Vírusom podobné častice, spôsob ich výroby, izolované a purifikované HPV 18 L1 a L2 DNA a farmaceutické prostriedky s ich obsahom

Číslo patentu: 284281

Dátum: 24.11.2004

Autori: Hofmann Kathryn, Jansen Kathrin, George Hugh, Neeper Michael, Joyce Joseph

Je ešte 9 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Sú opísané vírusom podobné častice pozostávajúce z rekombinantného L1 proteínu alebo rekombinantných L1 + L2 proteínov ľudského papilomavírusu 18, ktoré sú najmenej na 60 % čisté, pričom L1 proteín je znázornený na obrázku 1 a L2 proteín je znázornený na obrázku 3. Vynález opisuje aj spôsob výroby týchto vírusom podobných častíc, vakcíny a farmaceutické prostriedky s ich obsahom. Predmetom vynálezu je taktiež izolovaná a purifikovaná HPV18 L2 DNA molekula znázornená na obrázku 3.

Text

Pozerať všetko

Predložený vynález sa týka vírusom podobných častíc pozostávajúcich z rekombinantného Ll proteínu alebo rekombinantných Ll L 2 proteínov ľudského papilomavímsu 18.lnfekcie papilomavírusmi (PV) sa vyskytujú u rôznych živočíchov vrátane človeka, ovce, psa, mačky, králika, opíc, hadov a kráv. Papilomavírusy infikujú bunky epitelu a na mieste infekcie obvykle indukujú nezhubné epítelové alebo ñbroepitelové nádory. Papilomavírusy sú druhovo špecifické infekčné faktory ľudský papilomavírus neinfíkuje iné živočíšne druhy.Papilomavírusy možno podľa hostiteľa, ktorého infikujú, rozdeliť do samostatných skupín. Ľudské papilomavírusy (HPV) sa ďalej delia na viac ako 70 typov podľa homológie V sekvencii DNA. Zdá sa, že PV typy sú typovo špecifické imunogény, a to v tom zmysle, že neutralizačná imunita proti infekcii jedným typom papilomavírusu nevyvoláva imunitu proti inému typu papilomavírusu.U človeka rôzne HPV typy vyvolávajú rôzne choroby. HPV typ l, 2, 3, 4, 7, 10 a 26 až 29 spôsobujú nezhubne bradavíce tak u normálnych jedincov, ako aj u osôb s oslabeným imunitným systémom. HPV typ 5, 8, 9, 12, 14, 15,17, 19 - 25, 36 a 46 - 50 spôsobujú u osôb s oslabeným imunitným systémom ploché lézie. HPV typ 6, ll, 34, 39,41 - 44 a 5 l až 55 spôsobujú nezhubné kondylómy sliznice pohlavných alebo dýchacích orgánov. HPV typ 16 a 18 spôsobujú epitelovú dyspláziu sliznice pohlavných orgánov a spájajú sa s väčšinou in situ a invazívnych karcinómov krčka matemice, pošvy, vonkajších ženských pohlavných orgánov a análneho kanálu.Papilomavírusy sú male (50 až 60 nm) bezobalované ikozahedrické DNA vírusy, ktoré kódujú až osem skorých a dva neskoré gény. Otvorene čítacie rámce (ORF) genómov vírusu sú označené E 1 až E 7 a L 1 a L 2, kde E označuje skoré a L označuje neskoré. L 1 a L 2 kódujú vírusové kapsidově proteíny. Skoré (E) gény sú asociované s funkciami, ako je napríklad replikácia vírusu a bunková transformácia.Protein L 1 je hlavný kapsidový proteín a má molekulovú hmotnosť 55 až 60 kDa. Proteín L 2 je vedľajší kapsidový proteín, ktorého zdanlivá molekulová hmotnosť bola 55 až 60 kDa a zrejmá molekulová hmotnost bola 75 až 100 kDa,ako to bolo stanovené polyakrylamidovou gélovou elektroforćzou. lmunologické údaje naznačujú, že väčšina L 2 proteínu je vnútri L 1 proteínu v rámci kapsoméru vírusu. Ll ORF je vysoko konzervovaný medzi rôznymi typmi papílomavírusov. Proteíny L 2 sú medzi rôznymi papilomavírusmi menej konzervované.Zistilo sa,že gény Ll a L 2 sú dobrým cieľom pre imunoprofylaxiu. Štúdie V systémoch papilomavírusu amerických králikov (CRPV) a hovädzieho papilomavírusu (BPV) ukázali, že imunizácie proteínmi Ll a L 2 exprimovanými V baktériách alebo pomocou vakcínových vektorov ochráníli zvieratá pred virusovou infekciou. Expresia L 1 génov papilomavírusu v expresných bakulovírusových systémoch alebo pomocou vakcínových vektorov viedli ku skompletizovaníu vírusom podobných partikúl (VLP), ktoré boli použité na índukovanie protilátkovej odpovede neutralizujúcej vírusy vo vysokých titroch, ktoré korelujú s ochranou pred virusovou infekciou.Po HPV typ 16, je HPV typ 18 druhým najčastejším typom HPV vyskytujúcim sa v karcinómoch krčka matemice. HPV 18 bol zistený pri 5 - 20 biopsíách cervikálnych nádorov pochádzajúcich z rôznych častí sveta (lkenberg, H. 1990. Human papillomavirus DNA in invasive genital carcinomas. In Genital Papillomavirus lnfections, G. Gross et al., eds. p. 85 - 112). Zdá sa, že existuje geografické závislosť infekcie s HPV 18, pretože v biopsíách nádorov u žien z Afriky a Južnej Ameriky sa HPV 18 vyskytoval častejšie ako v podobných biopsíách u žien z Európy a Sevemej Ameriky. Dôvody pre tieto geografické rozdiely nie sú známe. Príprava vakcíny proti infekcii Vyvolanej vírusom HPV 18 sa stáva mimoriadne dôležitou, pretože HPV 18 je spojený aj s agresivnejšie rastúcimi nádormi a zriedkakedy sa vyskytuje v miemejších prekurzorových lěziách, ClN I-ll.Predložený vynález sa týka vírusom podobných častíc pozostávajúcich z rekombinanmého L 1 proteínu alebo rekombinantných Ll L 2 proteínov ľudského papilomavírusu 18, ktoré sú najmenej na 60 čisté, pričom Ll proteín je znázomený na obrázku l a L 2 proteín je znázomený na obrázku 3. Vynález opisuje aj spôsob výroby týchto vírusom podobných častíc, vakcíny a famiaceutické prostriedky s ich obsahom. Predmetom vynálezu je taktiež izolovaná a purifikovaná HPV 18 L 1 DNA molekula znázomená na obrázku 1, ako aj HPV 18 L 2 DNA molekula znázornená na obrázku 3.Farmaceutický užitočné zmesi obsahujúce DNA alebo proteíny kódované touto DNA možno pripraviť podľa známych spôsobov, ako je napríklad primiešame farmaceutický prijateľného nosiča. Príklady takýchto nosičov a spôsobov prípravy sú uvedené v Remingtoďs Pharmaceutical Sciences. Aby sa pripravila farmaceutický prijateľné zmes vhodná na účinné podávanie, takéto zmesí musia obsahovat účinné množstvo DNA alebo proteínu alebo VLP. Takéto zmesi môžu obsahovať DNA alebo proteíny alebo VLP odvodené z viac ako jedného typu HPV.Terapeuticke alebo diagnostické zmesi podľa vynálezu sa podávajú v množstvách, ktoré sú dostatočné na liečbu alebo diagnostikovanie infekcií papilomavírusmi (PV). Účinné množstvo môže byt rôzne, a to podľa množstva faktorov, ako je napňklad stav pacienta, jeho hmotnosť, pohlavie a vek. lným faktorom je spôsob podania. Vo všeobecnosti, zmesi sa podávajú v dávkach pohybujúcich sa približne medzi l g a l mg.Farmaceutické zmesi sa môžu podávať viacerými spôsobmi, ako je napríklad podanie podkožné, miestne, úsme,sliznicové, vnútrožilové a vnútrosvalove.Vakcíny podľa vynálezu obsahujú DNA, RNA alebo proteíny kódované touto DNA, ktoré obsahujú antigénne determínanty potrebné na índukovanie tvorby neutralizačných protilátok u hostiteľa. Takéto vakcíny sú tiež dostatočne bezpečné na podávanie bez rizika klinickej infekcie nemajú toxické vedľajšie účinky možno ich podávať účinným spôsobom sú stabilné a sú zlúčiteľné s vakcínovými nosičmi.vakcíny možno podávať rôznymi spôsobmi, ako je spôsob ústny, parenterálny, podkožný, sliznicový, vnútrožilový alebo vnútrosvalový. Podávaná dávka môže byt rôzna v závislosti od stavu, pohlavia, hmotnosti a veku pacienta od spôsobu podania a od typu papilomavírusu vo vakcíne. Vakcína môže byt použitá v dávkových formách,ako sú napríklad kapsuly, suspenzie, elixíry, alebo roztokykvapalín. Vakcína môže byt pripravená s imunologicky prijateľným nosičom.Vakcíny sa podávajú v terapeuticky účinných množstvách, t. j. v množstvách, ktoré sú dostatočné na vyvolanie imunologicky ochrannej odpovede. Terapeuticky účinné nmožstvo môže byť rôzne, podľa typu papilomavírusu. Vakcína sa môže podávať ako jedna dávka alebo ako viacnásobné dávky.DNA a deriváty DNA podľa predloženého vynálezu sa môžu použit pri príprave imunogénnych zmesí. Takéto zmesi, ak sa zavedú do vhodného hostiteľa, sú schopné v ňom indukovať imunitnú odpoveď.DNA a deriváty DNA podľa predkladaného vynálezu sa môžu použit pri serotypizácii infekcie HPV a HPV skríningu. DNA, rekombinované proteíny, VLP a protilátky sa dajú použiť pri zostavovaní súprav vhodných na detekciu a serotypizáciu HPV. Takáto súprava by obsahovala rozškatuľkovaný nosič vhodný na pevné udržanie aspoň jednej nádobky. Nosič by ďalej obsahoval reagencie, ako je napríklad HPV 18 DNA, rekombinovaný HPV proteín alebo VLP alebo anti-HPV protilátky vhodné na zisťovanie nmožstva HPV typov. Nosič môže obsahovat aj prostriedok na zisťovanie napríklad značeného antigénu alebo enzýmových substrátov a podobne.DNA a od nej odvodené proteíny sú užitočné aj ako markery molekulovej hmotnosti a veľkosti molekúl.Pretože genetický kód je degenerovaný, na kódovanie jednotlivých aminokyselín možno použit viac ako jeden kodón, a preto sekvencia aminokyselín môže byt kódovaná ktorýrnkoľvek zo skupiny podobných DNA oligonukleotidov. Iba jeden člen skupiny bude totožný so sekvenciou HPV 18, ale bude schopný hybridizovat za vhodných podmienok s HPV 18 DNA dokonca aj v prítomnosti chybných DNA oligonukleotidov. Za zmenených podmienok chybné DNA oligonukleotidy môžu ešte stále hybridizovať s HPV 18 DNA, aby sa umožnilo identiñkovanie a izolovanie DNA kódujúcej HPV 18.lzolovanú HPV 18 DNA podľa predkladaného vynálezu alebo jej liagmenty možno preto použiť na odizolovaníe homológov a fragmentov HPV 18 z iných zdrojov. Aby sa toto dalo urobiť, prvá HPV 18 DNA sa môže zmiešat so vzorkou obsahujúcou DNA kódujúcou homológy HPV 18 za vhodných hybridizačných podmienok. Hybridizovaný DNA komplex sa môže vyizolovať a DNA kódujúca homologickú DNA sa môže z neho purifikovať.Na molekuláme klonovanie DNA HPV 18 sa môže použit viacero spôsobov. Tieto spôsoby zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na priame funkčné exprimovanie génov HPV 18 po zostavení knižnice cDNA alebo genómovej DNA obsahujúcej HPV 18 vo vhodnom expresnom vektorovom systéme. Iným spôsobom je skríning cDNA knižnice alebo genómovej DNA knižnice obsahujúcu HPV 18, skonštruovanú v bakteriofágovom alebo v plazmidovom striedavom vektore, so značeným oligonukleotidovým primerom navrhnutým pre amínokyselinovú sekvenciu vírusu HPV 18. Ďalší spôsob pozostáva zo skrínovania cDNA knižnice alebo genómovej DNA knižnice obsahujúcu HPV 18, skonštruovanú v bakteriofágovom alebo v plazmidovom striedavom vektore, s parciálnou DNA kódujúcou HPV 18. Táto parciálna DNA sa získava amplifikáciou,prostredníctvom špecifickej polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), fragmentov HPV 18 DNA prostredníctvom návrhu degenerovaných oligonukleotidových primerov z aminokyselinovej sekvencie puriíikovaného HPV 18. Ďalším spôsobom je izolácia RNA z buniek produkujúcich HPV 18 a translácía RNA do proteínu pomocou translačného systému in vitro alebo in vivo. Výsledkom translácieRNA do peptidu alebo proteínu je produkcia aspoň časti HPV 18 proteínu, ktorý sa dá identifikovať napríklad aktivitou HPV 18 proteínu alebo imunologickou reaktivitou s anti-HPV 18 protilátkou. V tomto spôsobe zásoby RNA izolovaných z buniek produkujúcich HPV 18 možno analyzovať na prítorrmosť RNA, ktorá kóduje aspoň časť HPV 18. Ďalšie frakcionovanie zásoby RNA sa môže uskutočniť na purifikovanie HPV 18 RNA z RNA inej než HPV 18. Peptid alebo proteín produkovaný týmto spôsobom možno analyzovať, čím sa získajú aminokyselinové sekvencie,ktoré sa zase použijú ako primery na prípravu HPV 18 cDNA, alebo RNA použitá na transláciu sa môže analyzovať s cieľom získat sekvencie nukleotidov kôdujúce HPV 18 a pripraviť primery na skrínovanie cDNA knižnice HPV 18. Tieto spôsoby sú v tejto problematike známe a sú opísané napríklad v publikácii Sambrook, J., Fritsch, E. F.,Maniatis, T. Molecular Cloning A Laboratory Manual,druhe vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.Je zrejmé, že iné typy knižníc, ako aj knižnice zostavené z iných buniek alebo bunkových typov, môžu byť užitočné na izolovanie DNA kódujúcej HPV 18. Iné typy knižníc zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na cDNA knižnice odvodené z iných buniek alebo bunkových línii obsahujúcich knižnice vírusu HPV typ 18 a genómovej DNA.Príprava cDNA knižníc sa môže urobiť viacerými spôsobmi. Spôsoby na Zostavovanie cDNA knižníc sú opísané v publikácii Sambrook, J., el al., uvedené dielo. Je zrejmé,že DNA kódujúcu HPV 18 možno izolovať z vhodnej genómovej DNA knižnice. Zostavenie genómových DNA knižníc sa môže urobit viacerými spôsobmi. Spôsoby zostavovania genómových DNA knižníc sú opísané v publikácii Sambrook, J., et al., uvedene dielo.Klonovaná HPV 18 DNA alebo jej fragmenty získané tu opísanými spôsobmi môžu byť rekombinantne exprimované molekulámym klonovaním do expresného vektora obsahujúceho vhodný promótor a iné vhodné transkripčné regulačné prvky, a môžu sa preniesť do prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských buniek, aby produkovali rekombinovaný HPV 18. Spôsoby takýchto manipulácii sú do detailov opísané v publikácii Sambrook, J., er al., uvedené dielo, a sú V tejto problematike dobre známe.Expresné vektory sú tu definované ako sekvencie DNA,ktoré sú potrebné na transkripciu klonovaných kópií génov a na transláciu ich mRNA vo vhodnom hostiteľovi. Takéto vektory môžu byť použité na expresiu eukaiyotických génov v rôznych hostiteľoch, ako sú napríklad baktérie, modrozelené riasy, rastlinné bunky, hmyzie bunky, bunky plesní a Zvieracie bunky. Špecificky zostrojené vektory umožňujú striedanie DNA medzi hostiteľmi, ako sú napríklad baktérie-kvasinky alebo baktérie-Zvieracie bunky alebo baktérie-plesne alebo baktérie-bunky bezstavovcov. Vhodne zostavený expresný vektor by mal obsahovať počiatok replikácie na autonómnu replikáciu v hostiteľských bunkách, selektovateľné markery, obmedzený počet užitočných miest pre reštrikčné enzýmy, potenciál pre vysoký počet kópií, a aktívne promótory. Promótor je definovaný ako sekvencia DNA, ktorá riadi RNA polymerázu, aby sa navíazala na DNA a iniciovala syntézu RNA. Silný promótor je taký, ktorý spôsobuje, aby sa mRNA iniciovali s vysokou frekvenciou. Expresná vektory môžu zahmovať, no nie sú obmedzené iba na klonovacie vektory, modifikované klonovacie vektory, špecificky zostavené plazmidy alebo vírusy.Na expresiu HPV 18 DNA alebo jej fragmentov V cicavčích bunkách možno použit rôzne cicavčie expresné vektory. Komerčne dostupné cicavčie expresné vektory, SK 284281 B 6ktoré môžu byť vhodné na rekombinovanú expresiu HPV 18, zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na pcDNA 3 (lnvitrogen), pMC 1 neo (Stratagene), pXTl (Stratagene), pSGSNa expresiu HPV 18 DNA alebo jej fragmentov v bakteriálnych bunkách možno použit rôzne bakteriálne expresné vektory. Komerčné dostupné bakteriálne expresné vektory, ktoré môžu byť na tento účel vhodné, zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na pETlla (Novagen), lambda gtllNa expresiu HPV 18 DNA alebo jej fragmentov V bunkách plesní možno použiť rôzne plesňové expresne Vektory. Komerčne dostupné plesňove expresnć vektory, ktoré môžu byt na tento účel vhodné, zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na pYES 2 (lnvitrogen), expresný Vektor Pichia (Invitrogen), a expresný Vektor Hansenula (Rhein Biotech,Düsseldorf, Nemecko).Na expresiu HPV 18 DNA alebo jej fragmentov v bunkách hmyzích buniek možno použiť rôzne hmyzie expresné vektory. Komerčne dostupné hmyzie expresné vektory, ktoré môžu byť na tento účel vhodné, zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na pBlue Bac III (lnvitrogen) a pAcUW 5 lExpresný Vektor obsahujúci DNA kódujúcu HPV 18 alebo jej fragmenty môže byť použitý na expresiu proteínov HPV 18 alebo fragmentov HPV 18 proteínov V bunke,tkanivách, orgánoch, alebo živočíchoch (vrátane ľudí). Hostiteľske bunky môžu byť prokaryotické alebo eukaryotické, zahŕňajúce, no neobmedzujú sa iba na baktérie, ako je napríklad E. wli, plesňové bunky, ako sú napríklad kvasinky, cicavčie bunky zahŕňajúce, no neobmedzujúce sa iba na bunkové línie ľudského, hovädzieho, prasacieho, opičieho a hlodavčieho pôvodu, a hmyzie bunky zahŕňajúce, no neobmedzujúce sa iba na bunkové línie odvodené z octomilky a z priadky morušovej. Bunkové linie odvodené z cicavčích buniek, ktoré môžu byť vhodné, a ktoré sú komerčne dostupné, zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na L bunky L-M(TK) (ATCC CCL 1.3), L bunky L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86),CV-l (ATCC CCL 70), COS-l (ATCC CRL 1650), COS-7Expresný Vektor môže byt do hostiteľských buniek zavedený ktorýmkoľvek z množstva spôsobov, ktoré zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na transformáciu, transfekciu, lipofekciu, fúziu protoplastov a elektroporáciu. Bunky obsahujúce expresný Vektor sa rozklonujú a jednotlivo sa analyzujú, či produkujú protein HPV 18. Identifikácia klonov hostiteľských buniek exprimujúcich HPV 18 sa môže uskutočniť niekoľkými spôsobmi, ktoré zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na imunologickú reaktivitu s anti-HPV 18 protilátkami, a prítomnosť HPV 18 aktivity asociovanú s hostiteľskýTrtí bunkami, ako je napríklad väzba HPV 18-špeciñckého ligandu alebo signálna transdukcia definovaná ako odpoved sprostredkovaná interakciou HPV l 8-špeciflckých ligandov s exprimovanými HPV 18 proteínmi.Expresia HPV DNA fragmentov sa môže tiež uskutočnit in vitro vytvorenou syntetickou mRNA alebo natívnou mRNA. Syntetická mRNA alebo mRNA izolovaná z buniek produkujúcich HPV 18 môže byt účinne translatovanáv rôznych bezbunkových systémoch, ktoré zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na extrakty z pšeničných klíčkov a na extrakty z retikulocytov, a môžu byt účinne translatované aj V bunkových systémoch, ktoré zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na mikroinjekcie do žabich oocytov, pričom mikroinjekcie do žabích oocytov sú výhodné.Po expresii HPV 18 proteínu (proteínov) v hostiteľskej bunke, HPB 18 proteín sa môže získal s cieľom dostať HPV 18 v čistenej podobe. K dispozícii je niekoľko vhodných puriñkačných postupov. Ako je to tu opísané, rekombinovaný HPV 18 proteín môže byt čistený z bunkových lyzátov a extraktov rôznymi kombináciami alebo samostatným použitím soľnej frakcionalizácie, íonexovej chromatograñe, exklúznej chromatograñe, hydroxylapatitovej adsorpčnej chromatografie a hydrofóbnej interakčnej chromatografie.Okrem toho, rekombinovaný HPV 18 možno od iných bunkových proteínov odseparovať imunoañnitnou kolónou pripravenou s monoklonálnymi alebo polyklonálnymi protilátkami špecifickými pre vznikajúci HPV 18, alebo pre polypeptidové fragmenty HPV 18.Možno pripraviť súpravy obsahujúce HPV 18 DNA,fragmenty HPV 18 DNA, protilátky proti HPV 18 DNA alebo proti HPV 18 proteínu, HPV 18 RNA alebo HPV 18 proteín. Takéto súpravy sa používajú na zisťovanie DNA,ktorá hybridizuje s HPV 18 DNA, alebo na zisťovanie prítorrmosti HPV 18 proteínu (proteínov) alebo peptidových fragrnentov vo vzorke. Taká charakterizácia je užitočné na rôzne účely, ktore zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na súdne analýzy a epídemiologické štúdie.V prípade kombinovanej liečby s viac ako jedným aktívnou látkou, kde aktívne látky sú v rôznych dávkových zloženiach, aktívne látky možno podávať súbežne, alebo každá z nich môže byt podaná v oddelenom čase.Dávkový režim využívajúci zlúčeniny podľa predloženého vynálezu je volený v súlade s množstvom faktorov, ako sú typ, druh, vek, hmotnost, pohlavie a medicínsky stav pacienta závažnost stavu, ktorý sa má liečiť spôsob podania obličkové a pečeňovć funkcie pacienta a daná zlúčenina, ktorá sa má použiť. Lekár s bežnými skúsenosťami môže ľahko určiť a predpísat účinné množstvo liečiva požadovaného na prevenciu, spomalenie alebo zastavenie progresie tohto stavu. Optimálna presnosť pri dosahovaní koncentrácii liečiva V rámci rozpätia, ktoré je účinné bez toxicity, vyžaduje režim založený na kinetike dostupnosti liečiva na cieľových miestach. Toto zahŕňa aj zváženie distribúcie, rovnováhy a vylučovania liečiva.Nasledujúce príklady ilustrujú predložený vynález, ale bez jeho akéhokoľvek obmedzovania.Prehľad obrázkov na výkresochNa obr. 1 je nukleotidová sekvencia a od nej odvodená aminokyselinová sekvencia proteínu L 1 vírusu HPV 18.Na obr. 2 je zoznam aminokyselinových variantov v rámci proteínu Ll vírusu HPV 18.Na obr. 3 je nukleotidová sekvencia a od nej odvodená aminokyselinová sekvencia proteínu L 2 vírusu HPV 18.Na obr. 4 je imunoblot proteínu L 1 vírusu HPV 18 exprimovaného V kvasinkách.Na obr. 5 je imunoblot proteínu L 2 vírusu HPV 18 exprimovaného V kvasinkách.Na obr. 6 je mikrofotograña z elektrónového mikroskopu ukazujúca vírusom podobné partikuly Vytvorené proteínom L 1 vírusu HPV 18 exprimovanom v kvasinkách.Príklad 1 Klonovanie genómu HPV 18Celková genómová DNA bola pripravená z bunkovej linie odvodenej z ľudského karcínómu krčka matemice,SW 756 (Freedman, R. S., et al., 1982, In vitro, 18 719 726) s použitím štandardných postupov. DNA bola poštíepená enzýmom EcoRl a podrobila sa elektroforéze cez 0,8 agarózový preparatívny gél s nízkou teplotou topenia. Vyrezal sa prúžok gélu, ktorý zodpovedal fragmentom DNA s dlžkou približne 12 kbp. Agaróza bola poštíepená enzýmom AgaraseTM (Boehringer Mannheim, Inc.) a DNA frakcionovaná podľa veľkosti bola precipitovaná, defosforylovaná a pospájaná s ramenami lambda EMBL 4 poštíepený/mi enzýmom EcoR 1 (Stratagene, Inc.). Lambda knižnica bola zbalená baliacim extraktom Gígapack Il Gold (Stratagene, Inc.). HPV 18 pozitívne klony boli zísťovane pomocou HPV 18 L 1 DNA primeru s dĺžkou 700 bp, ktorý bol generovaný polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) s použitím SW 756 DNA ako templátu a oligonukleotidových primerov, ktoré boli zostavené na základe publikovanej sekvencie HPV 18 Ll DNA (Cole a Danos, 1987, J. M 01. Biol., 193 599 - 608,Genbank, položka číslo X 05015). Izoloval sa HPV 18 pozitívny lambda klon, ktorý obsahoval EcoRl fragment dlhý 12 kbp a bol označený 187 - l.Príklad 2 zostavenie kvasinkových expresných vektorovOtvorený čítaci rámec (ORF) HPV 18 L 1 bol amplifikovaný pomocou PCR použitím klonu 187-1 ako templátu, Vent polymerázyTM (New England Biolabs, Inc.), 10 cyklov ampliñkácie (94 °C, l min. 50 °C, 1 min. 72 °C, 2 min.) a nasledovných oligonukleotidových primerov, ktoré obsahujú príľahlé BgIII miesta (podčiarknuté) sense primer,5-GAAGATCTCACAAAACAAAATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTG-3, antísense primer,5 -GAAGATC TTTAC TTCCTGGCACGTACACGCACACGC-3 .Sense primer zavádza kvasinkovú netranslatovanú leader sekvenciu (Kniskem, et al., 1986, Gene, 46 135 - 141) ihned smerom k HPV 18 L 1 iniciačnému metionínovému kodónu (zvýraznené polotučne). 1,5 kbp L 1 PCE produkt bol poštíepený enzýmom BgIII a čistený na géli.Kvasinkový expresný Vektor pGALl-10 bol zostavený izoláciou 1,4 kbp SphI fragmentu z pUCl 8/obojsmemého promótorového plazmidu GAL, ktorý obsahuje divergentné promótory GALI-GALIO kvasinky Saccharamyces cerevil siae z plazmidu pBM 272 (získaný od Marka Johnstona,Washington University, St. Louis, MO). Divergentné promótory susedia na každej strane s kópiou kvasinkového terminátoru transkripcie ADHI, s klonovacím miestom BamHI umiestneným medzi GAL 1 promótorom a prvou kópiou terrninátora transkripcie ADH a s klonovacím miestom SmaI umiestneným medzi promótorom GALIO a druhou kópiou terminátoru transkripcie ADH 1. Kvasinkový striedavý Vektor pozostávajúci z pBR 322, kvasinkového LEU 2 d génu, a z kvasinkového 2 plazmidu (dar od Benjamina Halla, University of Washington, Seattle, WA) bol poštíepený enzýmom SphI a spojený s 1,4 kbp Sphl divergentným GAL promótorovým fragmentom, z čoho vznikol pGALl-10. pGAL 1-10 bol linearizovaný enzýmom BamHI, ktorý štiepi medzi promótorom GAL/ a terminátorom transkripcie ADHI. Vektor poštíepený enzýmom BamHI a HPV 18 L 1 PCR fragment poštíepený enzýmom BgII boli spojené a použite na transformáciu E. caIi DH 5 buniek(Gibco BRL, Inc.). Vyizoloval sa plazmid pGAL 1-10, ktorý obsahuje gén HPV 18 L 1 a bol označený p 191-6.Zostavil sa kvasinkový expresný Vektor, ktorý exprimuje spolu gén HPV 18 L 1 a L 2. Plazmid p 191-6 (pGALl 10 HPV 18 L 1) bol poštíepený enzýmom SmaI, ktorý štiepi medzi promótorom GAL 10 a termjnátorom transkripcie ADH 1. Gén 1,4 kbp HPV 18 L 2 bol amplífikovaný pomocou PCR, ako to bolo opísane s použitím nasledovných oligonukleotidových primerov, ktoré obsahujú priľahlć SmaI miesta (podčiarknuté) sense primer,5-TCCCCCGGGCACAAAACAAAATGGTATOCCACCGTGCCGCAOGAC-B,antisense primer,5-TCCCCCGGGCTAGGCCGCCACAAAGCCATCTGC~ 3 ÄSense primer zavádza kvasinkovú netranslatovanú leader sekvenciu (Kniskem et al., 1986, citovaná práca) ihneď smerom k HPV 18 L 2 iniciačnému metionínovému kodónu (zvýraznené polotučne). PCR fragment bol poštíepený enzýmom SmaI, čistený na géli a spojený s plazmidom p 191-6, ktorý sa poštíepil enzýmom SmaI. Vyizoloval sa plazmid pGALl-10 obsahujúci oba gény, HPV 18 L 1 a L 2, a bol označený p 195 ll.Bioptické vzorky z krčka matemice sa získali vo Veterans Administration Medical Center v Indianapolise, IN(Dr. Darron Brown) a v Albert Einstein Medical Center vo Philadelphii, PA (Dr. Joan Adler) a zmrazili sa na -20 °C. DNA bola izolovaná, ako to bolo opisané autormi Brown et al., 1993 (Brown, D. et al., 1993, J. Clin. Microbiol., 31 2667 - 2673). V stručnosti, klinické vzorky sa spracovali pomocou mikrodismembrátora Il firmy Braun (B. Braun Instruments, Melsungen, Nemecko) a solubilizovali sa v tlmivom roztoku obsahujúcom 10 mM EDTA a 0,6(hmotnosť/objem) dodecylsulfátu sodného (SDS). Vzorky sa nastavili na 20 mM Tris pH 7,4 a proteiny sa poštiepili pomocou 50 ug/ml proteinázy K V prítomnosti 0,1 g/m 1 RNázy A a potom sa extrahovali zmesou fenol/chloroform/izoamylalkohol. DNA sa precipítovala etanolom a kvantiñkovala sa spektrofotometricky.Vzorky DNA sa skrínovali na prítomnosť HPV 18 pomocou PCR a analýzou Southern blote. 256 bp segment HPV 18 L 1 ORF sa ampliñkoval pomocou PCR s použitím nasledovných oligonukleotidových primerovPCR podmienky boli v súlade s odporúčaniami výrobcu pre súpravu AmplíTaqTM DNA Polymerase/GeneAmpTM(výrobca Pcrkin Elmer Corp.) s výnimkou, že ako templát sa použilo 0,5 l klinickej vzorky DNA a v konečnej reakčnej zmesi bolo 10 pmol z každého primeru, 2 mM dNTPs a 2,0 mM MgClz. Denaturovalo sa 2 min. pri 94 °C, potom nasledovalo 40 cyklov amplifikácie (94 °C, 1 min. 45 °C,l min. 72 °C, l ním).PCR produkty boli podrobené elektroforéze cez 3,0 agarózový gél, naniesli sa na nylonové membrány a hybridizovali sa s HPV 18 Ll-špecilickým oligonukleotidovým primerom značeným s 3213.Príklad 4 Sekvenovanie DNA génov Ll a L 2Gény HPV 18 L 1 a L 2 v klonoch l 87-l, pl 9 l-6 apl 95-11 sa sekvenovali sekvenovacou súpravou PRIZM a auto

MPK / Značky

MPK: C07K 16/08, C07K 14/025, C12N 15/37, A61K 39/12

Značky: obsahom, vírusom, podobně, farmaceutické, spôsob, izolovaně, purifikované, výroby, částice, prostriedky

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/17-284281-virusom-podobne-castice-sposob-ich-vyroby-izolovane-a-purifikovane-hpv-18-l1-a-l2-dna-a-farmaceuticke-prostriedky-s-ich-obsahom.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Vírusom podobné častice, spôsob ich výroby, izolované a purifikované HPV 18 L1 a L2 DNA a farmaceutické prostriedky s ich obsahom</a>

Podobne patenty