Spôsob detekcie biologických organizmov použitím ramanovho rozptylu

Číslo patentu: E 10226

Dátum: 16.10.2006

Autori: Fischell David, Siegel Neal

Je ešte 11 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Predložený opis sa vo všeobecnosti týka oblasti biologického diagnostického vybavenia a testovacich spôsobov.Táto prihláška si nárokuje prioritu z US predbežnej prihlášky č. 60/836936, podanej 11. augusta 2006, a US predbežnej prihlášky č. 60/727328, podanej 17. októbra 2005.Momentálne sú v mnohých oblastiach potrebné systémy na detekciu biologických organizmov alebo komponentov (napr. proteínov, DNA alebo iného genetického materiálu). Tieto oblasti zahrnujú potravinovú bezpečnosť, medicinsku diagnostiku, veterinárnu diagnostiku,detekciu patogénov a vnútroštátnu bezpečnosť. Súčasné spôsoby zahrnujú imunochemické techniky, techniky molekulárnej biológie a biologické techniky, ako napriklad polymerázovú reťazovú reakciu (PCR) a ligázovú reťazovú reakciu (LCR). Tieto spôsoby a techniky majú často obmedzenú presnosť, špecifickosť a citlivosť.Medicinska diagnostika napriklad používa imunochemické techniky, aby poskytla špeciflckost pri detekcii biologicky účinných komponentov vzorky. Známe je, že protilátky vyvinuté proti špecifickým zlúčeninám, majú vysokú afinitu vzhladom na tieto komponenty. Samotné protilátky majú obmedzenú schopnosť vlastnej detekcia, a preto sa typicky chemicky modifikujú značkami alebo tagmi, ktoré slúžia na zlepšenie detekcie protilátky počas reakcie s cieľovým biologlckým komponentom. Týmto spôsobom môžu metódy predchádzajúceho stavu techniky identifikovať biologický komponent. Nanešťastie schopnost detegovat protilátku má tendenciu interferovať s inými vecami vo vzorke, zahrnujúcimi vzorkovú matricu, premývacie komponenty a iné chemikálie. Okrem toho aktuálne detekčné techniky nie sú citlivé na nizke koncentrácie alebo na množstvo protilátok (tzn. na nízke koncentrácie alebo na množstvo cieľových biologických komponentov).Na detekciu špecifických chemických komponentov sa v minulosti používali Ramanove svetelné rozptylové techniky (Ramanova spektroskopie). Ramanov rozptyl je základnou vlastnosťou interakcie svetla s molekulami. Keď svetlo zasiahne molekulu, môže spôsobiť vibráciu atómov molekuly. Táto vibrácia potom zmeni energiu ďalšieho svetla, zasahujúceho molekulu. Toto dalšie rozptýlené svetlo má charakteristiky, ktoré sú merateľné a unikátne pre určitú štruktúru molekuly,ktorej vibrácia bola indukovaná. Samotnej Ramanovej spektroskopii chýba špecifickost a citlivosť na detekciou biologických organizmov a komponentov.Odvolávame sa na určité dokumenty z predchádzajúceho stavu techniky. SENGUPTA A SPOL Bioaerosol characterization by surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) J. AEROSOL SCL JOURNAL OF AEROSOL SCIENCE MEASUREMENT AND CHARACTERIZATION OF BIOAEROSOLS MAY/JUNE 2005, zv. 36, č. 5 - 6, máj 2005 (2005 05), strany 651 - 664, uvádzajú, že baktérie sa môžu detegovat použitím SERS. Baktérie sa môžu detegovat použitím SERS. bez použitia Ramanovho aktívneho reakčného činidla špecifického pre baktériu, prostredníctvom kombinovania aerosolizovanej baktérie s nanokoloidnými suspenziami striebra. US 20031059820 a MOSIER-BOSS P A SPOL. Surface- enhanced Raman spectroscopy substrate composed of chemically modified gold colloid particles immobilized on magnetic microparticles. ANALYTlCAL CHEMISTRY 15 FEB 2005, zv. 77, č. 4, 15. február 2005 (2005-0215), strany 1 031- 1 037, uvádzajú určité zlúčeniny, ktoré sa môžu použit ako SERS/Ramanove značky. WO 204/007767 uvádza, že cieľové molekuly sa môžu detegovať použitím SERRSaktivnych polymérových gulôčok. XU SHUPING A SPOL. Surface-enhanced Raman scattering studies on immunoassay, J BIOMED OPT JOURNAL OF BlOMEDlCAL OPTICS MAY/JUNE 2005,zv. 10, č. 3, máj 2005 (2005-05), strany 1 - 12 a DRISKELL JEREMY D ASPOL. Low-level detection of viral pathogens by a surface-enhanced Raman scattering based immunoassay. ANALYTlCAL CHEMISTRY 1 OCT 2005, zv. 77, č. 19, 1. október 2005 (2005-10 - 01), strany 6 147 - 6 154, navrhujú, že obmedzenia Ramanovej spektroskopie pri detegovaní biologických molekúl sa môžu prekonať prostrednictvom použitia SERS. GROW ANNE A SPOL. New biochip technology for labelfree detection of pathogens and their toxins. JOURNAL OF MICROBIOLOGICAL METHODS MAY 2003, zv. 53, č. 2, Máj 2003 (2003-05), strany 221 - 233 navrhujú, že určité baktérie sa dajú detegovať bez použitia Ramanovho aktívneho reakčného činidla špecifického pre dané baktérie, a to detegovanim charakteristického Ramanovho spektra produkovaného týmito baktériami.Predložený opis sa týka systému, ktorý využíva kombináciu Ramanovej spektroskopie a biologických značiacich technik na identifikáciu a kvantifikáciu biologických organizmov a komponentov s vyššou citlivosťou a špecifickosťou než je citlivosť a špecifickost techník známych zo stavu techniky. Konkrétne sa použitie predloženého vynálezu na detekciu kombinácii.2 protilátka/biologický komponent môže uskutočňovať použitím imunotestu a potom techniky detekcie Ramanovho rozptylu. Predložený vynález sa týka spôsobov definovaných v nárokoch.vjednom uskutočnení tento vynález využíva kombináciu Ramanovej spektroskopie a techník biologického značenia na identifikáciu a kvantifikáciu biologických komponentov, ako napríklad proteínov alebo peptidov, vrátane akýchkoľvek posttranslačných modifikácií, pri špecifických konformácíách alebo stavoch asociovaných s ochorením napríklad na identifikáciu a kvantifikáciu príónových proteínov.lmunotest pre určité uskutočnenia predloženého vynálezu zahrnuje najprv naviazanie sa protilátky pripojenej na tuhý povrch na cielový biologický komponent. Nenaviazané komponenty testovanej vzorky sa potom vymyjú, pričom zostane len naviazaná kombinácia biologický komponent/protilátka. V tomto bode sa kombinácia biologický komponent/protilátka môže detegovať prostredníctvom Ramanovho rozptylu ultrafialového svetla.Na zvýšenie citlivosti sa uvažuje o ďalšom kroku, v ktorom sa potom zavedie jedno alebo viacero nových reakčných činidiel a naviaže sa na kombináciu biologický komponent/protilátka. Kombinácia nového reakčného činidla (činidiel) s kombináciou biologický komponent/protilátka sa potom môže detegovat použitím Ramanovho rozptylu svetla. Príklady takýchto reakčných činidiel zahrnujú, ale nie sú obmedzené na1. protilátky značené Ramanovými aktívnymi molekulami2. konjugáty enzým/protilátka skombinované s ďalšími chemickými činídlami, ktoré reagujú s cieľom vytvorit Ramanove aktívne molekuly3. Ramanove aktívne reakčné činidlá, ktoré chemicky interagujú s biologickým komponentoma 4. chemické činidlá, ktoré sa konvertujú prostredníctvom biologického komponentu naTaktiež sa predpokladá, že namiesto začatia kombinácie biologický komponent/protilátka, ako je vo vyššie uvedených príkladoch 1 a 2, môžu Ramanove detekčné metódy využívat chemické látky, ktoré interagujú s biologickým komponentom bez protilátky, ako je to opísané vo vyššie uvedených príkladoch 3 a 4.Tiež sa predpokladá, že sa pre biologickú úlohu môžu použiť aj iní špecifickí väzobní partneri než protilátky, napríklad biologický receptor (proteín).Hoci sa tu opísané techniky spájajú s detekciou biologických organizmov a komponentov,podobné techniky sa predpokladajú aj na detekciu anorganických komponentov, organických komponentov, kontaminantov alebo toxínov vo vzorke. Dalšie Zdokonalenie opísaných detekčných techník zahrnuje výber takých reakčných činidiel, ktoré vykazujú rezonančný Ramanov svetelný rozptyl. Inými slovami, existujú frekvencie s vyššou intenzitou v rozptýlenom svetle, ktoré sú špecifické pre určitú štruktúru reakčného činidla. Rezonančný fenomén vo všetkých uskutočneniach predloženého vynálezu sa týka výlučne chemickej štruktúry a interakcie, a netýka sa žiadnej interakcie s tuhým povrchom, ako je to v prípade techniky známej ako Surface Enhanced Resonant Raman Scattering (SERRS - Ramanov rozptyl s povrchovo zosilnenou rezonanciou), ktorá je zložitejším a menej vhodným spôsobom.Tiež sa predpokladá, že uskutočnenia predloženého opisu sa môžu implementoval na integrovanom obvode s míkrofluidikovým kanálom (alebo jamkou) použitím mikro- alebo nanokonštrukčnej technológie, v ktorej sa väzobný partner imobilizuje vjednom alebo vo viacerých mikro-fluidikových kanáloch na integrovanom obvode vyrobenom na objednávku, pričom táto technológia zahrnuje aj laser (lasery) a detektory pre Ramanovu spektroskopiu. Takéto uskutočnenie by mohla detegovat samostatné biologické komponenty, ako napríklad patologickú baktériu, proteí ny alebo genetický materiál.Takže cieľom predloženého opisu je vytvorit spôsob na detekciu cieľových biologických organizmov komponentov, ktorý využíva kombináciu chemických interakcií, zahrnujúc väzbu s finálnym krokom Ramanovho rozptylu svetla.Ďalším cieľom predloženého opisu je vytvorit spôsob na detekciu cieľových anorganických alebo organických komponentov, ktorý využíva kombináciu chemických interakcií vratane väzby s finálnym krokom Ramanovho rozptylu svetla.Vďalšom opise je cieľom spojit imunotest s detekciou za použitia Ramanovho rozptylu svetla.Ešte ďalším cieľom predloženého opisu je zvýšiť citlivosť detekcie použitím chemických činidiel, ktoré produkujú rezonančný Ramanov svetelný rozptyl.Ešte ďalším cieľom opisu je vytvoriť integrovaný obvod s mikrofluidikovými kanálmi alebo jamkami, ktorý môže uskutočňovať kombináciu viazania sa a merania Ramanovho rozptylu svetla.Tieto a ďalšie ciele a výhody predloženého opisu budú priemernému odborníkovi v oblasti techniky zrejmé po prečítaní podrobného opisu tohto vynálezu spolu s pripojenými výkresmi.O BR. 1 zobrazuje schému typickej imunotestovacej techniky (ELISA) známu z predchádzajúceho stavu techniky na detekciu biologických organizmov alebo komponentov.OBR. 2 zobrazuje schému uskutočnenia opísaného zariadenia.OBR. 3 zobrazuje schému uskutočnenia opisanej techniky na detekciu biologických organizmov a/alebo komponentov.OBR. 4 zobrazuje blokovú schému enzýmového systému na konvertovanie chemických komponentov na Ramanovu aktívnu zlúčeninu.OBR. 5 zobrazuje schému spôsobu výberu frekvencii laserového svetla na excitáciu špecifických cieľových molekúl.OBR. 6 zobrazuje mikrofluidikový kanál, určený na detekciu Ramanových aktívnych zlúčenín.OBR. 7 ilustruje zostavu mikrofluidikových kanálov, ktorá by sa mohla včlenit do integrovaného obvodu vyrobeného na objednávku.OBR. 8 zobrazuje grafy Ramanovho spektra z imunotestu spojeného s enzýmom na patogénne baktérie rodu listéria, ktorý používa protilátku s posunovými hodnotami (cm-1), vynesená na x-os, a magnitúda signálu je vynesená na osi y (ľubovoľné jednotky) pre vzorku, obsahujúcu listériu (a) a vzorku, ktorá neobsahuje listériu (b).O BR. 1 zobrazuje schému typickej imunotestovacej techniky (ELISA) 10, známej v predchádzajúcom stave techniky, na detekciu biologických organizmov alebo komponentov. Tento proces sa začína krokom 11 prípravy kvapalnej vzorky. ktorá zahrnuje cieľový biologický komponent. Táto vzorka sa napríklad môže pripraviť tak, že sa vopred obohatí v rastovom médiu,ako napríklad v polovičnom Frasierovom médiu alebo v inom vhodnom mikrobiálnom rastovom médiu. Alternatívne sa kvapalná vzorka na testovanie môže získať z akéhokoľvek kvapalného zdroja. Tuhý materiál sa môže ponorit do vhodného kvapalného roztoku a potenciálny cieľový organizmus alebo molekuly sa môžu dat do roztoku a potom sa z neho odoberú vzorky v kvapalnom skupenstve. V nasledujúcom kroku 12 sa kombinuje (alebo zmiešava) pripravená kvapalná vzorka s väzobným partnerom, ktorý je už pripojený na tuhý podklad. Typicki väzobní partneri zahrnujú protilátky, bakteriofág a bakteriofágové proteíny. Môžu sa použit napríklad plastové mikrotitračné platne, latexové guľôčky alebo magnetické mikročastice. Použiť sa môžu aj iné tuhé podklady, ako napríklad nitrocelulóza, filtračný papier, nylon a iné plasty. Kombinácia protilátka/biologický komponent sa potom inkubuje v kroku 13, aby sa poskytol čas na vzájomné naviazanie sa biologíckého komponentu a protilátky. Po vytvorení tejto väzby sa skombinovaný väzobný partner a biologický komponent dekantujú (zlejú) a premyjú, aby sa odstránili nenaviazané biologické komponenty a iné nežiaduce materiály. V kroku 15 sa pridajú nové reakčné činidlá, aby sa zvýšila citlivosť zmesi na detekciu signálnych molekúl prostredníctvom rôznych spôsobov. Príklady takýchto reakčných činidiel zahrnujú1. väzobných partnerov značených rádioaktívnymi molekulami2. väzobných partnerov značených fluorescenčnými molekulami3. konjugáty enzým/väzobný partner, skombinované s ďalšími chemickými činidlami, ktoré reagujú s cieľom vytvoriť svetlo absorbujúce molekuly4. konjugáty enzým/Väzobný partner, skombinované s ďalšími chemickými činidlami, ktoré reagujú s cieľom vytvoriť svetlo absorbujúce molekuly a5. konjugáty enzým/väzobný partner, skombinované s ďalšími chemickými činidlami, ktoré reagujú s cieľom vytvorit svetlo absorbujúce molekuly.Zmes obsahujúca naviazaného väzobného partnera/biologický komponent a nové reakčné činidlá sa inkubuje v kroku 13, aby sa poskytol čas na uskutočnenie reakcie. V tomto bode sa v mnohých prípadoch ukončí reakčná čast spôsobu 10 a môže sa uskutočniť krok 16, v ktorom samerajú molekuly vyprodukované alebo zahrnuté v krokoch 11 až 15 vrátane. Ak sú potrebné ďalšie reakčné čínidlá, kroky 14, 15 a 13 sa môžu opakovat raz alebo viackrát za sebou dovtedy, kým nie sú prítomné molekuly s vhodným signálom.Meranie signálnej molekuly (molekúl) poskytuje kvantitatívny výsledok, ktorý sa potom môže analyzovať a porovnávať v kroku 17 so známym súborom kalibrovaných reakcii známych koncentrácii cieľového biologického komponentu. Toto porovnanie vedie ku kroku 18, ktorý je kvantiñkovaným výsledkom a asociovanou správou o koncentrácii cieľového biologického komponentu vo vzorke pripravenej v kroku 11.Hoci opis spôsobu 10 podľa OBR. 1 sa spája s detekciou biologického organizmu alebo komponentu, tento spôsob 10 sa môže použit aj na detekciu mnohých iných typov molekúl, s ktorými môžu protilátky alebo iní väzobní partneri reagovať.OBR. 2 zobrazuje uskutočnenie detekčného subsystému 20 predloženého vynálezu. Laser 21 produkuje laserový lúč 22, ktorý sa zaostruje prostrednictvom zaostrovacej optiky 23 do zaostreného laserového Iúča 24, ktorý zasahuje cieľovú vzorku 25. Spätné rozptýlené svetlo 26 zo vzorky 25 sa zaostruje do lúča 28 prostredníctvom zaostrovacej optiky 27. Lúč 28 je nasmerovaný do spektrometra 30 s detektorom 31. výstupom z detektora 31 je signál 32, ktorý sa dostane do osobného počítača 40 na analyzovanie, uloženie alalebo Vytlačenie prostredníctvom tlačiarne 42. Laserom 21 je typicky laser s kontinuálnou vlnovou dlžkou (CW) s výstupom vo viditeľnom rozsahu. Napríklad argónový iónový laser, héliový neónový laser, argónový iónový laser, laser s pumpovanou laditeľnou farbou alebo diódový laser v zelenej, červenej alebo inej frekvencii. Zaostrovacia optika 23, 27 zahrnuje zrkadlá, šošovky, dúhovky, uzávierky, difrakčné mriežky a/alebo polarizátory. Cieľová vzorka 25 môže byt kvapalná, plynná alebo tuhá a v určitých uskutočneniach predloženého vynálezu by cieľová vzorka využívala kvapalinu alebo precipitovanú tuhú látku. Spektrometer 30 priestorovo separuje rozptýlené svetlo na základe vlnovej dĺžky. Príkladom spektrometra, ktorý sa môže použit v predloženom vynáleze, je Lambda Solutions model PS-1. Detektor 31 meria amplitúdu svetla priestorovo separovaného prostredníctvom spektrometra 30 a konvertuje ho na elektrický signál (analógový alebo digitálny). V určitých uskutočneniach by detektor poskytoval elektrický signál použitím štandardizovaného počítačového rozhrania ako RS 232, USB, paralel, IEEE 1394. Príkladom detektora 30, ktorý sa môže použit v predloženom vynáleze, je Lambda Solutions PS-1. Osobným počítačom 40 môže byt akýkoľvek stolový PC alebo prenosný počítač s vhodným rozhraním pre detektor 31 a so softwarom určeným na analyzovanie,ukladanie a/alebo tlačenie spektra spätne odrazeného svetla 26, ktoré sa dostalo do spektrometra 30.OBR. 3 zobrazuje diagram uskutočnenia techniky 30 podľa predloženého vynálezu na detekciu biologických organizmov a/alebo komponentov. Tento spôsob sa začína krokom 31 prípravy kvapalnej vzorky, ktorá zahrnuje cieľový biologický komponent. Napriklad sa táto vzorka môže pripraviť tak, že sa vopred obohatí v rastovom médiu, ako napríklad v polovičnom Frasierovom médiu, alebo v inom vhodnom mikrobiálnom rastovom médiu. Alternatívne sa kvapalná vzorka na testovanie môže získat z akéhokoľvek kvapalného zdroja. Tuhý materiál sa môže ponorit do vhodného kvapalného roztoku a potenciálny cieľový organizmus alebo molekuly sa môžu dat do roztoku a potom sa z neho odoberú vzorky v kvapalnom skupenstve. V nasledujúcom kroku 32 sa pripravená kvapalná vzorka kombinuje (alebo zmiešava) s protilátkou, ktorá bola pripojená na tuhý podklad. Môžu sa použit napríklad plastové mikrotitračné platne, latexové guľóčky alebo magnetické mikročastice. Kombinácia protilátka/biologický komponent sa potom inkubuje v kroku 33, aby sa poskytol čas na vzájomné naviazanie sa biologického komponentu a protilátky. Po vytvorení tejto väzby sa skombinovaná protilátka a biologický komponent dekantujú(zlejú) a premyjú, aby sa odstránili nenaviazané biologické komponenty a iné nežiaduce materiály. V kroku 35 sa pridajú nové reakčné činidlá, aby sa zvýšila citlivosť zmesi na detekciu prostredníctvom Ramanovho rozptylu svetla. Príklady takýchto reakčných činidiel zahrnujú1. protilátky značené Ramanovými aktivnymi molekulami2. konjugáty enzým/protilátka, skombinované s ďalšími chemickými činidlami, ktore zreagujú,aby vytvorili Ramanove aktívne molekuly3. Ramanove aktívne reakčné činidlá, ktoré chemicky interagujú s biologickým komponentoma 4. chemické reakčné činidlá, ktoré sa konvertujú prostredníctvom biologického komponentuna Ramanovu aktívnu molekulu.

MPK / Značky

MPK: G01N 21/65, G01N 33/543

Značky: ramanovho, rozptylu, biologických, použitím, spôsob, organizmov, detekcie

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/19-e10226-sposob-detekcie-biologickych-organizmov-pouzitim-ramanovho-rozptylu.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob detekcie biologických organizmov použitím ramanovho rozptylu</a>

Podobne patenty