Hmyzí vírus so zníženou schopnosťou šíriť sa v životnom prostredí z hostiteľa na hostiteľa a spôsob jeho výroby

Číslo patentu: 282444

Dátum: 31.12.2001

Autor: Lynn Ann Brennan

Je ešte 11 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Je opísaný hmyzí vírus so zníženou schopnosťou šíriť sa v životnom prostredí z hostiteľa na hostiteľa, ktorý je vytvorený proti hmyzu neinfekčným pozmenením miesta p74 génu kódujúceho 74kDa proteín tohto vírusu, ktorého infekčnosť je obnovená komplementáciou s funkčným génom p74 alebo kódovaným p74 proteínom príslušného vírusu divého typu, pričom hmyzia bunka nesúca tento pozmenený hmyzí vírus je prídavne transfekovaná fragmentom DNA poskytujúcim chýbajúci produkt alebo funkciu pozmeneného miesta p74 génu funkčného vírusu divého typu. Tiež je opísaný spôsob výroby tohto vírusu zahŕňajúci tieto kroky: a) zbavenie vírusu infekčnosti pre hmyz pozmenením miesta p74 génu vírusu a b) obnovenie infekčnosti vírusu komplementáciou takto pozmeneného vírusu s produktom alebo funkciou, ktoré v pozmenenom víruse chýbajú alebo sú defektné, transfekciou hmyzej bunky nesúcej tento pozmenený vírus fragmentom DNA poskytujúcim produkt alebo funkciu, ktoré chýbajú alebo sú defektné v mieste p74 génu divého typu.

Text

Pozerať všetko

Tento vynález sa týka neinfekčného hmyzieho vírusu so zmeneným genctickým základom, ktorého funkčnosť sa obnoví génovou komplementáciou, čím sa opäť pripraví forma vírusu infekčná pre hmyz. Tento vynález sa ďalej zaoberá inzerciou heterológneho gćnu do vírusovćho ge ~ nómu, pričom touto inzerciou sa dosiahne to, že vírus pro dukuje látku s potláčajúcimi alebo modiñkačnými účinkami na hmyz, a tým sa zlepší bioínsekticídny účinok a genetická stabilita žiadaných vlastnosti.V tomto opise sa používajú nasledujúce skratkyA. cal. - Autographa califomica, AMNPV - jadrový polyedrický vírus Autographa californica, bp - páry báz, ECV - extracelulámy virus, GV - granulózny vírus, kD - kilodaltony, MOI - multiplicita infekcie, NPV -jadrový polyedrický vírus, OB - oklúzne teleso, OV - okludovaný vírus, PCR - reťazová polymerázová reakcia, PDV - vírus odvodený od polyedrickćho vírusu, p. í. - po infekcii, PlB - polyedrické inklúzne teleso /znárne tiež ako OB -oklúzne teleso/, 5 UTR - sekvencia mRNA alebo génová sekvencia zodpovedajúcej oblasti, ktorá začína od štartového miesta transkripcie génu a pokračuje až k poslednej báze alebo poslednćmu páni báz, ktorá /ktorý/ predbieha iniciačný kodón pre syntézu proteínu, 3 UTR - sekvencía mRNA alebo génová sekvencia zodpovedajúcej oblasti, ktorá začína od prvej bázy alebo prvého páru báz za terminačným kodónom pre syntézu proteínu a pokračuje až k poslednej báze kódovanej génom na 3 koncí mRNA,//-vlákno - vlákno DNA génu a jeho lemujúce sekvencie,ktoré má rovnaký zmysel čítania ako RNA, ktorá je od tohto génu odvodené,/-/-vlákno - vlákno DNA gćnu a jeho lemujúce sekvencie,ktoré je komplementáme k //-vláknu.Vynález sa vzťahuje na všetky hmyzíe vírusy, včítane DNA a RNA vírusov. Medzi DNA vírusy sa zahŕňajú entomopox vírusy /EPV/ a vírusy čeľade Baculovíridae, ako sú jadrové polyedrické vírusy /NPV/ a granulózne vírusy/GV/ a podobne. Medzi RNA vírusy sa zahŕňajú togavírusy, ílavivírusy, picomavímsy, cytoplazmatické polyedrické vírusy /CPV/ a podobne. Podčeľade dvojvláknových DNA vírusov Eubaculovirinae obsahuje dva rody, vírusy typu NPV a vírusy typu GV, ktoré sú obzvlášť užitočné pre biologickú kontrolu, pretože vo svojom životnom cykle vytvárajú oklúzne telesá lOBl.V bezstavcových živočíchoch bola zistená prítomnosť viac než 400 druhov baculovímsov. Jadrový polyedrický vírus Autographa califomíca /A°MNPV/ je prototypom vírusu čeľade Baculovirídae, ktorý pôsobí na mnoho hostiteľov. A°MNPV vírus bol pôvodne izolovaný z druhu nočného motýľa Autographa califomíca /A. ca 1./, z larválneho štádia /vo svojom dospelom štádiu je tento druh nočná mora/. Larvy druhu A. cal. sú všeobecne známe ako húsenice žijúce na luceme. Vírus A°MNPV napadá 12 čeľadí a viacnež 30 druhov radu hmyzu Lepidoptera /motýle/ /Granados,R. R., a Federici, B. A., The Bíology ov Baculoviruses(Biológia baculovírusov) I, 99 /l 986//. Nie je známe, že by tento vírus účinne infikoval akýkoľvek iný druh okrem tohto radu.Použitie baculovínrsov ako bioinsekticídov je veľmi sľubné. Jednou z hlavných prekážok, ktorá bráni ich širokému použitiu v poľnohospodárstve, je časové zdržanie medzi inükovaním hmyzu a jeho smrťou. Toto zdržanie môže trvať niekoľko dní až niekoľko týždňov. Počas tohto času sa hmyz stále živí, a tým spôsobuje na rastlinách ďalšiu škodu. Rad vedcov sa snažil tento nedostatok prekonať vložením heterológneho gćnu do vírusového genómu tak,aby sa v napadnutom hmyze exprimovala riadiaca alebo pozmeňujúca látka pre hmyz, ako je toxín Tomalski, M. D., a Miller, L. K., Nature, 352, 82 - 85 /l 991/, Federici, B. A. , In Vitro, 28, 50 A /l 992/, Martens, J. W. M., a ďalší,App. Envir. Microbiology, 56, 2764 - 2770 /l 990/, neuropeptíd a hormón Menn, J. J., a Borkovec, A. B., J. Agric. Food Chem, 37, 271 - 278 /l 889/, Eldridge, B., a ďalší, Insect Biochem., 21, 341 - 351 /1892/1 alebo enzým Harrimock, B. D., a ďalší, Nature, 344, 458 - 461 /1990/.Génovć inžinierstvo poskytuje prostriedky na prekonanie technických prekážok komerčného využitia vírusov ako bíoinsekticídov, ale zároveň rastie pocit, že tu môže byť ďalšia potenciálna prekážka brániaca ich širokému prijatiu. Ide najmä o predpoklad, že uvoľnenie týchto geneticky manipulovaných vírusov do životného prostredia môže mať nepredvídateľné následky pre ekosystém, v ktorom sa tieto vírusy replikujú a šíria Williarnson, M., Nature, 353, 394/1991/, Hammock, B., Nature, 355, 119 /1992/. Tento predpoklad by sa až doteraz mohol vzťahovať na všetky rekombinačné vímsy hmyzu, vytvorené pre biologické potláčanie hmyzu, pretože všetky tieto vírusy sú schopné prenosu z hmyzu na hmyz. Preto je potrebné vytvoriť rekombinantné vímsy špecifické pre hmyz, ktoré majú zníženú schopnosť pre prenos z hmyzu na hmyz /z hostiteľa na hostiteľa/ po svojom uvoľnení do životného prostredia.Životný cyklus baculovírusov, ukázaný na príklade vírusu A°MNPV, sa skladá z dvoch štádií. V každom štádiu životného cyklu má vírus špeciñckú formu extraceluláme vírusové partikuly /ECV/, ktoré nie sú okludované a oklúdované vírusové partikuly /OV/ Luckow, V. A., a Summers, M. D., Bio/Technology, 6, 47 - 53 /l 988/, Miller, L. K., Ann. Rev. Microbiol., 42, 177 - 199 /l 988/. Extracelulárne i okludované vírusové formy majú rovnaký genóm,ale majú odlišné biologické vlastnosti. Zrenie každej z obidvoch foriem vírusu je riadené separátnymi súpravamí vírusových génov, pričom niektoré z týchto súprav sú jedinečné pre každú formu.Vo svojej prirodzene sa vyskytujúcej podobe, ínfekčnej pre hmyz, sa pomnoženć virióny nachádzajú zabalené v parakryštalickej proteínovej matrici a sú známe ako oklúzne teleso /OB/OB/ alebo tiež polyedrické inklúzne teleso/PIB/. Proteínové vírusové oklúzie sa nazývajú polyédre,mnohosteny /jednotné číslo je polyéder, mnohosten/. Hlavným štruktúmym proteínom vírusových oklúzií, ktorý je kódovaný vírusom, je polyhedrín, s molekulovou hmotnosťou 29 kD Luckow, V. A., a Surmners, M. D.,Bio/Technology, 6, 47 - 53 /l 985/, Smith, G. E., a Summers, M. D., US patent č. 4 745 051. Podobne vírusy GV vytvárajú OB, ktoré sú zložené najmä z granulínu, skôr než z polyhedrínu.Vírusové oklúzie sú dôležitou časťou prirodzeného životného cyklu baculovírusov, poskytujúcich prostriedok pre horizontálny prenos /z hmyzu na hmyz/ medzi susceptibilnými druhmi hmyzu. V životnom prostredi susceptibil SK 282444 B 6ný hmyz /obvykle v larválnom štádiu/ požerie virusovć oklúzie z kontaminovaného zdroja potravy, ako napríklad z rastliny. Kryštalíckć oklúzie sa v tráviacom trakte susceptibilného hmyzu rozpadnú, a tým sa uvoľňujú infekčné vírusovć častice. Tieto vírusy odvodené od polyedrických vírusov /PDV/ napádajú tkanivové bunky vnútomostí a replikujú sa v nich Luckow, V. A., a Summers, M. D.,Bio/Technology, 6, 47 - 53 /l 988/.Vírusové častice pravdepodobne vstupujú do bunky endocytózou alebo fúziou a vírusova DNA sa v bunke vyskytuje nezabalená v jadrovom póre alebo v jadre. Replikácia vírusovej DNA sa v bunke objaví do šiestich hodín po vstupe vírusu. V čase do 10 až 12 hodín po infekcii /p.i./ sa sekundárna infekcia rozšíri do iných hmyzích tkanív pučaním extracelulárneho vírusu /ECV/ z povrchu bunky. ECV forma vírusu je zodpovedná za šírenie vímsu z bunky do bunky v inňkovanom jedincovi hmyzu, rovnako ako za prenos infekcie v bunkovej kultúre.V neskoršej fáze infekčného cyklu / 12 hodín p.i./ sa dá v infikovaných bunkách zistiť proteín polyhedrin. Až po uplynutí 18 až 24 hodín p.i. sa v jadre infikovanej bunky proteín polyhedrín zoskupuje a vírusové častice sa zabalia do proteínových oklúzií. Počas 4 až 5 dní s postupom lýzy buniek narastá počet vírusový oklúzií do veľkých hodnôt. Tieto polyćdre nemajú aktívnu úlohu pri šírení infekcie v larve. Vírusy v ECV forme sa množia a šíria v hemolymfe,a tým spôsobujú smrť larvy Luckow, V. A., a Summers,M. D. , Bio/Technology, 6, 47 - 53 ll 988 l, Miller, L. K.,Ann. Rev. Microbiol., 42, 177 - 199 /1988/, Smith, G. E., a Summers, M. D., US patent č. 4 745 051.Ked infikované larva zahynie, v rozkladajúcom sa tkanive zostanú milióny polyédrov, zatial čo ECV formy vírusu sa rozložia. Cyklus sa opakuje, keďje iná larva vystavená vplyvu týchto polyédrov napríklad tým, že požerie kontaminované rastliny alebo inú kontaminovanú potravu Luckow, V. A., a Summers, M. D., Bio/Technology, 6, 47Súhmom sa dá povedať, že okludovanć fonny vírusu zodpovedajú za počiatočné intikovanie hmyzu prostredníctvom tráviacich ústrojov a tiež za stabilitu vírusu v životnom prostredí. PDV formy vírusu nie sú v zásade infekčné pri injekčnom podávaní, ale sú vysoko infekčné pri orálnom podávaní. Neokludovanć formy vírusu /t. j. ECV formy/ zodpovedajú za sekundárnu infekciu a prenos infekcie medzi bunkami. ECV formy vírusu sú vysoko infekčné pre bunky v kultúre alebo pre vnútomé hmyzie tkanivovć bunky, ak sú do nich vpravené injekciou, ale nie sú v zásade infekčné pri orálnom podávaní.Použitie rekombínantných baculovirusov, ktoré exprimujů cudzie proteíny, toxické pre hmyz, je uľahčenć tým,že tieto vírusy nie sú patogénne pre stavovce alebo rastliny. Okrem toho môžu baculovírusy všeobecne napádať úzky okruh hostiteľov. Mnoho kmeňov parazituje iba na jednom druhu hmyzu alebo na niekoľkých hmyzích druhoch.Najskúmanejším baculovírusom je A°MNPV vírus. Je známe, že vírus A°MNPV infikuje 12 čeľadl a viac než 30 druhov hmyzieho radu Lepidoptera /motýle/ Granados, R. R., a Federicí, B. A., The Biology of Baculoviruses (Biológia baculovírusov) l I, 99 /l 986/. Nie je známe, že by tento vírus mohol účinne infrkovať akýkoľvek iný druh okrem tohto radu. Verejnosť i rôzne úrady diskutovali o možných následkoch, ktoré by malo uvoľnenie kmeňa A°MNPV, obsahujúceho cudziu sekvenciu DNA Wílliamson, Nature,353 394 ll 99 ll, Rammock, B., Nature, 355, 119 /l 992/. Diskusia sa týka možnosti, že by sa manipulovaný vírus mohol rozšíriť i na iné druhy radu Lepidoptera, proti kto rým nebol určený. Ďalším uvažnvaným faktorom je známa stabilita týchto vírusov v životnom prostredí.Preto je potrebné vytvoriť rekombinantuý vírus špecifický pre určitý hmyz, so zníženou schopnosťou šíriť sa z hmyzu na hmyz (z hostiteľa na hostiteľa). Tieto vírusy by mali byť schopné inñkovať hmyz, ale mali by mať významne zníženú schopnosť prenosu z hmyzu na hmyz, a tým aj schopnosť udržať sa v životnom prostredí.Predmetom vynálczu je hmyzí víms so zníženou schopnosťou šíriť sa v životnom prostredi z hostiteľa na hostiteľa, ktorý je vytvorený proti hmyzu neinfekčným pozmenením miesta p 74 génu kódujúceho 74 kDa proteín tohto vírusu, ktorého infekčnosť je obnovené komplernentáciou s funkčným gćnom p 74 alebo kódovaným P 74 proteínom príslušného vírusu divćho typu, pričom hmyzia bunka nesúca tento pozrnenený hmyzí vírus je prídavne transfekovaná fragmentom DNA poskytujúcim chýbajúci produkt alebo íirnkciu pozmeneneho miesta p 74 génu funkčného vírusu divćho typu.Okrem toho je predmetom vynálezu aj spôsob výroby tohto vírusu, ktorého podstata spočíva v tom, že zahŕňa tieto kroky a) zbavenie vírusu infekčnosti pre hmyz pozrnenením miesta p 74 génu vírusu a b) obnovenie infekčnosti vírusu komplementáciou takto pozmenenćho vírusu s produktom alebo funkciou, ktoré v pozmenenom víruse chýbajú alebo sú defektnć, transfekciou hmyzej bunky nesúcej tento pozmenený vírus fragmentom DNA poskytujúcim produkt alebo funkciu, ktoré chýbajú alebo sú defektné v mieste p 74 génu divćho typu.Vynàlez sa teda týka konštrukcie a pestovania rekombinanlných vírusových kmeňov proti hmyzu, ktoré majú zníženú schopnosť šíriť sa z hmyzu na hmyz, t.j. majú zníženú schopnosť prenosu medzi hostíteľmi v životnom prostredí. Vírusy čeľade Baculoviridae sú obzvlášť vhodné na konštrukciu takých kmeňov, vzhľadom na dve štádia svojho životného cyklu, ako je to opísané v texte.Tieto vírusovć kmene sa získajú tak, že sa najprv zmeni genetický základ takým spôsobom, že vírus sa stane pre hmyz neinfekčným. Termín genetický základ neznamená v kontexte tohto vynálezu iba gény, ktoré kódujú trans-pôsobiace látky, ako sú DNA alebo proteínové molekuly,ale zahŕňa i cis-pôsobiace elementy alebo regulačná sekvencie, ako sú translcripčné enhacery, promótory, iné transkripčné, translačné a replikáciu genómu riadiace elementy a baliace sekvcncie vírusovej DNA /alebo RNA/.Zmena genetického základu môže mať podobu delécie,posunu čítacieho rámca, inzercie, prešmyku, bodovej mutácie, alebo iného porušenia funkcie génu. Iné formy zmeny zahŕňajú spôsoby, ktoré zabraňujú fungovaniu vímsu, ako je potlačenie transkripcie alebo translacie, použitie antikodónovej RNA, inzercia prídavného génovćho elementu a inzercia prídavného regulačného elementu, ako je napríklad kvasinková alctivačrrá sekvencia, nachádzajúca sa pred cieľovým génom, ktorá vyžaduje prítomnosť GAL 4 proteínu pre svoju aktivitu IUASGALI.Cieľ obnoviť infekčnosť rekombínantného vírusu, pričom prenos z hostiteľa na hostiteľa je významne znížený,sa dosiahne komplcmentáciou gćnov produktom alebo funkcií, ktoré v zmenenom víruse chýbajú alebo sú defektné.Tento vynález zahŕňa rôzne spôsoby produkcie infekčnej podoby rekombinantného hmyzieho vímsu komple SK 282444 B 6mentáciou génov, a to /1/ produkciu infekčného rekombínantného vírusu v kultúre tkanivových buniek hmyzu,transfekovanýeh fragmentom DNA, poskytujúcim produkt alebo funkciu, ktoré v zrnenenom viruse chýbajú alebo sú defektne /2/ produkciu infekčného rekombinantného vírusu v líniáeh buniek hmyzu, ktoré bolí stabilne transformované ñagmentom DNA, poskytujúcim produkt alebo funkciu, ktoré v zmenenom víruse chýbajú alebo sú defektné/3/ produkciu infekčného rekombinantného vírusu v transgénnych jedincoch hmyzu, ktoré obsahujú fragment DNA,poskytujúci produkt alebo funkciu, ktoré V zrnenenom víruse chýbajú alebo sú defektné.V závislosti od poskytnutého produktu alebo funkcie môže byť nutné alebo žiaduce použil heterológny vírusový alebo bunkový promótor na riadenie expresie daného DNA fragmentu. Použitie promótora môže byť vynútené ohľadmí na dávkovanie alebo času.Bunky hmyzu používané na spôsob prípravy infekčného rekombinantného vírusu podľa spôsobu /l/ a /2/ a transgćnne dmhy hmyzu podľa spôsobu /3/ ftmgujú teda ako pomocníci pri obnove infekčnosti vírusu. Vírusové častice /virióny/ pripravené podľa týchto spôsobov spôsobujú infekciu, ak sú v prírode požité hmyzom. Virióny utvorené V infikovaných larvách sú defektné, pretože nie sú komplementované, a infekcia sa preto nešíri ľahko na iné jedince hmyzu. V neprítomnosti koinñkujúceho divého vírusu preto životný cyklus rekombinantného vírusu končí po tejto jedinej infekcii.Pri prednostnej aplikácii tohto vynálezu sa do vírusovćho genómu vloží gén, kódujúci látku, ktorá má riadiace alebo modifikačné účinky na hmyz. Tento gén sa vloží na akékoľvek vhodné miesto do genómu zrneneného vírusu. Látkami, ktoré majú riadiace alebo moditíkačné účinky na hmyz, môžu byť toxíny, neuropeptidy, hormóny a enzýmy. Expresía takej látky zvyšuje bioinsekticídny účinok.Vhodné je najmä, ked sa tento gén vloží priamo do miesta zmeny genetického základu, ktoré zodpovedá za zníženú schopnosť prenosu z hostiteľa na hostiteľa alebo na pozíciu, ktorá s týmto miestom susedí. Vloženie heterolúgneho génu do miesta zmeny genetického základu alebo do jeho blízkosti zabraňuje alebo veľmi obmedzuje rekombínáciu génov, ktorá by mohla dať vzniknúť forme daného vírusu, majúcej fenotyp divej podoby vírusu í gén s potlačajúcimi účinkami na hmyz alebo modífrkačný gén pre prenos z hostiteľa na hostiteľa.Prehľad obrázkov na výkresochObr. 1 zobrazuje líneárnu mapu známych baculovírusových génov AMNPV genómu Blissard, G. W., a Rohrmann, G. F., Ann. Rev. Entomol., 35, 127 - 155 /l 990/.Obr. 2 ukazuje detail konštrukcie plazmidu p 74-l, ktorý obsahuje deléciu v p 74 géne z vírusu A°MNPV.Obr. 3 ukazuje detail delécie v p 74 géne /v plazmide p 74/ z vírusu A°MNPV, z kmeňa A 4000.Obr. 4 ukazuje reštrikčnú mapu časti expresného vektora zo sérií PMEV, na ktorej je zobrazený promótor, polylinker a oblasť 3 UTR.Nasleduje podrobný opis vynálezuVýsledkom genetickej manipulácie vírusu hmyzu so zníženou schopnosťou šíriť sa z jedného jedinca hmyzu na iného je zvýšená rýchlosti vymiznutia infekčného vírusu z prostredia, presahujúca rýchlosti prirodzených procesov abiotickej a biotickej degradácie. Preto sa manipulovaný vírus sám nepresadí v životnom prostredí.Tento vynález sa týka všetkých vírusov hmyzu včítane DNA a RNA vírusov. DNA vírusy zahŕňajú vírusy obsahujúce zabalenú dvojvláknovú DNA, ako napríklad /najprv uvedená čeľaď, potom druh/ Entomopnxvirinae poxvírus radu coleoptera /chrobáky/L Eubaculovirinae /Autagrapha california MNPV Heliacoverpa zea SNPV/, Nudibaculovirínae /Helíacoverpa zea NOB/, Ichnovírus /Campaletís sanarenszls vírus/, a Bracovims /Cotesi sia melanoscela vírus/ a tiež vírusy obsahujúce nezabalenú dvojvlákríovú DNA, ako napríklad Irídovírídae /Chilo irideseent vírus/, a vírusy obsahujúce nezabalenú jednovláknovú DNA, ako napríklad Parvaviridae /Galleria densovirus/.RNA vírusy zahŕňajú vírusy, obsahujúce zabalenú dvojvláknovú RNA, ako napríklad Tagaviridae /Sindbis vírus/, Bunyaviridae /repný virus krútenia listov/ a Flaviviridae /W esselbron vírus/ a tiež vírusy obsahujúce nembalenú dvojvlálmovú RNA, ako napríklad Reovirídae /Corriparta virusl, a Bimaviridae /Drosophila X vírus/, a tiež vírusy obsahujúce nezabalenú jednovláknovú RNA, ako napríklad Pícarnavírídae /Cricket paralysis virus/, TetravíridaePodčeľa vírusov obsahujúcich dvojvlálmovú DNA,Eubacu/ovirinae, obsahuje dva rody, jadrové polyedrické vírusy /NPV/ a granulózne vírusy /GV/, ktoré sú obzvlášť užitočné na biologické potláčanie, pretože vo svojom životnom cykle tvoria oklúzne telesá. Príklady NPV vírusov sú Lymantría dispar NPV /NPV vírus červenej motyl,Autograph califbmica MNPV, Anagrapha falczjľera NPV/NPV vírus piadivky zelerovej/, Spadoptera litturalis NPV,Spodoptera frugiperda NPV, Heliothis armígera NPV,Mamestra brassicae NPV, Choristoneurafirmiferana NPV,Trichoplusia m NPV, Heliocoverpa zea NPV, Rachíplusia ou NPV atď. Pňklady GV vírusov sú Cydia pomoneíla GV/vírus kukuričnej mory/ atď. Príklady entomopox vírusov sú Melolontha melolontha EPV, A msacta maorei EPV, Locusta mígrataria EPV, Melanaplus sanguinipes EPV,Schistacercu gregaría EPV, Aedes aegypti EPV, Chironomus luridus EPV atď.Použitím tohto vynálezu sa docieli ochrana poľnohospodárskych plodín, stromov, krov, sadov a okrasných rastlín pred útokom hmyzu, obzvlášť hmyzu z radu Lepídoptera, Orthoptera, Díptera, lsoptera, l-Iymenoptera, Homoptera, Hemiptera a Coleoptera.Aj ked vynález je ilustrovaný na príklade vírusu NPV IA°MNPVI pre druh Autographa ealifomica, je samozrejmé, že tu opísané námety sa dajú použiť pre všetky uvedené hmyzie vírusy. Ďalej sa predpokladá, že tento vynález bude veľmi užitočný pri zlepšovaní nových hmyzích vírusov, ktorć doteraz neboli identiíikované a klasiñkované v literatúre.Výsledkom infekcie vírusom A°MNPV je najprv tvorba pučiacej formy vírusu, ktorá je známa ako ECV. ECV forma spôsobuje šírenie vírusu z bunky do bunky v napadnutom jedincovi hmyzu a tiež počas rastu v bunkovej kultúre. V prípade vírusov NPV začne inííkovaná bunka v neskoršej fáze infekčného cyklu tvoril PDV formu vírusu. PDV forma je zabalené v kryštalickom oklúznom telese /OB/, ktoré sa tiež niekedy nazýva polyedrickć inklúzne teleso /PIB/./Podobne GV vírusy tvoria OB, ktoré sa skladajú hlavne z proteínu granulínu, skôr než z polyhedrínu/ Túto PDV forma vírusu spôsobuje počiatočnú infekciu hmyzu vnútornosťami a tiež stabilitu vírusu V životnom prostredí.Taká zmena funkcie, ktorá spôsobuje tvorbu intaktných infekčných OB, ktorá neovplyvňuje pučiacu fonnu vírusuVo víruse A°MNPV boli nájdené také mutácie, Partington, S., a ďalší, Virology, 175, 91 - 102 /l 990/. Po uskutočnení mnohých mutačných pokusov boli identiíikované génové lokusy, ktoré spôsobujú tvorbu pučiacej formy vírusu, ale nezodpovedajú za tvorbu intaktných infekčných polyédrov. Jedným z najzaujímavejších potenciálne užitočných lokusov, ktorý bol identiñkovaný, je p 74 gén, nachádzajúci sa v Hind Ilí fragmente P genómu vírusu A°MNPV Kuúo, J., a ďalší, Virology, 173, 759 - 763/1989/1. p 74 je proteín produkovaný v neskoršej fáze infekcie baculovírusom a v relatívne malých množstvách Kuzio, J., a ďalší, Virology, 173, 759 - 763 /1689/1.Homológne sekvencie p 74 génu boli identiñkované v iných NPV vírusoch, včítane Choristoneura fumeíferana NPV Hill, J. E., a ďalší, Biochimica et Biophysica Acta,1172, 1 - 2/1993/ a Orgyia pseudotsugata NPV Leisy, D. J. , a ďalší, Virology, 153, 157 - 167 /l 986/. Homológna sekvencia génu p 74 by sa mala vyskytovať vo všetkých druhoch rodu NPV. Vzhľadom na podobnosti medzi životnými cyklami NPV vírusov a živolnými cyklarni vírusov príbuzného rodu granulóznych vírusov /GV/ je veľmi pravdepodobné, že tieto GV vírusy obsahujú gén s vlastnosťami podobnými génu p 74.Výsledkom rozsiahlych delécií, ktorými sa odstráni tento p 74 gén a susedný pl 0 gén, je vírus tvoriaci polyédre,ktoré však, ak sú súčasťou potravy lariev, nepôsobía infekčne. Pretože výsledkom delécie iba v géne pl 0 je tvorba orálne infekčných polyédrov, predpokladá sa, že uvedená zmena fenotypu je spôsobená deléciou génu p 74 Kuzio, J.,a ďalší, Virology, 173, 759 - 763 /1989/1.Ako je opísané ďalej v texte, v príklade l, bol vytvorený transferový vektor pomenovaný Ap 74-ll, ktorý po rekombinacii s genómom vímsu divého typu spôsobí deléciu v samotnom géne p 74 /Ap 74/ /obr. 3/. Vzorky E. coli kmeňa HBl 0 l, nesúce tento transferový Vektor Ap 74-l, boli uložené 21. mája 1992 v Americkej zbierke typov kultúr,/American Type Culture Collection/ 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, a dostali ATCC prírastkové číslo 68 988. 21. mája 1992 boli v tejto zbierke uložené tiež vzorky A°MNPV kmeňa označeného A 4000 /v tomto kmeni je gén p 74 poškodený delécioul, ktorý dostal ATCC prírastkové číslo VR 2373.Je potvrdené a opísané v príklade 2 ďalej v texte, že je to prave delécía DNA segmentu, kódujúceho p 74 gén, ktorá spôsobuje tvorbu PIB telies neinfekčných pre larvy, ktoré ich požijú. Stále sa však tvori pučiaca forma vírusu, a tá pôsobí infekčne, ak je injekciou vpravená do hemocoelu hmyzu.Jednoduchá delécia DNA segmentu nie je jediným typom zmeny, používaným na porušenie funkcie cievového genetického základu vírusu. Na účely toho vynálezu termín genetický základ neznamená iba gény, ktoré kódujú trans-pôsobiace látky, ako sú RNA alebo proteínové molekuly,ale zahŕňa aj cis-pôsobiace elementy alebo regulačné sekvencie, ako sú transkripčné enhacery, promótory, iné transkripčné, translačné a replikáciu genómu riadiace elementy a baliace sekvencie vírusovej DNA /alebo RNA/.Zmena môže mať tiež podobu posunu čítacieho rámca,inzercie, preskupenia génov, bodovej mutácie alebo iného porušenia funkcie génu. Do tohto súpisu spadá posun čitacieho rámca, ktorý spôsobí buď predčasné ukončenie tvorby proteínu, alebo tvorbu zmeneného nefunkčného proteínu. Ďalej tento vynález zahŕňa inzerciu terminačného kodónu do oblasti génu kódujúcej proteín a vsadenie génu prevhodnú snpresorovú tRNA do pomocnej helper bunkovej línie.lné formy zmeny genetického základu zahŕňajú spôsoby, ktoré zabraňujú fungovaniu vírusu, ako je potlačenie translcripcie alebo translácie, použitie antikodónovej RNA,inzercie prídavného génového elementu do virusového genómu a poskytnutie žiadaného regulačného elementu pre trans-pôsobiace látky. Príkladom tohto spôsobu je použitie kvasinkovej aktivačnej sekvencie, uloženej pred cieľovým génom, závislej od GAL 4 proteínu IUASGAIJ.Vloženie tejto kvasinkovej sekvencie, aktivovanej proteínom GAL 4 IUASGAJ, pred cielový vírusový gén spôsobí, že transkripcia virusového génu je závislá od prítomnosti GAL 4 proteínu. Pomocná bunkovú línia lhelper/ obsahuje kódujúcu oblasť pre GAL 4 gén pod kontrolou jedného z heterológnych promótorov, opísaných v texte. Tento vynález zahŕňa aj iné možné UAS elementy, ako sú napríklad UAS elementy vyskytujúce sa pri párovaní /matlng/ kvasiniek. Ďalej tento vynález zahŕňa sekvencie regulačných elementov, ktoré vyžadujú naviazanie proteínu pre svoju aktiváciu, ako sú receptory pre steroidy a ich väzbové miesta v DNA.Vynález sa tiež vzťahuje na použitie promótorov, ktoré fungujú iba v prítomnosti špecifických proteínov. Príkladom takého promótora je T 7 promótor bakteriofàgu T 7,ktorý na začatie transkripcie vyžaduje T 7 špecifickú RNA polymerázu. Vloženie T 7 promótora pred p 74 gén na miesto jeho prirodzeného promótor spôsobí, že transkripcia virusového génu je závislá od prítomnosti T 7 RNA polymerázy. Banková línia helper pre tento vírus obsahuje gén pre T 7 RNA polymerázu pod kontrolou heterológneho promótora, ako je IE-l vírusový promótor.Okrem génu p 74 a jeho funkčných homológov sa môžu zmeniť funkcie prídavných génov, čo spôsobí zamedzenie šírenia rekombinantného vírusu /napnklad 14/. Z tohto hľadiska sú obzvlášť užitočné gény ovplyvňujúce funkcie, nevyhnutné pre tvorbu intaktných infekčných OB. Príklady týchto génov sú génový element, riadiaci reguláciu preplnania /switch/ z tvorby ECV na tvorbu OB, gén kódujúci funkciu žiadanú pre priame zoskupovanie alebo zrenie vírusovej častice a gén kódujúci štruktúrny proteín vírusovej častice.Ďalšími príkladmi génov, ktoré sa môžu meniť podľa tohto vynálezu, sú gény, ktoré tvoria FP /few polyhedra, t. j. malé množstvo polyédrov/ mutanty, ako je 25 K gén Beames, B., a Surnrners, M. D., Virology, 168, 344 - 353/1989/, a tiež gény, ktorých funkcia po ich porušení vedie k vzniku žiadaného fenotypu, ako sú vírusové transkrípčné faktory špecifické pre fungovanie neskorých a veľmi neskorých génov, gény pre polyedrické obalové proteíny /s hmotnosťou 32 až 36,5 kD/, gén pre PDV proteín, ktorý interaguje s receptorom v tráviacich ústrojoch a je zodpovedný za počiatočné inñkovanie buniek tráviacich ústrojov,gén alebo génový element zodpovedný za zoskupovanie PDV nukleokapsidu, gén zodpovedný za organizáciu polyédra a gén kódujúci NPV funkčný ekvivalent virusového zosilňovacieho /enhancíng/ faktora Gallo, L. G., a ďalší, J. Invertabrate Path., 58, 203 - 210 /1991/, ktorý bol nájdený v GV vimsoch.Aj keď na zmenu genetického základu je tiež možné použiť gén pre polyhedrín, existujú pre toto použitie významné praktické obmedzenia. Výsledkom vysokej rýchlosti transkripcie/translacíe génu pre polyhedrín, spojenej s veľkou ampliíikáciou virusového genómu, ktorá sa odohráva pIĺ replikaeii vírusu, je fakt, že množstvo proteínu polyhedrínu dosahuje 50 až 75 celkového množstva farbiteľných proteínov v napadnutej bunke. Toto veľké množstvo proteínov môžc spochybniť možnosť, aby obmedzené množstvo extravírusových kópií génu pre polyhedrín kompenza

MPK / Značky

MPK: C12N 7/01, A01N 63/00

Značky: hmyzí, schopnosťou, šíriť, životnom, výroby, hostiteľa, spôsob, prostředí, zníženou, virus

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/19-282444-hmyzi-virus-so-znizenou-schopnostou-sirit-sa-v-zivotnom-prostredi-z-hostitela-na-hostitela-a-sposob-jeho-vyroby.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Hmyzí vírus so zníženou schopnosťou šíriť sa v životnom prostredí z hostiteľa na hostiteľa a spôsob jeho výroby</a>

Podobne patenty