrazom imunogénnosť vyvolávajúce sa rozumieme množstvo postačujúce na stimuláciu produkcie protilátok k EBV u cicavcov. Účínná zložka sa voliteľne môže podávať vo forme agregátu obsahujúceho lipozóm. Na profylaktické použitie u človeka sa uvedené famiaceutické kompozície môžu formulovať ako subunitálne vakcíny. Pacient sa môžeštepiť dávkou postačujúcou na stimuláciu vzniku protilátok v jeho tele a preštepiť po šiestich mesiacoch alebo jednom roku.Ďalší aspekt tohto vymálezu je potom spôsob liečby chorôb a stavov, ktoré sú vo vzťahu k EBV, podávaním pacientovi, najmä človekovi, imunogénnosť vyvolávajúceho účinného množstvo homogénneho proteínu gp 350 vo vhodnom farmaceutickom nosiči. Ešte ďalší aspekt tohto vynálezu je spôsob stimulácie imunitnej reakcie proti EBV podávanim pacientovi imunogénnosť vyvolávajúceho účinného množstva homogénneho proteínu gp 350 vo vhodnom farmaceutickom nosiči.Obr. 1 znázorňuje sekvenciu aminokyselín gp 350/220(z Beisel, J. Virology a, 665 (1985. Na obrázku sú vyznačené donorové a akceptorové miesta strihu. Transmembránová oblasť je zakreslená vodorovnými šípkami a hviezdička () vyznačuje koniec predpokladanej signálnej sekvencie. Číslovanie nukleotidov je znázomene vľavo číslovanie aminokyselín vpravo.Obr. 2 znázorňuje konštrukciu delécie gp 350 a polohu usmemených mutantov. Plazmidy, označené pMDTM a pMSTOP, sú príkladmi nestrihových variantov podľa tohto vynálezu. V časti A obrázka je znázomený lineámy model proteínu gp 350 približne zosúladený s kódujúcim klonom BLLF 1 pod ním. Na proteíne sú znázornená N-koncová signálna sekvencia ss a transmembránové domény IM a na génovom diagrame sú vyznačené dôležité reštrikčné miesta. Uvedený gp 350 gén sa klonoval v dvoch segmentoch, v Hindlll/Bfal BLSH 1 fragmente a BanI/Hindlll BLSH 2 fragmente. Použitím polymerázovej reakcie reťazca z oblasti klonu BLLF l sa vytvoril SCYT. V časti B obrázka je znázomená schéma klonovania pre pDTM,pSTOP, pMDTM a pMSTOP (plazmidy nie sú na obrázku prispôsobené). Podrobnosti klonovania sa opisujú v príkladoch l a 2. Plazmidové mapy sú vyznačené s príslušnými reštrikčnými miestami, s použitými klonujúcími vektormi a fragmentmi génu gp 350. Mutácie strihovej polohy v pMDTM a pMSTP sú vyznačené hviezdičkami.Obr. 3 znázorňuje výsledky imunoprecipitácie homogénneho proteínu gp 350 z pMDTM tak, ako sa získali spôsobom SDS-PAGE. Pozitívne porovnávacie (kontrolné,GH 3 deltal 9) bunky, vylučujúee strihovú formu gp 350/220 proteínov, negatívne porovnávacie (kontrolné, pEEl 4) bunky a niekoľko pMDTM klonov sa metabolicky označili s S-metionínom počas 5,5 hodiny z výsledného tkanivového kultivačného prostredia sa imunoprecipitoval homogénny gp 350 proteín. Pre každý typ buniek sa vzorky značeného tkanivového kultivačného prostredia (§) a vzorky gp 350/220 precipitátov (lg) podrobili elektroforéze na 5 nom SDS-PAGE (polyakrylamídová gélová elektroforéza). Polohy značiek molekulovej hmotnosti sa uvádzajú na ľ vej strane obrazu.Obr. 4 znázorňuje výsledky analýzy proteínu z pMDTM klonov, exprimovaných v CHO bunkách, ako sa opisuje V príklade 3.4 (northemová prenosová analýza, imunopijakovanie).Zverejňujú sa kompozície a spôsoby, zahůäąiúce klonované DNA sekvencie EBV, kódujúce nestrihové varianty gp 350 proteínu. Ako už bolo uvedené, nestrihové varianty sa v texte uvádzajú ako homogénne proteíny gp 350. Keď sa gén gp 350/220 bežne exprimuje v bunkách cicavcov, vznikajú dva génové produkty, gp 350 a gp 220, ako dôsledok RNA strihov génu. Tento vynález však umožňuje prípravu jediného génového produktu, gp 350. Tento vynález vyžaduje odstránenie niektorých alebo všetkých RNA strihových signálnych miest v géne gp 350 a expresiu vo vhodných hostiteľských bunkách. Do génu gp 350 sa zaviedlimutácie na zabránenie produkcie verzie proteínu s 220 kD,keď sa v bunkách cicavcov exprimuje gén gp 350/220. Vysledkom je, že sa produkujú mRNA prepisy, kódujúce iba pre gp 350. Eliminácia expresie gp 220 pri použití génu gp 350/220 nestrihového variantu má za následok zvýšenie pomernej produkcie gp 350 vzhľadom na gp 220. Produkcia gp 220 nie je užitočná na prípravu účinnej proti-EBV vakcíny, pretože gp 350 obsahuje všetky potenciálne antigénne miesta, ktoré sa nachádzajú na gp 220.Preto jeden z aspektov tohto vynálezu je sekvencia DNA, kódujúca polypeptidovú sekvenciu, v podstate rovnakú ako gp 350, s tou výnimkou, že kodón donorového strihového miesta, kódujúci aminokyselinu 501 a kodón akceptorového strihového miesta, kódujúci aminokyselinu 698 boli upravené náhradou prírodných nukleotidov nie prírodnými nukleotidmi. Prírodné nukleotidy sa výhodne nahradia s nie prírodnými nukleotidmi tak, že sekvencia aminokyselín ostáva rovnaká. Podrobnejšie, ako príklad, prírodné nukleotidy AAGT na donorovom strihovom mieste(nukleotidy 1500 až 1504) a prírodné nukleotidy A a T bočné k GC akceptorovému strihovému miestu (nukleotidy 2091 a 2094) sa nahradili nukleotidmi GTCA, T a A. Dôsledkom substitúcie v donorovom mieste je, že glutamín v polohe aminokyseliny 500 a serín v polohe 501 ostávajú rovnaké. Podobne treonín v polohe aminokyseliny 697 a glycín V polohe 698 ostáva rovnaký ako výsledok úpravy na akceptorovom mieste.Obdobne sa môžu vykonať ine substitúcie ako tie, ktoré sa ako príklad uviedli skôr substitúcie môže ľahko vykonať skúsený odborník v danom odbore a podrobnejšie sa opisujú v ďalšom texte.Jeden aspekt tohto vynálezu zahŕňa homogénne gp 350 proteíny. Uvedené homogénne gp 350 proteíny sa ďalej vyznačujú tým, že majú v podstate rovnakú sekvenciu aminokyselín, ako je znázomená na obr. l od aminokyseliny l až po aíninokyselinu 907, od aminokyseliny l až po 862, alebo od aminokyseliny l až po aminokyselinu 907 a s výnimkou aminokyselín 863 až 881, každá s alebo bez Nkoncovej 18 aminokyselinovej signálnej sekvencie. Navyše sa predkladajú analógy homogénnych proteínov gp 350 a zahŕňajú mutanty, v ktorých sa nachádzajú zmeny v sekvencii aminokyselín, ktoré zachovávajú antigénnu účinnost a výhodne majú najmenej 80 -nú homológiu, výhodnejšie 90 -nú, a najvýhodnejšie 95 °/o-nú homológiu s prislušnými oblasťami proteínov gp 350. Príklady zahŕňajú proteíny a polypeptidy s málo odlišnými amínokyselinami od sekvencie aminokyselín z obr. 1, bližšie náhrady konzervatívnych aminokyselín, aminokyselín vo veľmi malom rozsahu. Konzervatívne nahrádzania sú také, ktoré nastávajú v rámci jednej skupiny aminokyselín, ktoré majú príbuzné bočné reťazce. Geneticky kódované aminokyseliny sa všeobecne rozdeľujú do štyroch druhov (l) kyslé aspanát,glutamát (2) zásadité lyzín, arginín, histidín (3) nepolárne alanín, valín, leucín, izoleucín, prolín, fenylalanín,metionín, tryptofán (4) poláme bez náboja glycín, asparagín, glutamín, cysteín, serín, treonín, tyrozín. Fenylalanin, tryptofán a tyrozin sú niekedy spolu označované ako aromatické aminokyseliny. Oprávnene možno napriklad predpokladať, že jedno nahradenie leucínu, alebo podobné konzervatívne nahradenie aminokyseliny štruktúrne príbuznou arninokyselinou nebude mať veľký vplyv na antigénnu účinnosť alebo funkčnosť.Tento vynález ponúka výhodu jednoduchšieho čistenia gp 350. Pretože gp 350 a gp 220 majú podobné biochemické vlastnosti, gp 220 pri príprave často sprevádza čistený gp 350. Bunky exprimujúce iba nestrihové varianty génu gp 350/220 zjednodušujú čistenie proteínu. Znižujú sa taknáklady výroby gp 350. Tento vynález tiež uľahčuje biochemickú charakterizáciu východiskového materiálu na čistenie gp 350. Pretože je prítomný iba jeden druh, analýza na obsah proteínov a analýza sekvencie aminokyselín nevyžaduje brať do úvahy prítomnosť druhého druhu.Vynález navyše ponúka výhodu zvýšenej produkcie gp 350. Ochrana strihu génu gp 350 spôsobí, že bunka miesto produkcie dvoch génov gp 350 a gp 220 môže produkovať iba samotný gp 350. V niektorých bunkách sa stanovilo, že koncentrácie gp 220 dosahujú 30 až 100 v porovnaní s koncentráciou gp 350. Ak sa eliminuje strih génu,zvýši sa produkcia gp 350 na úkor potlačenia produkcie gp 220.DNA sekvenciu gp 350/220 génu opisuje Beisel, J. Virology 21, 665 (1985) a Biggin, EMBO J. à, 1083 (1984) a uvedená sekvenciaje znázomená na obr. l, Uvedený gén je otvorený čítací rámec 2721 báz, kódujúci 907 aminokyselín a určujúci primámy translačný produkt približne na 95 kD. Rozdiel medzi predpokladanou a skutočnou hodnotou vyjadruje rozsiahlu glykolizáciu proteínu. 591 báz (kódujúcich 197 aminokyselín) je vystrihnutých, na potlačenie produkcie gp 220, Zdanlivá molekulová hmotnosť génu gp 350/220 sa môže tiež meniť v závislosti od druhu použitého spôsobu stanovenia, využitia glykolizačných miest v rôznych typoch buniek, post-translačných procesných rozdielov alebo od selektívnej génovej mutácie. Stanovené hodnoty molekulovej hmotnosti sú rôzne pri produktoch s rôznymi variantmi nestrihových miest génu gp 350, ale výraz homogénny gp 350 protein alebo proteíny zahŕňa génové produkty nestrihových variantov, ktoré Voliteľne majú ďalšie delécie alebo mutácie, ako sú C-terminálové delécie a/alebo transmembránové modifikácie a sú tiež obsahom tohto vynálezu. Výraz p 220 proteín sa vzťahuje na alternatívne strihnutý gp 350/220 génový produkt s molekulovou hmotnosťou približne 220 kD. Strihové miesta v géne gp 350/220 sa identifikovali porovnaním gp 350/220 génu so zhodnými donorovými a akceptorovýmí strihovými sekvenciami, odvodenými z ďalších génov, prevažne z eukaryotických organizmov. Uvedené zhodné sekvencie, ktoré vyvinul Mount, Nucleic Acid Res. m, 459 (1982) zo štúdia strihových miest ďalších génov súBázy, označené hore hviezdičkou predstavujú bázy,ktoré vznikajú na 100 na všetkých strihových miestach(vysoko konzervatívne). Polohy s dvoma bázami, alebo s jednou bázou predstavujú konzervatívne polohy (nezvýraznené polohy). Lomka znázorňuje skutočné miesto strihu.V géne gp 350/220 sa donorové strihové miesto nachádza za nukleotidom 1501 a akceptorové strihové miesto za nukleotidom 2092, ako sa preukázalo sekvenovaním (Biggín, EMBO J. à, 1083 (1984 génu gp 350/220. (Číslovanie použité na tomto mieste je v súlade s číslovaním v práci Biggina). Strihove miesto sa nachádza v príslušnej oblasti génu typu B kmeňa EBV (donorové strihové miesto za A 150. a akceptorove strihové miesto za Gmg). Tento vynález zahŕňa kompozície, pripravené použitím strihového miesta bud kmeňa A alebo B, alebo iného EBV kmeňa na prípravu jedného druhu mRNA z génu gp 350/220. V prikladoch sa použila DNA sekvencia typu A vírusu z kmeňaB 95-8, hoci sa tiež môže rovnako použiť DNA sekvencia typu B uvedeného kmeňa, pretože génove produkty typu A a B kmeňov po translácii sú na 98 identické. Kmeň B nemá aminokyseliny 507 až 520 a 570 až 576. Použil sa typ kmeňa A, pretože obsahuje všetky z možných gp 350 antigénnych miest. Voliteľne sa podľa tohto vynálezu môže použiť EBV gp 350/220, ktorý má kmeňové špecifické sekvencie na prípravu EBV kmeňovo špecifických homogénnych gp 350 proteínov s imunogénnymi vlastnosťami špecifickými k určitému kmeňu, a preto užitočnými v imunogénnych a/alebo terapeutických kompozíciách na prevenciu alebo liečbu chorôb súvisiacich s lcmeňovo špecifickým EBV. Tabuľka 1 znázorňuje divoký typ nukleotidu a aminokyselinové sekvencie donorových a akceptorových strihových miest.Na zabránenie strihu RNA génu gp 350/220 sa vložili mutacie do sekvencie nukleových kyselín génu gp 350/220 tak, aby nahradili príslušné páry báz RNA strihového miesta. Aby sa strihové miesta stali nefunkčnými, treba nahradiť výhodne najmenej jednu z báz z dvoch vysoko konzervatívnych báz, rámujúcich donorové miesto alebo akceptorové miesto, s nekonzervatívnymi bázami, výhodnejšie najmenej dve vysoko konzervatívne bázy treba mutácíou zmeniť na nekonzervatívne bázy. Ostatné konzervatívne bázy, viac ako o dve bázy ďalej od strihového miesta,môžu byť tiež nahradené nekonzervatívnymi bázami strihového miesta, aby sa ďalej znížilo rozoznávanie strihového miesta. Donorové a akceptorové miesta sa môžu zmeniť,aby sa dosiahlo narušenie strihového mechanizmu. Donor aj akceptor výhodne každý obsahuje najmenej jednu zmenu v polohe na jednom zo štyroch vysokokonzervatívnych strihových miest bázy a výhodnejšie najmenej dve zmeny v polohe na dvoch vysoko konzervatívnych strihových miestach bázy. Ak nie je jedno strihové miesto schopné mutácie v dôsledku vyžadovaného zachovania divokého typu aminokyselinovej sekvencie, potom je výhodné vloženie najmenej dvoch mutácií na ďalšie strihové miesto.Mutácia na strihovom mieste gp 350/220 môže zaviesť zmeny do sekvencie aminokyselín následne exprimovaného gp 350 proteínu. Výhodne by také zmeny mali byť substitúcie konzervatívnych aminokyselín. Konzervatívne substitúcie V sekvencii aminokyselín, na rozdiel od nekonzervatívnych zmien v sekvencii aminokyselín, pomáhajú zachovať antigénne miesta. Zmeny konzervatívnych aminokyselín sa môžu vykonať pokiaľ zmena (zmeny) bázy (báz) má (majú) za následok vhodnú zmenu invariantných donor/akceptorových báz. Napríklad, Gly sa môže substituovať pre Sersm na donorovom strihovom mieste s použitím akýchkoľvek Gly-špecifických kodónov iných, ako GGU (použitie GGU by ochraňovalo G nukleotid a výsledkom by nebolo vyžadované nahradenie v strihovom signáli). Obdobne nahradenie Glyóggna Ala na akceptorovom strihovom mieste bude konzervatívna zmena, ale pretože všetky Ala kodóny začínajú s vysoko konzervatívnym G nukleotidom, výsledkom nebude vyžadovaná náhrada. Hoci prolín môže byť tiež konzervatívnou arninokyselinovou zmenou, k náhrade divokého typu aminokyselín sa prolín nemôže použiť, pretože by to viedlo k modiŕikácii terciámej štruktúry proteínu a tak by sa maskovalo jedno alebo viac gp 350 antigénnych miest. Tabuľka 1 uvádza prípustné konzervatívne aminokyselinová náhrady v sekvenciách divokćho typu. V spodnej časti tabuľky sa uvádza priklad mutácie s konzervatívnymi aminokyselinovými zmenami.

MPK / Značky

MPK: C12N 1/21, C12N 15/38, C12N 5/10, A61K 39/245, C07K 14/05

Značky: obsahom, hostiteľská, proteínu, výroby, sekvencia, izolovaná, prostriedok, homogénneho, farmaceutický, spôsob, použitie, vektor, buňka, gp350

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/21-283446-izolovana-dna-sekvencia-vektor-hostitelska-bunka-sposob-vyroby-homogenneho-gp350-proteinu-farmaceuticky-prostriedok-s-jeho-obsahom-a-jeho-pouzitie.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Izolovaná DNA sekvencia, vektor, hostiteľská bunka, spôsob výroby homogénneho gp350 proteínu, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie</a>

Podobne patenty