Spôsob kultivácie circovírusu

Číslo patentu: 287969

Dátum: 09.07.2012

Autori: Tikoo Suresh, Liu Qiang, Willson Philip, Babiuk Lorne

Je ešte 9 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Je opísaný spôsob kultivácie circovírusu a najmä prasacieho circovírusu. Predkladaný vynález poskytuje kompozície a spôsoby kultivácie prasacieho circovírusu v bunkách cicavcov, ktoré exprimujú E1-funkciu adenovírusu cicavca.

Text

Pozerať všetko

Predkladaný vynález sa vzťahuje na odbor zameraný na circovírusy a ponúka kultivačné zloženie a spôsoby kultivácie circovírusu, najmä prasacíeho circovírusu. Predkladaný vynález sa zameriava zvlášť na spôsoby kultivácie prasacíeho circovírusu na bunkách cicavcov, ktoré exprimujú funkciu adenovírusového génu E 1 cicavca.Čeľad vírusov Circoviridae, ktorá sa nachádza v rade rastlinných a živočíšnych druhov a bežne je označovaná ako circovírusy, sa opisuje ako okrúhle, neobalené virióny s priemerom 17 až 23,5 nm obsahujúce cirkulárnu, jednoreťazcovú deoxyribonukleovú kyselinu (ssDNA). ssDNA genóm circovírusov predstavuje najmenší známy vírusový replikón. Ako uvádza WO 99/45956 na základe The Sixth Report of the International Committee for the Taxonomy of Viruses (6. správa medzinárodného výboru pre vírusovú taxonómiu),ako súčasť čeľade bolo identifikovaných najmenej šesť vírusov (Lukert, P.D. et al., 1995, The Circoviridae,pp. 166-168. V F.A.Murphy, et al., (eds.) Virus Taxonomy, Sixth Report of the international Committee on Taxonomy of Viruses, Arch. Virol. 10 SuppI.).Zvieracie vírusy, ktoré patria do čeľade, sú vírus kurací anemia (CAV), vírus ochorenia zobáka a peria(BF DV), prasací circovírus (PCV) a holubí circovírus. PCV bol pôvodne izolovaný z bunkových kultúr prasacích obličiek. PCV sa replikuje v bunkovom jadre a tvori veľké jadrové inklúzie, pozri Murphy et al.,(1999, Circoviridae p. 357-361, Veterínary Virology, 3 ed. Academic Press, San Diego). V súčasnosti sú známe dva druhy PCV, PCVl a PCV 2. PCVl izolovaný ako trvalá kontaminácia permanentnej bunkovej línie prasacích obličiek PK-15 (ATCC CCL 31) nespôsobuje v bunkovej kultúre žiadne rozoznateľné cytopatícké účinky a nespôsobuje prasatám pri experimentálnej infekcii klinické ochorenie (pozri Allan, G., 1995,Vet. Microbiol. 44 49 - 64 Tischer, I. et al., 1982, Nature 295 64 - 66 and Tischer, I. et al., 1986, Arch. Virol. 91 271 - 276). PCV 2 je na rozdiel od PCVl úzko spojený so syndrómom multisystémového zlyhania (post weaning multisystemic wasting syndrome ~ PMWS) vznikajúcom po ukončení kojenia pri odstavených prasatách (pozri Allan G. et al., 1998, Europe. J.Vet.Diagn.lnvestig. 103-10 Ellis, J. et al., 1998, Can.Vet.J. 3944-51 a Morozov, 1. et al., 1998, J.Clin.Microbiol. 36 2535 - 2541). Nukleotidové sekvencie PCVl sú opísané v Mankertz, A., et al., (1997, J.Virol. 71 2562 - 2566) a Meehan, B.M., et al., (1997, J.Gen.Virol. 78 221 - 227) a nukleotidovej sekvencie PCV 2 v Hamel, A.L. et al., (1998, J. Virol. 72 5262 - 5267 Mankertz, A., et al., (2000, Virus Res. 66 65 - 77) a Meehan, B.M., et al., (1998, J.Gen.Virol. 79 2171 - 2179). Kmene PCV 2 sú opísané v W 0 00/01409 a sú uložené v European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP 4 OJG, United Kingdom a patria k nim prírastkové číslo V 97100219 prirastkové číslo V 9700218 prírastkové číslo V 971002 l 7 prírastkové číslo V 98011608 a prírastkové číslo V 9801 1609. W 0 00/7721 tiež opisuje PCV 2.Dosiaľ publikované štúdie o PCV 2 používali tkanivový homogenát alebo kultivovaný vírus získaný z ložiskových izolátov. Tischer et el., (1987, Arch Virol. 96 39 - 57) opísal, že bunky prasacích obličiek sú stimulované na vstup do S-fázy bunkového cyklu, pokiaľ sú ošetrené D-glukozamínom. Toto ošetrenie však musi byť vykonané šetrne, lebo D-glukozamin je pre bunkovú kultúru toxický (pozri Allan et al., 2000. J .Vet. Diagn. Investigation. 12 3 - 14). Stále pretrváva potreba existencie spôsobov kultivácie circovírusu, napríklad PCVI a PCV 2 a iných circovírusov, ktoré by umožnili získanie čistého vírusu. Tieto spôsoby kultivácie by boli výhodné najmä na prípravu vakcíny z antigénov PCV 2, ktorú by bolo možné použiť proti PMWS. Predkladaný vynález vychádza z tejto potreby.Všetky uvedené patenty a publikácie sú v tomto dokumente zahrnuté formou odkazu v plnom znení.Predkladaný vynález poskytuje spôsoby kultivácie circovírusu cicavcov, ktoré zahrnujú a) získanie buniek cicavcov exprimujúcich El-funkciu adenovirusu cicavcov, pričom tieto bunky umožňujú replikáciu circovírusu cicavcov b) vloženie alebo replikáciu schopnej časti genómu uvedeného circovírusu do buniek cicavcov c) kultiváciu týchto buniek v podmienkach vhodných na replikáciu circovírusu cicavcov. V niektorých modiñkàciáchje ďalej súčasťou metódy spätné získanie circovírusu z uvedených buniek.V niektorých modiñkáciách vynálezu je circovírusom prasací circovírus cicavca, ako je napr. prasací circovírus 1 (PCVl) alebo prasací circovírus 2 (PCV 2). V ešte ďalších modifikáciách obsahuje prasací circoví 10rus chimérickú nukleotidovú sekvenciu, V ďalších modifikáciách sú bunky cicavca prasacieho pôvodu. A v ešte ďalších modiñkáciách ide o bunky prasacej sietnice.V ďalších modifrkáciách je El-funkcia adenovírusu cicavca El-funkciou ľudského adenovírusu. V ešte ďalších modiñkáciách je El-funkcia adenovírusu cicavca El-funkciou prasacieho adenovírusu. V ďalších modiñkáciáchje funkcia E 1 funkciou ElA a/alebo ElB. V ešte ďalších moditikáciáchje bunka cicavca, ktorá exprimuje funkciu cicavca E 1 trvalo transformovaná sekvencíou génu El cicavca. V ďalších modifikáciách je sekvencia génu E 1 cicavca heterológna k uvedenej bunke cicavca.Predkladaný vynález tiež poskytuje rekombinantné bunky cicavcov, ktoré exprimujú El-funkciu adenovírusu cicavcov a obsahujú celý genóm alebo replikácie schopnú časť genómu circovírusu cicavcov a umožňujú tiež replikáciu uvedeného circovírusu cicavcov. V niektorých modiñkáciáchje circovírusom cicavcov prasací círcovírus, ako je napríklad prasací círcovírus l (PCVl) alebo prasací círcovírus 2 (PCV 2). V ešte ďalších modiñkáciách obsahuje prasací círcovírus chimérickú nukleotidovú sekvenciu. V niektorých modifikáciáchje El-funkcia adenovírusu El-funkciou ľudského adenovírusu. V ďalších modifrkáciáchje funkcia génu El-funkciou E 1 prasacieho adenovírusu. V ďalších modifikáciách je bunka cicavca prasacieho pôvodu. A v ďalších modifikáciách ide o bunky prasacej sietnice. V ešte ďalších modifikáciáchje bunka cicavca exprimujúca El-funkciu cicavca trvalo transformovaná El-génovou sekvencíou adenovírusu cicavca. V ďalších m 0 diñkáciách je génová sekvencia El cicavca heterológna na uvedenú bunku cicavca.Predkladaný vynález tiež poskytuje spôsoby prípravy rekombinanmých buniek cicavcov, ktore exprimujú El-funkciu adenovírusu cicavca a obsahujú genóm circovírusu cicavca, ked tieto spôsoby zahrnujú a) získanie buniek cicavcov exprimujúcich El-funkciu adenovírusu cicavca b) vloženie genómu alebo replikácie schopnej časti genómu circovírusu do uvedených buniek cicavcov. V ďalších modiñkáciách zahrnuje metóda navyše kultiváciu rekombínantných buniek za podmienok vhodných na replikácíu uvedeného circovírusu cicavca. V ďalších modifikáciách je súčasťou metódy spätné získanie uvedeného circovírusu z uvedených buniek. V niektorých modiñkáciáchje circovírusom cicavca prasací círcovírus 1 (PCVl) alebo prasací circovírus 2 (PCV 2). V ešte ďalších modifikáciách obsahuje prasací círcovírus chimérickú nukleotidovú sekvenciu. V ďalších moditikáciách sú bunky cicavcov prasacieho pôvodu. V ešte ďalších modifikáciách ide o bunky prasacej sietnice. V ďalších modiñkáciách je El-funkcia adenovírusu El-funkciou ľudského alebo prasacieho adenovírusu. V ešte ďalších modifrkáciách je bunka cicavca exprimujúca funkciu El-génu adenovírusu cicavca trvalo transformovaná El-génovou sekvencíou adenovírusu cicavca. V ďalších modifikáciách je génová sekvencia cicavca El heterológna na uvedenú bunku cicavca.Predkladaný vynález sa zameriava na zloženie a spôsoby kultivácie circovírusu cicavcov, najmä prasacieho circovírusu, Predkladaný vynález vychádza z poznatku, že prasacie bunky, ktoré exprimujú funkciu ľudského El, je možné transfekovať (vložiť do nich) genómen vírusu PCV 2 a tieto bunky potom vytvárajú PCV 2 vírus vo veľkom titre. Bunková línia VlDO R 1 uchovávaná v ATCC pod prírastkovým číslom PTA 155 je línia buniek prasacej sietnice transformovaná vložením génu E 1 ľudského adenovírusu 5 (HAV 5), pričom V produkte tohto génu bolo dokázané, že privádza bunku do S-fázy bunkového cyklu a transaktivuje génovú transkripciu. Pozri Shenk, T. (1996). Adenoviridae the Viruses and their replikatíon v F íelds Virology. 3 ed. B.N.Fíelds, D.M.Knipe and P.M.Howley (ed.) Líppincott-Raven Publishers, Philadelphia, New York, pp.2 l 11-2148. Akoje opisané v príklade 3, bunky VlDO R 1 boli transfekované genómom PVC 2, zisk vírusu predstavoval 2 x 107 IU/ml (lU-infekčnájednotka).Uskutočnenia predkladaného vynálezu využívajú, pokiaľ nie je požadované ináč, bežné mikrobiologické,imunologické, vírologické, molekulárne biologické a DNA rekombinantné techniky, ktoré zodpovedajú úrovni doterajšieho stavu techniky. Tieto techniky sú podrobne opísané v literatúre. Pozri napr., Maniatis et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual (l 982) DNA Cloning A Practical Approach, vols. l II(D.Glover, ed.) Oligonucleotide Synthesis (N.Gaít, ed. (1984 Nucleic Acid Hybridization (B.Hames S.Higgins, eds. (1985 Transcription and Translation (B.Hames Słliggins, eds. (1984 Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) Ausubel, et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley Sons (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996) a Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual (2 d Edition) vols. I, lI lll (1989).Circoviridae, čeľaď vírusov s okrúhlym neobaleným viriónom stredného priemeru 17 až 23,5 nm, obsahujúcim cirkulárnu(kruhovú)jednov 1 áknovú DNA (ssDNA) je opísaná v The Sixth Report of the International Commitee for Taxonomy of Viruses, uvedené skôr. Medzi členov čeľade sa radia prasacie circovírusy,PCVl a PCV 2. Je známe, že niektoré PCV vírusy sú patogénne, ako PCV 2, ktorý je spájaný s PMWS.Nukleotidové sekvencie PCVl sú uvedené v Mankerz, A., et al., 1997, J.Virol. 7 l 2562-2566 a Meehan,B.M. et al., 1997, J.Gen.Virol. 78221-227. Nukleotidové sekvencie PCV 2 sú uvedené v Hamel, A.L. et al.,1998, J.Virol. 7225262-5267 Mankertz, A. et al., 2000, Virus Res, 6665-77 a Meehan, B.M. et al., 1998,J.Gen.Virol. 7922171-2179. Zástupcovia kmeňov PCV 2 sú vedení v European Collection for Cell Cultures,Centre for Applied Microbiology Research, Portin Down, Salisbury, Wiltshire SP 4 OJG, United Kingdom and sú zahrnuté pod prírastkovými číslami V 971002 l 9, V 9700218, V 971002 l 7, V 98011608 a V 9801 1609. PCV 2 je tiež opísané V prihláške W 0 00/77216. Nukleotidové sekvencie PCV 2 bolí tiež publikované v Ha 10mel et al., (1998), J.Virol. vol. 72, 615262-5267 (GenBank AF 0272 l 7) a V Morozov et al., (1998), J.Clinical Microb. vol. 36, 922535-2541, ako aj GenBank AF 086834, AF 086835, a AF 086836. Porovnanie publikovaných nukleotidových sekvencii PCVl a PCV 2 ukazuje menšiu ako 80 zhodu, aj keď organizácia genómu je podobná, najmä V usporiadaní dvoch najväčších otvorených čítacích rámcov (ORFs), považovaných za začiatok DNA replikácie.Predkladaný vynález zahrnuje spôsoby kultivácie circovírusu cicavca a najmä prasacieho circovírusu(PCV). Predkladaný vynález zahrnuje spôsoby kultivácie PCV využívajúcich nukleotidové sekvencie PCV tu opísané alebo známe v odbore alebo ORFs uvedených sekvencii alebo častí uvedených sekvencii schopných replikácie. Predkladaný vynález tiež zahrnuje spôsoby kultivácie PCV, ktorého PCV nukleotidové sekvencie sa na základe degeneračných zmien genetického kódu líšia od tu alebo V odbore opísaných sekvencii, resp. využíva ORFs týchto sekvencii alebo časti týchto sekvencii schopných replikácie. Predkladaný vynález ďalej zahrnuje spôsoby kultivácie PCV využívajúcej genetické varianty nukleotidových sekvencii PCV alebo ich ORFs alebo ich častí schopných replikácie, keď uvedená variabilita nemení funkčné Vlastnosti ani kmeňovú príslušnosť nukleotidovej sekvencie. Predkladaný vynález tiež zahrnuje spôsoby kultivácie PCV využívajúce PCV nukleotidové sekvencie schopné pri stredne alebo vysoko prísnych podmienkach hybridizovať na sekvencie tu opisovane a spôsoby kultivácie PCV využívajúce mutácie tu alebo V literatúre opísané PCV nukleotidové sekvencie alebo ich ORFs alebo ich častí schopných replikácie, keď uvedené mutácie sú delécie alebo bodové mutácie. Predkladaný vynález tiež zahrnuje spôsoby kultivácie PCV, ktoré využívajú heterológne nukleotidové sekvencie, Predkladaný vynález tiež zahrnuje spôsoby kultivácie PCV, ktoré využívajú chimérické circovírusove nukleotídové sekvencie, napr. nukleotidové sekvencie prasacích circovírusov fusované s nukleotidovými sekvenciami iných patogénnych vírusov, akoje prasací patogénny vírus vrátane parvovírusu.Vo význame, V akom je používaná, je sekvencia heterológna na circovírus alebo na bunku cicavca takou sekvenciou, ktorá nie je fyziologicky spojená s circovírusovými sekvenciami ako súčasť genómu circovírusu,resp, tá, ktorá nie je fyziologicky prítomná V bunke cicavca. Medzi heterológne nukleotidové sekvencie patria syntetické sekvencie. Hybridizačné reakcie môžu prebiehať pri rôznych prísnych podmienkach. Podmienky, ktoré zvyšujú striktnosť hybridizačnej reakcie sú všeobecne známe a V odbore publikované. Pozri napr. Sambrook et al., (1989), str. 7.52. Príklady príslušných podmienok zahrnujú (v poradí vzrastajúcej prísnosti hybridizácie) inkubačnú teplotu 25 °C, 37 °C, 50 °C a 68 °C koncentráciu pufra 10-krát SSC, 6-krát SSC, 1 krát SSC, O,1-krát SSC (SSC je 0,15 M NaCl a 15 mM citrátový pufer) a ekvivalentnú koncentráciu iných pufrovacích systémov koncentráciu formamidu 0 , 25 , 50 a 75 inkubačnú dobu od 5 minút do 24 hodín 1,2 alebo viac premývacích krokov dlžku premývania 1,2 alebo 15 minút a premývací roztok 6-krát SSC, l-krát SSC, 0,l-krát SSC alebo deionizovanú vodu. Vzorovým protokolom prísnych hybridizačných podmienokje 68 °C a 0,1-krát SSC.PCV genóm kóduje niekoľko polypeptidových sekvencii V približnom rozmedzí veľkosti od 8 do 35 kDa. Určenie otvorených čítacích rámcov (ORFs) prasacích circovírusov s použitím štandardného softvéru, napr. MacVector® (Oxford Molecular Group lnc., MD 2 1030) je považované za rutinnú metodíku. ORF l, najväčší ORF pri dvoch druhoch PCV sa len málo odlišujú, sú identické na 85 a bolo dokázané, že PCVl je Rep proteín (Mankertz, E., et al., 1998, J.Gen.Virol. 79 381 - 384). Bez úmyslu vydávať to ako teóriu, vyššia miera odlišnosti nájdená V ORF 2 sekvenciách PCVl a PCV 2 (zhoda predstavuje okolo 65 ) by mohla naznačovať, že typovo špecifické vlastnosti by mohli byť určené príslušným proteínom ORF 2. Do oblasti PCV 2 ORF 2 sekvencie bolo mapovaných niekoľko PCV typovo špecifických epitopov. Pozri Mahe, D. et al.,2000, J .Gen.Virol. 81 1815 - 24. V ďalšej nedávnej štúdii bol PCV 2 ORF 2 opísaný ako hlavný štruktúrny proteín schopný utvárať častice podobné vírusovej kapside V bunkách hmyzu infikovaných rekombinantným baculovírusom exprimujúcim ORF 2. Pozri Nawagitgul, P. et al., 2000, J.Gen Virol. 81 2281 - 2287.V niektorých názorných modifikáciách vynálezu, ktoré sú uvedené, Vzniká rekombinantný Vektor obsahujúci PCV genóm alebojeho ORF alebo jeho časť, ako je antigénna oblasť, rekombinácia plazmidu a PCV genómu in vitro. V niektorých modifikáciách je PCV genóm PCV 2 genóm. V iných modiñkáciách vzniká rekombinantný Vektor obsahujúci PCV genóm alebo jeho ORF alebo jeho časť, ako je antigěnna oblasť, in viva rekombináciou. Spôsoby in vivo rekombinácie sú v oblasti techniky známe a zahmujú, napr. spôsoby opísané V Chartier, et al., (1996, J.Virol. 70 4805 - 4810). Medzi vektory, do ktorých je možné vložit circovírusové genómy patria napr. bakteriálne plazmidy, ktoré dokážu produkovať veľa kópií vyklonovanej circovírusovej sekvencie. V niektorých modifikáciách je na účely rekombinácie do vhodnej hostiteľskej bunky spoločne transfekovaný plazmid. Bunkou Vhodnou na rekombináciu je akákoľvek bunka, ktorá podporí rekombináciu PCV genómu a plazmidu obsahujúceho PCV sekvencie alebo rekombináciu dvoch alebo viac plazmidov obsahujúcich PCV sekvencie. Rekombinácia sa bežne vykonáva v prokaryotických bunkách, napr. E.coli, pričom produkcia circovírusu je prednostné vykonávaná v bunkách cicavcov s výhodným prostredím na replikáciu PCV, napr. v prasacích bunkách a najmä V prasacích bunkách exprimujúcich E 1-funkciu adenovírusu cicavca.Predkladaný vynález zahrnuje použitie akejkoľvek hostiteľskej bunky cicavca umožňujúcej replikáciu circovírusu a najmä replikáciu PCV, ako sú PCVl a PCV 2. Allan et al., (1995, Veterinary Microbiology 4449 - 64) uvádza, že PCV sa replikuje v bunkách prasacej a bovinnej monocytomakrofágovej kultúry. Tischer et al., (1987, Arch. Virol. 96 39 - 75) uvádza, že PCV vyžaduje na replikáciu v bunkovej kultúre aktívne sa deliace bunky. Medzi príkladmi buniek alebo bunkovýmí líniami, ktoré sú vhodné na replikáciu PCV patria bunky cicavcov, ktoré disponujú El-funkciou a ktoré tolerujú PCV replikácíu, čo zahrnuje prasacie bunky,ako sú prasacie monocyto-makrofágy a prasacie bunky sietnice, ktoré exprimujú El-adenovírusovú funkciu. V názomej modifikáciije ukázané, že bunky prasacej sietnice exprimujúce El-funkciu ľudského adenovírusu umožňujú replikáciu PCV 2 a zisk, ktorý produkuje vírus, predstavuje 2 x 107 IU/ml. Prasacle bunkové línie je možné získať z verejne dostupných zdrojov, ako je napr. American Type Tissue Collection (ATTC). Rast bakteriálnych bunkových kultúr, rovnako ako kultivácíe a udržiavanie eukaryotických buniek a bunkových línii cicavcov sú postupy dobre známe odborníkom v danej oblasti techniky.Predkladaný vynález zahrnuje spôsoby kultivácíe circovírusov cicavcov, najmä prasacieho circovírusu, v hostiteľských bunkách cicavcov, do ktorých bola vložená (bola transfekovaná) El-génová sekvencia adenovírusu cicavcov. V niektorých modifikáciách sú bunky cicavcov trvalo transformované El-génovou sekvenciou adenovírusu. V niektorých modifikáciách sú tieto E 1-génové sekvencie integrované do genómu bunky cicavcov. V ďalších modiñkáciách sú génové sekvencie súčasťou replikačného plazmidu. V ešte ďalších modifikáciách je génová sekvencia El heterológna na bunku cicavcov. V názornej modifikácii je prasacia bunka transformovaná El-génovou sekvenciou ľudského adenovírusu 5. Predkladaný vynález zahrnuje použitie akejkoľvek bunky cicavcov alebo bunkovej línie cicavcov exprimujúcej El-funkciu za predpokladu, že bunka cicavcov alebo bunková línia exprimujúca El-funkciu umožňuje replikáciu circovírusu, najmä prasacieho circovírusu, ako napr. prasacieho circovírusu 1 alebo prasacieho circovírusu 2. Uprednostňované sú modifikácie, kde bunkou cicavcovje prasacia bunka alebo bunková línia. Predkladaný vynález zahrnuje použitie akejkoľvek El-funkcie cicavcov za predpokladu, že hostiteľská bunka cicavcov exprimuj úca El-funkciu umožňuje replikáciu circovírusu, najmä PCV, ako sú napr. prasací circovírus l a prasací circovírus 2. Genómické sekvencie adenovírusov cicavcov sú v odbore známe a sú opísané, napr. v Reddy et al., (1998, Journal of Virology, 72 1394), ktorý uvádza nukleotidovú sekvenciu, organizáciu genómu a transkripčnú mapu bovinného adenovírusu 3 (BAV 3) a v Kleiboeker (1995, Virus Res. 36 259 - 268), ktorý ukazuje El-oblasť u PAV-4. Predkladaný vynález zahrnuje E 1-funkciu akéhokoľvek z rôznych sérotypov ľudského adenovírusu,ako sú sérotypy Ad 2, Ad 5, Adl 2 a Ad 40. V uvedenej názornej modiñkácii, v príklade l je použitou Elfunkciou El-funkcia ľudského adenovírusu Ad 5. K expresii ľudského ElA génu dochádza bezprostredne po infekcii vírusom (0 až 2 hodiny) a pred akýmkoľvek iným vírusovým génom. F lint (1982) BiochemBíophys. Acta 651 z 175 - 208 Flint (1986) Advances Virus Research 31 169 - 228 Grand (1987) BiochemJ. 241225-38. Miesto začiatku transkripcie Ad 5 ElAje v pozícii (nukleotidovej sekvencie) 498 a ATG začiatok ElA proteínu je v pozícii 560 vírusového genómu. E 1 G proteínje aktívny v trans konformácii aje nevyhnutný na transport zrelej mRNA z jadra do cytoplazmy. Promótor EIB v Ad 5 je vytvorený jednou vysoko afinnou rozoznávacou sekvenciou pre Spl a TATA-boxom. Konkrétne, génové sekvencie ElA a EIB ľudského adenovírusu 5 sa nachádzajú v rozsahu 505 až 4034 nukleotidu nukleotídovej sekvencie opísanej v Chroboezek,J. et al., (1992, Virology, 186 280 - 285). V názornej moditikácii opísanej v príkladoch je hostiteľskou bunkou cicavca prasacia hostiteľská bunka transfekovaná El-génovou sekvenciou ľudského adenovírusu 5. PCV genómje možné izolovať z PCV virionu alebo ako súčasť PCV genómu insertovaného do plazmidu za využitia bežných molekulárno biologických a biotechnologických postupov. Klonovanie kompletného PCV 2 genómu do vektoru pBluescript 11 KS() od Strategene pomocou PCR je opísané V Liu, et al., (2000,J .Clin.Microbiol. vol 38 3474 - 3477). Kompletnú genómickú DNA PCV 2 je možné získať pri vzniknutom plazmíde po jeho štepení enzýmom Sacll.Circovírusovú nukleotidovú sekvenciu je možné vniesť do akceptujúcej hostiteľskej bunky cicavcov akoukoľvek metódou známou v oblasti techniky, čo zahrnuje (nielen však) transfekciu a trasnformáciu,vr.(nielen však) mikroinjekcie, elektroporácíe, CaPO., precipitácie, DEAE-dextranu, lipozómov, ostreľovanie časticami, atď. Názorný spôsob transfekcie PCV 2 nukleotídovej sekvencie do VlDO R 1 buniek je opísaný V príklade 3.Spôsoby kultivácíe prokaryotických buniek, ako sú bakteriálne bunky, a eukaryotických buniek, ako sú hostiteľské bunky cicavcov exprimujúce adenovírusovú El-funkciu, sú chápané ako rutinné pre odborníkov V danej oblasti techniky.Nasledujúce príklady majú slúžiť na ilustráciu vynálezu, nie však na jeho obmedzenie na tieto príklady. Všetky uvedené citácie a patentové publikácie sú zahrnuté formou odkazu v plnom znení.Prehľad obrázkov na výkresoch Obrázky lA až lB ukazujú charakterizáciu a titráciu vírusu PCV 2 získaného DNA transfekciou a násled nou extrakciou z infikovaných buniek VlDO R 1 pomocou Hirtovej metódy. (A) V PCR (polymerasová reťazová reakcia) boli použité priméry špecifické pre PCV 2 a DNA získané z PCV 2 infikovaných buniek (stlpec

MPK / Značky

MPK: C12N 7/00, C12N 15/09, C12N 15/86, C12N 15/34, C07K 14/075, A61K 39/12, C12N 5/10

Značky: kultivácie, spôsob, circovírusu

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/17-287969-sposob-kultivacie-circovirusu.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob kultivácie circovírusu</a>

Podobne patenty