Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Sú opísané vektory, DNA-vakcíny a génové terapeutiká, ktoré obsahujú uvedené vektory, spôsoby prípravy vektorov a DNA-vakcín, a génových terapeutík, ktoré obsahujú vektory, a terapeutické použitie uvedených vektorov. Konkrétne sú opísané vektory, ktoré obsahujú (a) expresnú kazetu génu NAP (nuclear anchoring protein), ktorá obsahuje (i) DNA väzbovú doménu schopnú viazať sa na špecifickú sekvenciu DNA a (ii) funkčnú doménu schopnú viazať sa na jadrovú zložku, a (b) multimerizovanú sekvenciu DNA tvoriacu väzbové miesto pre kotvový proteín NAP a prípadne (c) jednu alebo viac expresných kaziet požadovanej sekvencie DNA. Tiež sú opísané vektory, ktoré nemajú papilomavírusový začiatok replikácie. NAP môže byť E2 proteín bovinnéhoo papilomavírusu typu 1 alebo jadrový antigén 1 vírusu Epstein-Barrovej. Tiež sú opísané vektory, ktoré nemajú začiatok replikácie funkčný v cicavčích bunkách a spôsoby expresie požadovanej sekvencie DNA u konkrétneho subjektu.

Text

Pozerať všetko

Predložený vynález sa týka nových vektorov, DNA-vakcín a génových terapeutik, ktoré obsahujú uvedené vektory, spôsobov prípravy vektorov a DNA-vakcín a génových terapeutík, ktoré obsahujú vektory a terapeutických použití uvedených vektorov. Konkrétne sa predložený vynález týka nových vektorov, ktoré obsahujú (a) expresnú kazetu génu NAP (nuclear anchoring protein), ktorá obsahuje (i) DNA väzbovú doménu schopnú viazať sa na špecifickú sekvenciu DNA a (ii) funkčnú doménu schopnú viazať sa na jadrovú zložku,a (b) multimerizovanú DNA tvoriaciu väzbové miesto pre kotvový proteín NAP, a prípadne (c) jednu alebo viac expresných kaziet požadovanej sekvencie DNA. Najmä sa však predložený vynález týka vektorov, ktoré nemajú papilomavírusový začiatok replikácie. Predložený vynález sa týka tiež vektorov, ktoré nemajú začiatok replikácie funkčný V bunkách cicavcov. Ďalej sa predložený vynález týka spôsobov expresie požadovanej sekvencie DNA u konkrétneho subjektu.Doteraj ší stav technikyPrenos autologných a heterologných génov do zvieracích alebo ľudských organizmov vhodnými vektormí je žiaduci ako technika s veľkým potenciálom liečby ochorení s genetickým pozadím alebo k prevencii, alebo liečbe infekčných ochorení. Vyvinulo a testovalo sa na zvieratách a ľuďoch niekoľko typov vírusových a nevírusových vektorov na účely dodania génu/ov, ktoré sú defektívne vďaka mutáciám, a teda nefunkčné. Príklady takýchto vektorov zahŕňajú adenovirusové vektory, herpesvírusové vektory, retrovírusové vektory, lentivírusovć vektory, adeno-asociovanć vektory.Vakcinácia je vysoko účinná a ekonomická metóda prevencie ochorení spôsobených infekčnýrni činidlami. Od dôb, kedy bola zavedená aplikácia oslabeného vírusu vaccinie proti vírusu varioly, sa vyvinulo a zaviedlo do rutinnej praxe nmoho vakcín proti mnohým ľudským patogénom V súčasnej dobe sa vakcináciami variola úplne odstránila a to isté sa očakáva v krátkej dobe pri poliovíruse. Vakcináciami je možné zabrániť niekoľkým detským ochoreniam ako napr. čiememu kašľu, dittérii a tetanu.Všeobecne patria medzi najúspešnejšíe vírusové vakcíny živé avirulentné mutanty vírusov spôsobujúcich ochorenia. Kľúčom k úspechu tohto prístupu je fakt, že živé vírusy zasahujú rovnaký orgán, rovnaký typ a podobný počet buniek, a teda rozmnožením u recipienta vyvolávajú dlhotrvajúcu imunitnú odpoveď bez spôsobenia ochorenia alebo spôsobenia len ľahkého ochorenia. V skutočnosti vakcíny s oslabenýrn vírusom produkujú subklinickú infekciu, čo je vlastne individuálna imunizácia. V dôsledku toho dochádza k vyvolaniu plnej imunitnej odpovede, vrátane humorálych, bunkových a prirodzených odpovedi, čím dochádza k dlhotrvajúcej imunitnej ochrane proti patogénu niekedy aj na celý život.Aj keď vakcíny s oslabeným vírusom sú najúčinnejšie, môžu mať škodlivé vedľajšie účinky. Teda vakcíny s oslabeným vírusom môžu virulentný kmeň revertovať alebo V prípadoch, kedy oslabený vírus je apatogénny u dospelých, môže u detí alebo slabých jedincov spôsobiť ochorenie, čo je v prípade vírusov spôsobujúcich chronické infekcie, napr. vírus ľudskej irnunodeñciencie typu 1 alebo 2, realitou. Vakcíny skladajúce sa z vírusových alebo bakteriálnych proteínov alebo imunogénnych peptidov majú menšiu pravdepodobnosť vedľajších účinkov, ale nemusia byť tak účinné ako vakcíny so živými vírusmi, čo je konkrétne prípad vakcín proti mikróbom spôsobujúcim chronické infekcie, napr. určité vírusy a intraceluláme baktérie.Ale sila a charakter imunitnej odpovede závisí od toho, akým spôsobom sú spracované vírusové proteíny a v akej forme sa predložia imunitnému systému, konkrétne bunkám predkladajúcim antigén (APC), napr. makrofágy a dendritické bunky. Proteínové a peptidové antigény sa vychytávajú APC cndocytózou, spracúvajú sa na male imunogénne peptidy endosomálnym systémov a predkladajú sa T-lymfocytom(T-bunky) antigény HHS (hlavný histokompatibilný systém) triedy II. (u ľudí HLA (ľudské leukocytáme antigćny) triedy II.). Na rozdiel od proteínov syntetizovaných de novo v APC alebo možných cieľových bunkách pre imunitnú odpoveď sa budú spracovávať cetoplazmatickým systémom a predkladať T-bunkám antigény HHS triedy I. (u ľudí HLA triedy 1.). Všeobecne predloženie imunogénnych peptidov systémov triedy II. vedie k aktivácii pomocných/indukovaných T-buníek, a to zase vedie k aktivácii B-buniek a protilátkovej odpovedi. Na rozdiel od predloženia systémom HHS triedy I., ktoré vedie k indukcii Cytotoxických T-lymfocytov (CTL), ktoré sú schopné rozoznať a zničiť bunky infikované vírusom.Na začiatku 90-tych rokov sa zaviedla metóda spočívajúca V napodobení antigénového spracovania a predloženia, ktoré sa inak normálne dosahovalo vakcínami s oslabeným vírusom Ulmer, J .B. et al. Science 259( l 993)l 745-1749. Ukázalo sa, že injekcia eukaryotických expresných vektorov vo forme kruhovej DNA do svalu indukuje vychytávanie tejto DNA svalovými bunkami (a pravdepodobne ďalšími) a tieto vektory sú schopné indukovať expresiu požadovaného génu a vyvolať imunitnú odpoveď, najmä potom bunkovú odpoveď vo forme CTL, na proteín kódovaný vloženým génom. V dôsledku tohto objavu sa DNA imunizácia stala štandardnou metódou, ako indukovať imunitné odpovede na cudzorodé proteíny pri experimentoch na zvieratách a ľuďoch, pričom niekoľko DNA-vakcín je v štádiu príprav.Všeobecne obsahujú DNA-vektory používané pri týchto štúdiách klonovacie miesto pre požadovaný gén,silný vírusový promótor, napr. okamžitý skorý promótor (immediate early promoter) CMV vírusu, kvôli riadeniu expresie požadovaného génu, polyadenylačnú oblasť, a gén rezistentný proti antibiotiku a bakteriálny začiatok pre propagáciu DNA-vektora (plazmid) V bakteriálnych bunkách.Vďaka uvedeným vektorom je možné dosiahnuť detekovateľné hladiny expresíe požadovaného génu po aplikácii vektora experimentálnym zvieratám alebo ľuďom bud priamou injekciou do svalu alebo do kože technikou ostreľovania časticami, alebo aplikáciou vektora v roztoku priamo do mukóznych membrán. Ale expresía získaná týmito vektormi má krátke trvanie, vektory majú tendenciu sa pozvoľna vytrácať z transfektovaných buniek a neprenesú sa do dcérskych buniek pri delení bunkovej populácie. Krátkodobé expresia požadovaného génu a lirnitovaný počet zasiahnutých buniek sú pravdepodobne hlavnými dôvodmi, vďaka ktorým sa pozoruje len dočasná imunitná odpoved u subjektov imunizovaných DNA-vektormi, ktoré sú opísané. Boyer et al. napr. pozoroval len dočasné imunitné odpovede na HIV-1 Env a Rev u ľudských subjektov,ktoré sa niekoľkokrát imunizovali vektororn, ktorý je uvedený Boyer, J .D., J. Infect Dis. (2000) 476-4831Existuje rastúci záujem o vývoj nových produktov použiteľných v génovej terapii a DNA-vakcinácii. Predpokladá sa, že napríklad papilovavírusové vektory nesúce expresnú kazetu pre požadovaný gén budú použiteľnými kandidátrni.K dnešnému dňu bolo identifikovaných viac než 70 podtypov ľudských papilomavírusov (HPV) a mnoho rôznych zvieracích papilomavírusov zur Hause, H. and de Vílliers E., Annu Rev Microbiol 48(l 994)427-447 Bernard, H., et al., Curr Top Mícrobiol Immunol 186(1994)33-54. Všetky papilomavírusy majú podobnú organizáciu genómu a umiestnenie všetkých translačných otvorených čítacich rámcov (ORF) je veľmi konzervatívne.Papilomavírusy inñkujú skvamózne epitelálne bunky kože alebo mukózu v rôznych častiach tela a indukujú tvorbu benígnych nádorov, ktoré môžu v niektorých prípadoch postupovať až do zhubného bujnenia. Genómy papilomavírusov sa replikujú a udržiavajú v infikovaných bunkách ako viackópiové jadrové plazrnidy. Replikácia, epizomálne udržanie, expresia neskorých génov a skompletovanie vírusu sú tesne zviazané s diferenciáciou epiteliálneho tkaniva epizomálna replikácia papilornavírusovej DNA sa uskutočňuje v priebehu iniciálnej ampliñkačnej replikácie a druhej, t. j. latentnej, a tretej, t. j. vegetatívnej replikácie pri diferenciácii epitelu Howley, P.M. Papilomavirinae the Viruses and their replication. In Virology, Fields, B.C.,D.M., Howley, P.M., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, USA, 1996, 2. Edition, 2045-2076.Preukázalo sa, že dva vírusové faktory kódované E 1 a E 2 čítacími rámcami sú nutné a dostatočné pre iniciáciu replikácie DNA z papilomavírusového začiatku v bunkách Ustav, M. and Stenlund, A., EMBO J 10(199 l)449-57 Ustav, M., et al., EMBO J 10(1991)432 l-4329 Ustav, E., et al., Proc Natl Acad Sci USA 90(1993)898-902.Boli identiñkované funkčné začiatky pre iniciáciu replikácie DNA pre BPVl Ustav, M., et al., EMBO J 10(l 991)4321-4329, HPVla Gopalikrishnan, V. and Kha, S., supra, HPVll Russell, J., Botchan, M., J Virol 69(1995)651-660, HPV 18 Svedrup, F. and Khan, S., J Virol 69(1995)1319-1323 Svedrup, F. and Khan, S., J Virol 68(1994)505-509 a mnoho ďalších. Charakteristicky majú všetky tieto pôvodné fragmenty vysoký obsah A/T a obsahujú niekoľko prekrývajúcich sa individuálnych rozpoznávacích sekvencií pre El proteín Ustav, M., et al., EMBO J 10(1991)4321-4329 Holt, S., et al., J Virol 68(1994)l 094-1102 Holt, S. and Wilson, V., J Virol 69(l 995)6525-3652 Sedrnan, T., et al. J Virol 71(1997)2887-2996. Navyše tieto funkčné fragmenty začiatkov obsahujú E 2 väzbové miesto, ktoré je vo väčšine prípadov esenciálne pre iniciáciu replikácie DNA in vivo (Ustav, E., et al., supra). E 2 proteín uľahčuje prvý krok rozpoznania začiatku pomocou E 1. Po iniciálnej väzbe monomérneho E 1 na začiatok sa spustí multimerizáia E 1, čo vedie k tvorbe komplexu s aktivitou ori ku tkanivu. Preukázalo sa, že E 2 nemá vplyv na nasledujúce štádiá iniciácie replikácie DNA Lusky, M., et al., Proc Natl Acad Scz USA 91(1994)8895 ~ 8899.BPVl E 2 ORF kóduje tri proteíny, ktoré pochádzajú z použitia selektívneho promótora a altematívneho zostrihu mRNA. Lambert, P., et al., Annu Rev Genet 22(1988)235-238. Všetky tieto proteiny môžu navzájom tvorit homodiméry a hetrodirnéry a špecificky sa viazať na 12 hp prerušenú palindrórnnu sekvenciu 5 ACCNNNNNNGGT-3 Androphy, E., et al., Nature 325(1987)70-739.Existuje 17 E 2 väzbových miest v genóme BPVl a až štyri miesta v genómoch HPV, ktoré majú kruciálnu úlohu pri iniciácii replikácie vírusovej DNA (Ustav, E., et al., supra) a pri regulácii expresie vírusového génu (Howley, P.M., Papilomavirinae the Viruses and their replication, in Virology, Fields, B.C., Knipe,D.M., Howley, P.M., Eds., Philadelphia Lippincott-Raven Publishers, 1996, 2. edition, 2045-2076). Štruktúrne a mutačné analýzy odhalili tri rozdielne funkčné domény v E 2 proteíne s plnou veľkosťou. N-koncová časť (zvyšky 1 až 120) je aktivačná doména pre transkripciu a replikáciu nasledovaná neštrukturovanou pantovou oblasťou (zvyšky 211 až 324) a karboxy-koncovou DNA-väzbovou dimerizačnou doménou (zvyšky 325 až 410) Dostami, N., et al., EMBOJ 7(19 S 8)3807-3816 Haugen, T., et al. EMBO J 7(l 988)4245-4253 McBride, A., et al., EMBO J 7(l 988)533-539 McBride, A., et al., Proc Natl Acad Sci USA 86(l 989)5 l 0-514. Na základe údajov z kryštalograñckej štúdie má DNA-väzbová dimerizačná doména E 2 štruktúru skladajúcu sa z dvojsymetrického osemreťazcového antiparalelného beta barrela tvoreného až dvomi identic 10kými half-barrel podjednotkami Hegde, R., et al., Nature 359( 1992)505-512 Hedge, R., J Nucl Med 36(6 Suppl)(1995)25 S-27 S. Funkčné elementy transaktivačnej domény E 2 majú veľmi vysokú štruktúrnu integritu, ako sa potvrdilo mutačnýrni analýzami Abroi, A., et al., J Vírol 70(1996)6169-6179 Brokaw, L., et al.,J Víral 70(l 996)23-29 Grossel, M., et al., J Vírol 70(1996)7264-7269 Ferguson, M. and Botchan, M., J Virol 70(l 996)4 l 93-4 l 99 a kryštalograñckými štúdiami Harris, S., and Botchan, M.R., Science 284(1999) 1673-1677 a Antson, A., et al., Nature 403(2000)805-809. Navyše kryštalograñcké štúdie ukázali, že N-koncová doména E 2 proteínu vytvára dimému štruktúru, kde Arg 37 má dôležitú funkciu pri tvorbe diméruAko bolo uvedené, sú aj bovinne papilomavírusový E 2 proteín typu 1 v trans forme, aj jeho rrmohopočetne Väzbové miesta V cis forme nevyhnutné a postačujúce pre pripojenie chromatínu epizomálnych genetických elementov. Predpokladá sa, že tento jav poskytuje mechanizmus množenia Vírusového genómu V priebehu vírusovej infekcie pri delení buniek. Ilves, I., et al., J Virol. 73(1999)4404-4412.Ziadny papilomavírusový Vektor alebo iný dosiaľ známy Vektor nesplňa kritéria a požiadavky uvedené pre optimálnu vakcínu, ktoré sú rovnaké tak pre DNA-vakcíny, ako i pre konvenčné vakcíny. (Malo by sa uviesť, že tieto požiadavky sa preferujú, ale nie sú nijako nevyhnutné pre použitie ako vakcíny.) Predovšetkým musí optimálna vakcína poskytovať ochrannú imunitu s minimálnym množstvom nežiaducich účinkov. Preto by vakcína nemala obsahovať zložky, ktoré sú toxické a/alebo spôsobujú recipientovi symptómy ochorení. Ďalej musí optimálna Vakcína vyvolávať imunitnú odpoveď špecifickú pre daný patogén bez vyvolania ímunitnej odpovede na ďalšie zložky vakcíny. Tieto dve požiadavky vyplývajú z toho, že Vektor, ktorý sa má použit ako DNA-vakcína, by mal prípadne exprimovať len požadovaný gén/y a prípadne by sa nemal replikovat u hostiteľa alebo obsahovať akékoľvek sekvencie, ktoré sú homologné s recipientovými, pretože nukleotidové sekvencie, ktoré sú homologné medzi vektorom a hostiteľským genómom, môžu ovplyvňovať integráciu vektora do hostiteľského genómu. Ďalej musí optimálna vakcína indukovat správny typ imunitnej odpovede, t. j. musí vyvolávať humorálnu aj bunkovú imunitnú odpoveď kvôli účinku na intreceluláme a extraceluláme patogény. Nakoniec musí byť optimálna Vakcína stabilná, t. j. musí si uchovávať dostatočnú účinnosť po dlhý čas V tele, aby vyvolala imunitnú odpoved vo vakcínovej formulácii určenej na použitie za rôznych okolností, a to i V priebehu skladovania a prípravy. Ďalej by vakcíny mali mať primeranú cenu. Spôsob a metóda inokulácie sú dôležitými indíciami na optimalizáciu DNA imunizácie.Pri vývoji DNA-vakcíny sa stabilita expresie požadovaného gěnu stáva niekedy hlavným problémom Preto sa doterajšia technika zamerala na udržanie funkcie alebo perzistencie vektora V recipientovej bunke Často na úkor bezpečnosti. Napríklad Ohe, Y., et al., Hum Gene T her 6(3)(1995) uvádza papilomový Vektor schopný stabilnej, vysokej expresie génu, ktorý je určený na použitie V génovej terapii. Transformácie skorých génov E 5, E 6 a E 7 boli z uvedeného vektora vymazané, ale Vektor stále obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu ďalšie papilomavírusové gény, napr. E 1 a E 2 gény, ktoré sa podieľajú na replikáciu vírusu. Vektor teda produkuje niekoľko ďalších papilomových proteínov, ktoré môžu vyvolávať nežiaduce imunítné odpovede, a ktoré majú riziko integrácie vektora do recípíentovho genómu. Vektor je taktiež replikovateľný,pretože obsahuje E 1 gén. Ďalej je veľký, a preto v priebehu cesty podlieha bakteriálnej modifikácii.Medzinárodná prihláška vynálezu PCT/EE 96/000 O 4 (W 0 97/24451) uvádza vektory schopné dlhotrvajúceho sa udržania V hostiteľskej bunke a spôsoby použitia takýchto vektorov pre získanie dlhotrvajúcej produkcie požadovaného génového produktu V hostiteľskej bunke cicavca, ktorá exprimuje El a E 2. Tieto vektory obsahujú minimálny začiatok replikácie papiloma vírusu (MO), MME (Minichromosome Maintance Element) papilomavírusu a gén kódujúci uvedený génový produkt, MO a MME sa skladajú zo sekvencie DNA, ktorá je odlišná od prirodzenej sekvencie papilomavírusu, a V niektorých uskutočneniach od El génu. Navyše sa V niektorých prípadoch uvádzajú vektory vyžadujúce MME, ktoré sa skladajú esenciálne z desiatich E 2 Väzbových miest. Tieto vektory vyžadujú pre expresiu prítomnosť E 1 proteínu alebo V hostiteľovi,alebo vo vektore, čo poskytuje replikačnú funkciu vektorom. Tieto vektory tiež okrem požadovaného génu a E 2 proteínu exprimujú El proteín a obsahujú sekvencie, napr. králičie beta-globínové sekvencie, ktoré sú čiastočne homologné s ľudskými sekvenciarni spôsobujúcirni vážne riziko integrácie do ľudského genómu,čo znižuje potenciál týchto vektorov ako DNA-vakcín. Ďalej sú vektory nestabilné V dôsledku svojej Veľkosti(približne 15 kb) V štádiu príprav v bekteriálnej bunke mechanizmus bakteriálnej replikácie má tendenciu modifikovať Vektor náhodným zostrihom vektora, čo vedie k nevyhovujúcim produktom expresie vrátane produktov úplne bez požadovaného génu.V medzinárodnej prihláške Vynálezu PCT/EE 96/00004 (W 0 97/24451) sa ďalej uvádza, že E 1 a E 2 sú len vírusové proteíny nevyhnutné pre epizomálnu dlhotrvajúcu replikáciu vektorov. Dalej je udržovacia funkcia BPV 1 genómu spojená s prítorrmosťou minimálneho nmožstva ori (MO), ktoré je určené ako nevyhnutné, aj ked nie dostatočné pre dlhotrvajúcu perzistenciu alebo stabilné udržania vektorov buniek. Navyše,sis-elementy, t. j. MME BPVl, sa považujú za nevyhnutné pre stabilnú replikáciu BPVl. Konkrétne multiméme E 2 väzbové miesta (EZBS) sa považujú za nevyhnutné pre stabilne zachovanie vektorov.Existuje skutočná potreba Vylepšenia nových vektorov, ktoré by mohli byť použiteľné ako DNA-vakcíny.Zámerom predkladaného vynálezu je poskytnúť nové vektory, ktoré sú schopné dlhodobého udržania vo veľkých a zvyšujúcich sa množstvách rôznych buniek hostiteľského systému, a tým schopné poskytnúť stabilnú expresiu požadovaného antigénu(ov).Ďalším zámerom predkladného vynálezu je poskytnúť nové vektory, ktore sú schopné sa udržať po dlhú dobu v bunkách, ktoré pôvodne prevzali vektor a transferovali ho do dcérskych buniek po mitotickej fáze bunkového delenia.Ďalším zámerom predkladného vynálezu je poskytnúť nové vektory, ktoré exprimujú okrem požadovaného génu alebo génov výhodne len gén, ktorý je nevyhnutný pre dlhotrvajúce udržanie v recipientových bunkách, a tým sa vyhnúť zložkám, ktoré sú toxické alebo môžu spôsobovať symptómy ochorenia u recipienta.Ďalším zámerom predkladného vynálezu je poskytnúť nové vektory, ktoré napodobňujú vakcíny so živým, oslabeným vírusom, najmä potom ich ñmkciu rozmnožovania v tele bez indukcie akýchkoľvek významných znakov ochorenia a bez expresie nežiaducich proteínov, ktoré môžu indukovať nepriaznivé účinky u hostieľa, ktorému sa injektovala DNA-vakcína.Ďalším zámerom predkladného vynálezu je poskytnúť nové vektory, ktoré sa v recipientovi nereplikujú.Ďalším zámerom predkladného vynálezu je poskytnúť nové vektory, ktoré indukujú, pokiaľ sa používajú ako DNA-vakcíny, humorálnu a bunkovú imunitnú odpoveď.Ďalším zámerom predkladného vynálezu je poskytnúť nové vektory, ktoré sú vhodné pre veľkokapacitnú produkciu v bakteriálnych bunkách.Ďalším zámerom predkladného vynálezu je poskytnúť nové vektory, ktoré nie sú hostiteľsky špecifické, a tým je možná ich produkcia v rôznych bakteriálnych bunkách.Ďalším zámerom predkladného vynálezu je poskytnúť nové vektory, ktoré sú použiteľné ako nosičové vektory pre požadovaný gén alebo gény.Ďalším zámerom predkladného vynálezu je poskytnúť nové vektory, ktoré sú použiteľné V génovej terapii a ako génové terapeutické činidlá a pre produkciu malcromolekulových liečiv in vivo.Predložený vynález poskytuje nové vektory, ktoré spĺňajú požiadavky na nosičový vektor požadovaného génu alebo génov alebo optimálny vektor DNA-vakcíny, a ktoré výhodne nemajú nevýhody a vedľajšie účinky doterajších vektorov.Predložený vynález je založený na prekvapivom zistení, že vektor (plazrnid) nesúci (i) expresnú kazetu sekvencie DNA kódujúcu NAP a (ii) mnohopočetné kópie väzbových miest s vysokou añnitou pre uvedený NAP, sa rozptýlia do proliferujúcich buniek. V dôsledku toho sa zvýši počet buniek nesúcich vektor i bez replikácie vektora. Pokial vektor navyše nesie požadovaný gén alebo gény, dochádza k tomu, že počet takýchto buniek, ktoré exprimujú požadovaný gén alebo gény, sa podobným spôsobom zvýši, a to bez replikácie vektora. Vektor podľa predloženého vynálezu teda nemá papilomavírusový počiatok replikácie. Vo výhodnom uskutočnení nemá vektor podľa predloženého vynálezu začiatok replikácie, ktorý funguje v bunkách cicavcov.Preto predložený vynález poskytuje nové vektory použiteľné ako nosičové vektory požadovaného génu alebo génov pri DNA-vakcinácíi a génovej terapii a ako génové terapeutické činidlá. V špeciñckom uskutočnení sú uvedené vektory schopné rozptýlenia, a pokiaľ je to potrebné, expresie požadovaného génu alebo génov pri zvyšujúcom sa počte buniek na predĺžený čas. Vektory podľa predloženého vynálezu výhodne exprimujú len NAP, a pokiaľ je potrebný gén alebo gény, a prípadne voliteľný market. Ale výhodne nemajú akékoľvek nadbytočné, onkologicky transformateľné alebo potenciálne toxické sekvencie, a teda im chýbajú uvedené výrazné nevýhody vektorov alebo predpokladané pre použitie ako DNA-vakcín, t. j. hypertenzívne reakcie proti iným vírusovým zložkám. V určitých uskutočneniach podľa predloženého vynálezu sa toho dosahuje nižšími hladinami exprimovaného NAP V bunkách. Zároveň indukujú vektory podľa predloženého vynálezu humorálnu i bunkovú imunitnú odpoveď, kde požadovaný gén alebo gény sú zahmuté do vektora.Vektory podľa predloženého vynálezu sú výhodne použiteľné in vitro (napr. produkčné hladiny) a in vivoPodstata predloženého vynálezu je uvedená v priložených patentových nárokoch.Predložený vynález sa týka expresných vektorov obsahujúcich (a) sekvenciu DNA kódujúcu NAP operatívne pripojenú k heterolognému promótoru, kde uvedený NAP obsahuje (i) DNA väzbovú doménu, ktorá sa viaže na špecifickú sekvenciu DNA a (ii) funkčnú doménu, ktorá sa viaže na jadrovú zložku alebo jej funkčný ekvivalent a (b) multimerizovanú sekvenciu DNA vytvárajúcu väzbove miesto pre NAP, kde uvedený vektor nemá papilovavírusový začiatok replikácie. Vo výhodnom uskutočnení nemá vektor podľa predloženého vynálezu začiatok replikácie funkčný v bunkách cicavcov.V určitých uskutočneniach je jadrovou zložkou mitotieký chromatin, jadrová matrica, jadrová doména 10(ND 10) alebo jadrová doména POD.

MPK / Značky

MPK: A61K 48/00, A61P 31/00, C12N 15/00

Značky: expresné, použitie, vektory

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/187-287471-expresne-vektory-a-ich-pouzitie.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Expresné vektory a ich použitie</a>

Podobne patenty