Enzymatický spôsob enantioselektívnej redukcie ketozlúčenín

Číslo patentu: 288326

Dátum: 28.12.2015

Autori: Bange Gert, Gupta Antje, Breese Klaus, Neubauer Peter

Je ešte 9 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Vynález sa týka enzymatického spôsobu enantioselektívnej redukcie organických ketozlúčenín na zodpovedajúce chirálne hydroxyzlúčeniny. Ako enzým sa používa alkohol-dehydrogenáza.

Text

Pozerať všetko

Vynález sa týka enzymatického spôsobu enantioselektívnej redukcie organických ketozlúčenín na zodpovedajúce chirálne hydroxyzlúčeniny.Opticky aktívne hydroxyzlúčeniny sú cennými syntéznymi produktmi na výrobu Veľkého nmožstva farmakologicky dôležitých zlúčenín. Tieto zlúčeniny sú často ťažko vyrobiteľné klasickými chemickými spôsobmi a môžu len zriekla poskytnúť enantiomérnu čistotu požadovanú na farmakologické použitie. Preto sa na výrobu chirálnych zlúčenín spravidla používajú biotechnologické spôsoby, pričom stereoselektívna reakcia je uskutočnená buď celými mikroorganizmami, alebo použitím izolovaných enzýmov.Pritom sa ukázalo ako výhodné použitie izolovaných enzýmov, pretože sa pri ich použití spravidla dosiahnu vyššie výťažky a vyššie enatiomérne čistoty.Dehydrogenázy a najmä alkohol-dehydrogenázy sú cennými katalyzátormi na získanie chirálnych produktov stereoselektívnou redukciou organických ketozlúčenín na zodpovedajúce chirálne alkoholy. V podstate sú známe zodpovedajúce enzýmy z kvasníc, konských pečienok alebo z Thermoanaerobium brockii. Tieto enzýmy potrebujú ako koenzým NADH (nikotínadeníndinukleotid) alebo NADPH (nikotínadeníndinukleotidfosfát). Ďalšími známymi alkohol-dehydrogenázami je napríklad (S)-špecif 1 cká alkohol-dehydrogenáza z Rhodococcus erythropolis alebo (R)-špecif 1 cká alkohol- dehydrogenáza z rodu Lactobacillus. Oba tieto enzýmy majú široké substrátové spektrum na ketozlúčeniny a vykazujú vysokú enantioselektivitu. Alkoholdehydrogenázy z Lactobacillu kefir (DE 40 14 573) a Lactobacillu brevis (DE 196 10 984) sa hodia najmä na získanie chirálnych (R)-alkoholov.Nevýhodou použitia alkohol-dehydrogenáz je však malá enzýmová stabilita a enzýmová účinnosť alkohol-dehydrogenáz v organických rozpúšťadlách a veľakrát len nepatrná rozpustnosť vo vode ketozlúčenín určených na redukciu. Okrem toho je ďalším limimjúcim faktorom použitia alkohol-dehydrogenáz v organických rozpúšťadlách nutnosť použitia NADP alebo NAD ako kofaktoru vzhľadom na to, že kofaktor (NADP,NAD) je vo vode rozpustný a ekonomickým spôsobom sa regeneruje.Cieľom vynálezu je odstrániť uvedené nedostatky modifikácií procesných podmienok. Tento cieľ je podľa vynálezu dosiahnutý použitím dvojfázového systému, obsahujúceho anorganické rozpúšťadlo, alkoholdehydrogenázu, vodu, kofaktor a ketozlúčeninu.Spôsob podľa vynálezu vykazuje vysokú životnosť enzýmu v dôsledku enzýmstabilizujúceho účinku rozpúšťadla, enantiomérnu čistotu vyššiu ako 99,9 vyrobenej chirálnej hydroxyzlúčeniny a vysoký výťažok vztiahnutý na použitie množstva ketozlúčeniny.Vynález sa týka spôsobu enantioselektívnej redukcie ketozlúčenín všeobecného vzorca (l)R a R 2, ktoré sú nezávisle jeden od druhého rovnaké alebo odlišné a znamenajúl. atóm vodíka, 2. alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 20 uhlíkových atómov, pričom táto alkylová skupina je priama alebo rozvetvená, 3. alkenylovú skupinu obsahujúcu 2 až 20 LlhlĺkOVýCh atómov, pričom táto alkenylová skupina je priama alebo rozvetvená a prípadne obsahuje jednu, dve, tri alebo štyri dvojité väzby, 4. alkinylovú skupinu obsahujúcu 2 až 20 uhlíkových atómov, pričom táto alkinylová skupina je priama alebo rozvetvená a prípadne obsahuje jednu, dve, tri alebo štyri trojité väzby, 5. arylovú skupinu obsahujúcu 6 až 14 uhlíkových atómov, 6. alkylarylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 8 uhlíkových atómov a arylový zvyšok obsahuje 6 až 14 uhlíkových atómov alebo7. R 1 a R 2 tvoria spoločne so zvyškom -C(O)- arylovú skupinu obsahujúcu 6 až 14 uhlíkových atómov alebo heterocyklickú skupinu obsahujúcu 5 až 14 uhlíkových atómov, pričom skupiny uvedené v odstavcoch 1. až 7. sú nesubstituované alebo nezávisle od seba raz až trikrát substituovanéa) skupinou - OH,b) atómom halogénu, akým je atóm tluóru, atóm chlóru, atóm brómu alebo atóm jódu, 10c) skupinou -NOZ, d) -C(O)-O-alkylovou skupinou, V ktorej alkylový zvyšok obsahuje l až 20 uhlíkových atómov V priamom alebo rozvetvenom reťazci a je nesubstituovaný alebo raz až trikrát substituovaný atómom halogénu,hydroxylovou skupinou, aminoskupinou alebo nitroskupinou, aleboe) heterocyklickou skupinou obsahujúcou 5 až 14 uhlíkových atómov, ktorá je nesubstituovaná alebo raz až trikrát substituovaná atómom halogénu, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou alebo nitroskupinou,pricom a) zlúčenina všeobecného Vzorca (I) s podielom 10 až 25 , Vztiahnuté na celkový objem reakčnej vsádzky,alkohol-dehydrogenáza V úplne alebo čiastočne vyčistenej forme V množstve 20 000 až 200 000 na kilogram zlúčeniny všeobecného Vzorca (I) určenej na konverziu, výhodne V množstve asi 100 000 U, voda, kofaktor NADPH alebo NADH a organické rozpúšťadlo s hodnotou logP 0,5 až 4,0, b) sa inkubujú V dvojfázovom systéme z Vody, organického rozpúšťadla a zlúčeniny Vzorca (l), pričom sa privádza izopropanol V množstve 5 až 30 , Vztiahnuté na celkový objem reakčnej vsádzky, výhodne V množstve 10 až 20 , a najmä V množstve 10 .c) pričom sa alkohol-dehydrogenázou vytvorený oXidovaný kofaktor kontinuálne regeneruje tak, že sa izopropanol a oxidovaný kofaktor nechajú reagovať s alkoholdehydrogenázou na NADH alebo NADPH a acetón ad) izoluje sa chirálna hydroxyzlúčenina.Podľa vynálezu sa použije zlúčenina všeobecného Vzorca (I) zvolená z množiny zahrňujúcej etylester kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej, acetofenón, metylester kyseliny acetooctovej, etyl-2-oXo-4-fenylbutyrát, 2,5-hexándión, pyrohroznan etylnatý alebo 2-oktanón a organické rozpúšťadlo s hodnotou logP rovnou 0,6 až 3,0 najmä rovnou 0,6 až 1,9, výhodne rovnou 0,63 až 1,75, ktorým je dietyléter, terc-butylmetyléter, diizopropyléter alebo etylester kyseliny octovej. Výhodne sa podľa vynálezu použije alkohol-dehydrogenáza z kvasiniek, z konských pečienok, z Termoanaerobium brocki, z Rhodococcus erythropolis, z Lactobacillus kefir,z Lactobacillus brevis, z Lactobacillus minor alebo alkohol-dehydrogenáza s aminokyselinovou sekvenciou podľa SEQ ID NO 4 a pridá sa pufer, ako je káliumfosforečnanový pufer, TrisH-ICI-pufer alebo trietanolamínový pufer s hodnotou pH 5 až 10, výhodne s hodnotou pH 6 až 9. Dalej sa podľa vynálezu k pufru pridajú horečnaté ióny ako MgClz, V koncentrácii 0,2 až 10 mM, výhodne V koncentrácii 0,5 až 2 mM, a ako kofaktor sa pridá NADPH alebo NADH V množstve 0,05 až 0,25 mM, najmä V množstve 0,06 až 0,2 mM, Vztiahnuté na vodnú fázu. Ako stabilizátor alkohol-dehydrogenázy sa podľa vynálezu pridá glycerín, sorbitol alebo dimetylsulfoxid V množstve 5 až 30 , Vztiahnuté na celkový objem reakčnej vsádzky, výhodne V množstve 10 až 20 a najmä V množstve 20 .Arylovými skupinami obsahujúcimi 6 až 14 uhlíkových atómov sú napríklad fenylová skupina a naftylová skupina. Pod pojmom arylová skupina sa rozumejú aromatické uhľovodíkové skupiny obsahujúce 6 až 14 uhlíkových atómov V kruhu, napríklad 1-naftylová skupina, 2-naftylová skupina, bifenylylová skupina, napríklad 2-bifenylylová skupina a 4-bifenylylová skupina, antrylová skupina alebo fluorenylová skupina. Výhodnými arylovými skupinami sú bifenylylová skupina, naftylová skupina a najmä fenylová skupina.Pod pojmom atóm halogénu sa rozumie atóm fluóru, atóm chlóru, atóm brómu alebo atóm jódu.Pod pojmom alkylová skupina obsahujúca l až 20 uhlíkových atómov sa rozumie uhľovodíková skupina,ktorej uhlíkatý reťazec je priamy alebo rozvetvený a obsahuje l až 20 uhlíkových atómov.Pod pojmom heterocyklická skupina obsahujúca 5 až 14 uhhkových atómov sa rozumie monocyklický alebo bicyklický 5-členný až 14-členný heterocyklický kruh, ktorý je čiastočne nasýtený alebo celkom nasýtený. Príklady heteroatómov sú atóm dusíka, atóm kyshka a atóm síry. Príklady heterocyklických skupín obsahujúcich 5 až 14 uhlíkových atómov sú skupiny, ktoré sú odvodené od pyrolu, furánu, tiofénu, irnidazolu,pyrazolu, oxazolu, izoxazolu, tiazolu, izotiazolu, tetrazolu, 1,2,3,5-oXatiadiazol-Z-oxidu, triazolónu, oxadiazolónu, izoxazolónu, oxadiazolidíndiónu a triazolu, ktoré sú substituované atómom fluóru, skupinou -CN,skupinou -CF 3 alebo -C(O)-O- skupinou obsahujúcou V alkylovom zvyšku 1 úhlíkový atóm až 4 uhlíkové atómy, 3-hydroXypyro-2,4-diónu, 5-oXo-1,2,4-tiadiazolu, pyridínu, pyrazínu, pyrimidínu, indolu, izoindolu,indazolu, ftalazínu, chinolínu, izochinolínu, chinoxalínu, chinazolínu, cinolínu, karbolínu a benzoanelovaných, cyklopenta-, cyklohexa- alebo cykloheptaanelovaných derivátov uvedených heterocyklov. Obzvlášť výhodné sú 2-pyrolylový zvyšok, 3-pyrolylový zvyšok, fenylpyrolylový zvyšok ako napríklad 4-fenyl-2-pyrolylový zvyšok alebo 5-fenyl-2-pyrolylový zvyšok, Z-furylový zvyšok, 2-tienylový zvyšok, 4-imidazolylový zvyšok, metylimidazolylový zvyšok, napríklad l-metyl-Z-imidazolylový zvyšok, 1-metyl-4-imidazolylový zvyšok alebo 1-metyl-5-imidazolylový zvyšok, 1,3-tiazol-2-ylový zvyšok, 2-pyridylový zvyšok, 3-pyridylový zvyšok, 4-pyridylový zvyšok, Z-pyridyl-N-oxidový zvyšok, S-pyridyl-N-oxidový zvyšok alebo 4-pyridyl-N-oxidový zvyšok, 2-pyrimidinylový zvyšok, 4-pyrimidinylový zvyšok alebo 5-pyrimidinylový zvyšok,2-indolylový zvyšok, 3-indolylový zvyšok alebo 5-indolylový zvyšok, substituovaný indolylový zvyšok, napríklad l-metyl-, 5-metyl-, 5-benzyloXy-, 5-chlór- alebo 4,5-dimetyl-2-indolylový zvyšok, 1-benzyl-2-alebo 3-indolylový zvyšok, 4,5,6,7-tetrahydro-2-indolylový zvyšok, cykloheptab-S-pyrolylový zvyšok, 2-chinolylový zvyšok, 3-chinolylový zvyšok, 4-chinolylový zvyšok, l-izochinolylový zvyšok, 3-izochinolylový zvy 10šok, 4-izochinolylový zvyšok, 1-oXo- 1,2-dihydro-3-izochinolylový zvyšok, 2-chinoxalinylový zvyšok, 2-benzofuranylový zvyšok, 2-benzotienylový zvyšok alebo benzotiazolylový zvyšok alebo dihydropyridinylový zvyšok, pyrolidinylový zvyšok, napríklad 2-(N- metylpyrolidinyl)ový zvyšok alebo 3-(N-mety 1 pyro 1 idinyl)ový zvyšok, piperazinylový zvyšok, morfolinylový zvyšok, tiomorfolinylový zvyšok, tetrahydrotienylový zvyšok alebo benzodioxolanylový zvyšok.Výhodnými zlúčeninami všeobecného vzorca (I) sú etylester kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej acetofenón, metylester kyseliny octovej, etyl-3-oXo-4-fenylbutyrát, 2,5-hexándión, pyrohroznan etylnatý alebo 2-oktanón, pričom obzvlášť výhodný je etylester kyseliny 4-chlór-3-oxobutánovej.Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) sa V rámci spôsobu podľa vynálezu použijú V množstve 10 až 25 ,najmä V množstve 15 až 22 , Vzťahujúc na celkový objem.Do vody sa výhodne pridá pufer, napríklad fosforečnan draselný, Tris/I-ICI-pufer alebo trietanolaminový pufer s hodnotou pH 5 až 10, výhodne s hodnotou pH 6 až 9. Koncentrácia pufra je 10 až 150 mM, výhodne 90 až 110 mM, najmä 100 mM. Dodatočné pufer obsahuje tiež horečnaté ióny, napríklad Vo forme chloridu horečnatého, V koncentrácii 0,2 až 10 mM, výhodne V koncentrácii 0,5 až 2 mM, najmä V koncentrácii 1 mM.Teplota sa napríklad pohybuje od asi 10 do 70 °C, výhodne od 30 do 60 °C.Organické rozpúšťadlá použiteľné V rámci vynálezu majú výhodne logP 0,6 až 2,0, najmä 0,6 až 1,9, obzvlášť výhodne 0,63 až 1,75. Výhodnými organickými rozpúšťadlami sú napríklad dietyléter, tercbutylmetyléter, diizopropyléter, dibutyléter alebo etylester kyseliny octovej, pričom obzvlášť výhodným rozpúšťadlom je etylester kyseliny octovej. Etylester kyseliny octovej môže byť napríklad použitý V množstve 1 až 90 , vzťahujúc na celkový objem reakčných zložiek, výhodne V množstve 15 až 60 , vzťahujúc na celkový objem reakčných zložiek, najmä V množstve 20 až 50 , vzťahujúc na celkový objem reakčných zložiek.Pomer organického rozpúšťadla k vode je 91 až 19, výhodne 11 až 13.Voda tvorí V dvojfázovom systéme podľa vynálezu jednu kvapalnú fázu a organické rozpúšťadlo tvorí druhú kvapalnú fázu. Tiež môže byť ešte prípadne prítomná pevná fáza alebo ďalšia kvapalná fáza, ktorá je napríklad tvorená nie celkom rozpustenou alkohol-dehydrogenázou alebo zlúčeninou všeobecného vzorca (I). Výhodné sú však obe kvapalné fázy bez pevnej fázy. Uvedené dve kvapalné fázy sa výhodne mechanicky premiešajú, takže sa dosiahne veľký povrch medzi oboma kvapalnými fázami.Koncentrácia kofaktora NADPH alebo NADH, vzťahujúc na vodnú fázu je 0,05 až 0,25 mM, najmä 0,06 až 0,2 mM.Výhodne sa pri spôsobe podľa vynálezu použije ešte ďalší stabilizátor alkohol-dehydrogenázy. Výhodnými stabilizátormi sú napríklad glycerín, sorbitol alebo dimetylsulfoxid (DMSO).Množstvo glycerínu je 5 až 30 , vzťahujúc na objem celkovej vsádzky. Výhodne nmožstvo glyrecínu je 10 až 20 , najmä 20 , vzťahujúc na objem celkovej vsádzky.S cieľom regenerácie použitého NADH alebo NADPH môže byť V rámci vynálezu dodatočne pridaný izopropanol. Napríklad izopropanol a NADP zreaguje s alkohol-dehydrogenázou na NADPH a acetón. Použité množstvo izopropanolu je 5 až 30 , vzťahujúc na objem celkovej vsádzky. Výhodné množstvo izopropanoluje 10 až 20 , najmä 10 .Vhodné alkohol-dehydrogenázy pochádzajú napríklad z kvasníc, konských pečienok alebo z Rhodococcus erythropolis, pričom tieto enzýmy potrebujú ako koenzým NADH, alebo z Thermoanaerobium brockii,Lactobacillus kefir alebo Lactobacillus brevis, pričom tieto enzýmy potrebujú ako koenzým NADPH.Ak sa použije V rámci vynálezu napríklad alkohol-dehydrogenáza z kvasníc, konských pečienok, z Thermoanaerobium brockii alebo z Rhodococcus erythropolis, potom sa zo zlúčeniny všeobecného vzorca (I) získa zodpovedajúca (Syhydroxyzlúčenina. Ak sa použije V rámci vynálezu napríklad alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus kefir alebo Lactobacillus brevis, potom sa zo zlúčeniny všeobecného vzorca (I) získa zodpovedajúca (R)-hydroxyzlúčenina.Alkohol-dehydrogenáza môže byť V rámci vynálezu použitá bud celkom vyčistená alebo čiastočne vyčistená alebo môže byt V rámci tohto použitia obsiahnutá V bunkách. Použité bunky pritom môžu byť V natívnom stave, V permeabilizovanom alebo lýzovanom stave.Objemová účinnosť použitej alkohol-dehydrogenázy je 100 jednotiek/ml (U/ml) až 2000 U/mk, výhodne asi 800 U/ml, pri obsahu proteínu asi 20 až 22 mg/ml. Výhodne má použitá alkohol-dehydrogenáza špecifickú aktivitu asi 35 až 40 U/mg proteínu. Na každý kilogram zreagovanej zlúčeniny všeobecného vzorca (I) sa použije asi 20 000 až 200 000 U alkoholdehydrogenázy, výhodne asi 100 000 U alkohol-dehydrogenázy. Enzýmová jednotka 1 U pritom zodpovedá množstvu enzýmu, ktoré je potrebné na to, aby každú minútu zreagoval 1 mol zlúčeniny všeobecného vzorca (I).Spôsob podľa vynálezu sa napríklad uskutočňuje V uzavretej reakčnej nádobe zo skla alebo z kovu. Na tento účel sa reakčné zložky jednotlivo zavedú do reakčnej nádoby, kde sa miešajú pod atmosférou napríklad dusíka alebo vzduchu. V závislosti od charakteru substrátu a použitej zlúčeniny všeobecného vzorca (I) je reakčná doba 1 deň až 14 dní, výhodne 4 dni až 7 dní.Získaná reakčná zmes sa následne spracuje. Na tento účel sa oddelí Vodná fáza a etylacetátová fáza sasfiltruje. Vodná fáza môže byť prípadne ešte raz extrahovaná a ďalej spracovaná ako etylacetátová fáza. Potom sa sfiltrovaná fáza odparí za zníženého tlaku. Takto sa získa napríklad produkt tvorený etylesterom kyseliny 4-chlór-3-(S)-hydroxybutánovej, ktorý ma enantiomérnu čistotu vyššiu ako 99,9 a ktorý je V podstate zbavený produktu etylesteru kyseliny 4-chlór-3-oxo-butánovej. Celkový výťažok uvedeného spôsobu je po destilovaní produktu 82 až 88 , vzťahujúc na použité množstvo eduktu.S prekvapením bolo zistené, že organické rozpúšťadlá s hodnotou logP rovnou 0 až 4 majú stabilizačný účinok na alkohol-dehydrogenázu, zatial čo v rámci doterajšieho stavu techniky sa od použitia dvojfázového systému s organickými rozpúšťadlami odstupuje (M.R.Kula, U. Kragel kap.28, Dehydrogenases in Synthesis of Chiral Compounds R. N. Patel, Stereoselective Biocatalyses, 2000 Peters J. 9. Dehydrogenases-Characteristics, Design of Reaction Conditions, and Application, In H.J.Rehm, G. Reed Biotechlogy, sv.3. Bioprocessing, VCH Weinheim, 1993 J. Lynda a kol., Solvent selection strategies for extractive Biocatalysis, Biotechnol. Prog. 1991, 7, str. 116-124). Pri spôsobe podľa vynálezu sa ako organická fáza použije etylester kyseliny octovej (etylacetát), pričom táto organická fáza slúži ako zásobník pre zlúčeninu všeobecného vzorca (I), ale tiež súčasne extrahuje z vodnej fázy reakčný produkt, ktorým je chirálna hydroxyzlúčenina.Na rozdiel od doterajšieho stavu techniky vedie použitie organického rozpúšťadla s hodnotou logP rovnou O až 3 v priebehu času k zvýšenej stabilizácii alkohol-dehydrogenázy. Podľa doterajšieho stavu techniky majú najmä organické rozpúšťadlá s hodnotou logP (logaritmus rozdeľovacieho koeficientu oktanol/voda) 0 až 2 výrazný destabilizujúci vplyv na enzýmy a prichádzajú takto ťažko do úvahy ako organickú fáza v dvojfázových systémoch (K. Faber, Biotransfonnations in organic Chemistry, 3.vyd. 1997, Springer Verlag,kap.3.Bis 3.17).Vynález sa ďalej týka alkohol-dehydrogenázy z Lactobacillus minor s vysokým teplotným optimom. Alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor má DNA-sekvenciu podľa SEQ ID N 013 a aminokyselinovú sekvenciu podľa SEQ ID NO 4 v rámci priloženého sekvenčného protokolu. Táto alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor je R-špecifická, pričom napríklad zo zlúčeniny všeobecného vzorca (I) môže byť získaná zodpovedajúca (R)-hydroxyzlúčenina. Enantioselektívny alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor môže byť prekvapivo superexprimovaná v Escherichia coli RB 791, zatiaľ čo z ostatných druhov rodu Lactobacillus sa alkohol-dehydrogenaza exprimuje podstatne obmedzenejšie. To je o to viac prekvapujúce,že sa alkohol-dehydrogenáza len veľmi málo exprimuje v divokom kmeni Lactobacillus minor, a takto je nedetekovateľná bežnými metódami screeningu (biotransformácia celých buniek, aktívny test). Bolo preto veľmi prekvapujúce, že došlo ku klonovaniu R-enantioselektívnej alkohol-dehydrogenázy z Lactobacillus minor a že táto alkohol-dehydrogenáza je tak výrazne silne superexprimovaná v Escherichia coli (50 bunkového proteínu klonu, 20 000 U/g vlhkej hmotnosti).Vyčistený enzým z Lactobacillus minor je stabilný v rozmedzí pH asi 5,5 až 8,5. Tento enzým je stabilný do teploty asi 40 °C a pH-optimum enzymatickej reakcie leží v rozmedzí od pH 7 do pH 7,5. Teplotné optimum tejto enzymatickej reakcie leží v blízkosti 55 °C a enzým vykazuje široké substrátové spektrum.Uvedený enzým môže byť pomocou hydrofóbnej interakčnej chromatografie Vyčistený až na dosiahnutie špecifickej aktivity 35 až 40 U/mg proteínu.Alkohol-dehydrogenáza je pripraviteľná z Lactobacillus minor. Na tento účel sa vo vhodnom prokaryotickom alebo eukaryotickom milcroorganizme exprimuje DNA, ktorá kóduje alkohol-dehydrogenázu z Lactobacillus minor. Výhodne sa alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor transformuje a exprimuje v kmeni Escherichia coli, výhodne v Escherichia coli RB 791.Alkohol-dehydrogenázu je možné z Lactobacillus minor získať napríklad tak, že sa kultivujú rekombinantné bunky Escherichia coli, načo sa indukuje expresia alkohol-dehydrogenázy a po asi 10 až 18 hodinách(h) sa bunky otvoria pôsobením ultrazvuku alebo v lise French (Gaullin, Siemens). Získaný bunkový extrakt môže byť buď priamo použitý, alebo ešte ďalej čistený. Na tento účel sa bunkový extrakt napríklad odstredí a získaný supernatant sa podrobí hydrofóbnej interakčnej chromatografii. Táto Chromatografia sa výhodne uskutočňuje pri hodnote pH 7,0 vo vodnom pufri, ktorý obsahuje tiež horečnaté ióny.V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie objasnený pomocou konkrétnych príkladov jeho uskutočnení, pričom tieto príklady majú iba ilustračný charakter a nijako neobmedzujú rozsah vynalezu, ktorý je jednoznačne vymedzený definíciou patentových nárokov a obsahom opisnej časti.Príklad 1 Skríning R-alkohol-dehydrogenázy v kmeňoch rodu Laktobacillus pomocou biotransformácie celých buniek Na účel skríningu boli kultivované rôzne kmene Lactobacillus v nasledujúcich prostrediach (údaje sú vy jadrené vo všetkých prípadoch V g/l)

MPK / Značky

MPK: C12N 9/04, C12P 41/00, C12P 7/02, C12P 7/62

Značky: spôsob, enantioselektívnej, enzymatický, redukcie, ketozlúčenín

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/17-288326-enzymaticky-sposob-enantioselektivnej-redukcie-ketozlucenin.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Enzymatický spôsob enantioselektívnej redukcie ketozlúčenín</a>

Podobne patenty