Vektor pre efektívny výber a/alebo maturáciu protilátky a jeho použitie

Číslo patentu: E 9775

Dátum: 27.12.2006

Autori: Pavoni Emiliano, Minenkova Olga

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 Tento objav sa týka metódy zlepšovania kapacity selekcie protilátok vo fágových peptidových knižniciach, v ktorých je spomínané zlepšenie dosiahnuté pomocí zníženia úrovne expresie protilátok v daných knižniciach, Oblasť objavu0002 Technológia rekombinantnej DNA poskytuje lacnú a užitočnú alternatívu k produkcii monoklonálnych protilátok. Výskyt rembinantných protilátok v kapsídách bakteriofágov, známy ako phage-display, nielen že umožňuje vytvorenie knižníc humánnych protilátok pre výber špecifických väzobných štruktúr, vďaka čomu je možno získať pre terapiu protilátky, ktoré nevyvolávajú u pacientov nežiaducu imunitnú odozvu, ale také uľahčuje añnitnú maturáciu protilátok vďaka vytvorenie knižníc mutantných protilátok a klonov s vyššou atinitou.0003 Možnost objavovania väzbových skupín s vysokou añnitou charakterizuje kvalitu knižnice rembinantných protilátok, ktorá závisí na niekoľkých faktoroch, ako je napríklad veľkost knižnice, diverzita a zdroje imunoglobulinových génov.0004 Je známe, že rôzne Iymfatické tkanivá od imunizovaných alebo neimunizovaných darcov, ako napriklad Iymfocyty z periférnej krvi, sleziny a kostnej drene a dokonca i tkanivo z metastázovaných alebo drenážovaných Iymfatických uzlín osôb postihnutých nádorom, môžu slúžiť ako zdroj pre škálu špecifických protilátok.0005 Hoci sú knižnice prirodzených (naive) protilátok rozmanitejšie a môžu viest k izolácii širokého spektra protilátok, možno sa domnievat, že vytvorenie knižnice rembinantných protilátok z lg súboru pacientov ovplyvnených špeciñckými chorobami, môže poskytnúť fragmenty protilátok s vyššou väzobnou afinitou voči určitým antigénom. 0006 Niekoľko skôr publikovaných štúdií popisuje vytvorenie knižníc rembinantných protilátok z tumorom ovplyvnených lymfatických uzlín (Clin. Exp. Immunol. 1997 109(1)166-74 Int. J. Mol. Med. 2004 14(4)729-35 World J. Gastroenterol. 2004 10 (18)2619-23). Tieto štúdie sú založené na všeobecnom názore, že tkanivá Iymfatickýchuzlín pacientov s rakovinou sú inñltrované B-lymfocyty, ktoré môžu slúžiť ako zdroj tumor-špeciñckých protilátok.0007 Je pomerne obtiažne získat metastázované lymfatické uzlín pacientiek s rakovinou prsníka, ako čerstvý chirurgický material. V súlade so súčasnou praxou chirurg odstraňuje iba sentinelovú uzlinu alebo malý zhluk uzlín(sentinelovú uzlinu a uzliny najbližšie k tejto), vdaka čomu vykonáva menej invazívny chirurgický zákrok s menšími vedľajšími účinky, namiesto odstránenia viac Iymfatických uzlín, čo bol skôr vykonávaný postup. Pri rozboru je prakticky celá sentinelová uzlina testovaná na prítomnost mikrometastáz alebo jednotlivých rakovinových buniek. Teda, nie je prakticky možné získat použiteľný materiál po zákroku u pacienta s rakovinou prsníka.0008 Dôkaz, že z tumor-infiltrujúcich B-lymfocytov (TlL-B) odvodené protilátky môžu slúžiť k rozpoznávaniu nádorových buniek, bol získaný vytvorením ľudských hybridomov, získaných z TlL, schopných vylučovat tumoršpeciñcká protilátky (Lancet. 1982 1(8262)11-4 Br. J. Cancer, 1983 47(1) 135-45) namnoženlm B-lymfocytov z TIL z biopsii ľudských nádorov (Cancer Immunol. Immunother. 1994 38(4)225-32) namnoženlm B-lymfocytov z TIL melanómu a nasledujúcim klonovaním scFv protilátok z jednotlivých B-Iymfocytov so špecifickou reaktivitou na melanóm (Cancer Res. 1995 553584-91) á subkutánnou transplantáciou ľudské pľúcne rakovinové tkanivá produkujúce ľudské protilátky odvodené z TIL-B, ktoré rozpoznávajú dva tumor-špeciñcké proteíny,imunodeñcientným myšiam (Cancer Invest. 200018(6)530-6 Cancer Res. 2002 62(6)1751-6), čo napovedá o špeciñcké funkcii TIL-B v tumoru.0009 V nedávnej dobe sa ukázalo, že karcinóm maternicového hrdla a vzácny druh rakoviny prsníka, klasitikovaný ako medulárny karcinóm (MCB), sú charakterizované Iymfoplazmacytovou intiltráclou, ktorá koreluje so zlepšením prognózy a prežitím pacientov. Tieto nemoci boli skúmané, aby bolo dosiahnuté hlbšie porozumenie povahe tumorínñltrujících B-Iymfocytov(TIL-B), také za použití metód fágových knižníc. Štúdie molekulárnej štruktúry variabilných oblasti protilátok poskytla dôkazy o antigénom poháňanej humorálnej imunitnej odozve u medulárnych karcinómov prsníka, rovnako ako u cervikálnych nádorov. Oligoklonálna predominancia nájdená v génoch protilátok odvodených z TIL indikovala možnú klonálnu selekciu lg molekúl proti špeciñckým neoantigénom nadprodukovaným alebo špecificky produkovaným v nádorovom tkanive (Cancer Immunol. Immunother. 2001 50(10) 523-32 Cancer Res. 2001 61(21)7889-99 Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A. 2001 98(22)12659-64 J. Immunol. 2002 169 (5)2701-11).0010 Navzdory výrazným vyššie uvedeným náznakom, že nádorové tkanivo je inñltrované aktivovanými Blymfocytmi, ktoré môžu slúžiť ako zdroj tumor-špeciñckých protilátok, niekoľko výskumných skupín pri experimentoch sledujúcich TIL-odvodené fágové knižnice proti puriñkovaným známym nádorovým antigénom, alebo živým nádorovým bunkám, alebo zmrazeným tkanivovým sekciám, neuspeío pri výbere bud špeciñcké protilátky rozlišujúcej medzi nádorovými a normálnymi bunkami, alebo protilátky reaktívne s antigénmi povrchu nádorových buniek (Cancer Res. 2001 61(21)7889-99 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001 98(22)12659-64 Int. J. Cancer 2001 932832-40). Neskôr dve rôzne výskumné skupiny dokázali identifikovať špecifické protilátky rozpoznávajúce nádorové bunky z tohto druhu fágových knižníc (J. Immunol. 2002 1691829-36 J Immunol. 2005 175(4)2278-85).0011 Alternatívny pristup, založený na systému fágových knižníc odvodených z nádorov a protokoloch priameho screeningu plakov, ktoré zabránili obmedzeniu systému phage-display, umožnili Wu a kol. (Cancer lmmunol Immunother. 2002 51 (2) 79-90) izolovať niekoľko protilátok, ktoré špecificky viažu kultivované nádorové bunky. Táto štúdia ukazuje, že pozorované obtiaže pri výbere protinádorových protilátok z TIL-odvodených fágových knižníc pramení nedokonalosti známych vektorov. Avšak priamy screening také nie je dokonalá metóda pre výber rembinantných protilátok z rozsiahlych knižníc. vskutku ide o prácny postup vyžadujúci mnoho času a prostriedkov, v porovnaní stechnológiou fágových knižníc. Barbas a kol. (Phage Display a Iaboratory manual, ISSN 0-87969-546-3, O(2001) pages l-XVI, 1.1) zverejnili phage-display vektory (pComb 3 H a pComb 3 X), kde sú scfV fragmenty viazané na 180 ak C-konec gplll povrchového proteínu (ak 230-460) vláknitého fágu. Také zverejnili fazmidy zahŕňajúce nízko účinné alebo represibilné promótory (plac) vo fasmídových vektoroch a metódy použitia týchto vektorov pri selekcii a maturácii scFv. Európska patentová prihláška EP 1 452 599 popisuje phage-display vektory, fazmidy a fágové knižnice, ktoré obsahujú rôzne epitopné peptidové alebo bielkovinové domény s potenciálom pre väzbu cielového materiálu. V WO 92101047 boli zverejnené metódy produkcie multimerového člena špecíñckého väzbového páru(sbp), ktoré zahŕňajú expresiu prvého polypeptidového reťazca špecifického väzbového páru v rekombinantncm hostíteľskom organizme, alebo geneticky diverznej populácii tohto typu sbp členu, začleneného do komponentov vylučovaného replikovatelneho genetického balíčka (replicable genetic display package (rgdp. ktorý taktiež na povrchu obsahuje polypeptidy a expresia druhého polypetidového reťazca multiméru v rekombinantncm hostiteľskom organizme, a spôsobovanie alebo umožnenie spojenia polypeptidových reťazcov za tvorby multiméru ako súčasti rgdp, exprese najmenej jedného z polypeptidových reťazcov je z nukleovej kyseliny, ktorá je schopná byt spracovaná do balíčku za použití komponenty, kde genetický materiál každého rgdp kóduje polypeptidový reťazec. Taktiež popisuje fasmídové vektory v ktorých sú scFv nukleotidové sekvencie začlenené do glll povrchového proteínu vláknitého fágu a prípravu menovaných scFv. W 0 93/11236 popisuje metódu pre (a) tvorbu knižnice replikovateľných genetických balíčkov (rgdp), ktoré majú na svojom povrchu člen špeciñckého väzbového páru (sbp), a každý obsahuje nukleovú kyselinu sa sekvenciou odvodenou z druhov cicavcov kódujúce polypeptidový reťazec, ktorý je súčasťou sbp členu prítomného na povrchu a (b) selekciu väzbou so self-antigénom (Ag) jedného alebo viacej sbp členov so špecítičnosťou pre self-antigén.0012 Žiadatelia vykonali screening rembinantných protilátok fágových knižníc odvodených z TIL-B za použitianového fasmidového vektora pKM 19 a predviedli účinnú selekciu tumor-špecifických protilátok pre požadované antigény tumoru, rovnako ako pre živé bunky karcinómu prsníka.0013 Autori objavili, že je možné zvýšiť účinnosť selekcíe a/alebo maturácie rembinantných protilátok z knižníc za použitia systému phage-display, pomocou vhodných modiñkácíl skôr užívaných vektorov. Predchádzajúce vektory sú napríklad fasmidové vektory opisanej v Antibody Engineering - A practical approach (McCafferty, J. Hoogenboom, H. 8. Chiswell D., eds), pp.325, Oxford University Press, 1996).0014 Predmetom súčasného objavu je vektor vhodný pre účinnou selekciu a/alebo maturáciu rekombínantnej protilátky zo skupiny ScFv, aktívny fragment protilátok, humanizované sekvencie protilátok, menovaný vektor je charakterizovaný tím, že i) obsahuje aspoň jeden prvok schopný redukovať úroveň expresie rekombínantnej protilátky patriace do skupiny a) potlačený terminálny kodón vo vnútri sekvencie kódujúci navádzací (leader) peptid alebo protilátku b) promótor s nízkou účinnosťou spúšťajúci transkripciu kódujúcej sekvencie menované protilátky a ii) má zvýšenou účinnosť projekcie menovaných protilátok pomocou a) začlenenia kódujúcej sekvencie rekombínantnej protilátky do sekvencie kódujúcej C-koncovú časť plll proteínu a b) použitím navádzacieho peptidu alkalické fosfatázy E. Coli ako navádzacieho peptidu rekombínantnej protilátky, a c) elimináciu stôp (amber) kodónov medzi sekvenciou kódujúcou rekombinantnú protilátku a sekvenciou kódujúcou plll, kde úroveň expresia rekombínantnej protilátky môže byt znížená inhibítorom promótoru riadiaceho transkripciu menovanej kódujúcej sekvencie protilátky.0015 Vektor podľa tohto objavu môže byt plazmid, fazmid, fág, alebo akýkoľvek vektor známy osobám znalým oboru.0016 Barbas a kol. (Phage Display a Iaboratory manual, ISSN 0-87969-546-3, (2001) strany l-XVI, 1.1) uverejnili phage-display vektory (pComb 3 H a pComb 3 X), kde sú scFv fragmenty pripojené na 180 ak C-koniec gplll povrchového proteínu (ak 230-460) vláknitého fágu. Ďalej predstavuje fazmidy zahŕňajúca nízko-účinné alebo represibilné promótory (plac) vo fasmidových vektoroch a metódy použitia menovaných vektorov pri selekcii a maturácii scFv.0017 Európska patentová prihláška EP 1 452 599 popisuje vektory pre metódy phage-display, fazmidy a knižnice fágov, ktoré nesú rôzne epitopné peptidy alebo domény proteínov s potenciálom pre väzbu cíelového materiálu. 0018 V W 0 92/01047 boli zverejnené metódy produkcie multimerového členu špecifického väzbového páru (sbp),ktoré zahŕňajú expresíu prvého polypeptidového reťazca špecíñckého väzbového páru v rekombinantncm hostitelskom organizme, alebo geneticky diverznú populáciu tohto typu sbp členu, začleneného do komponentu vylučovaného replikovatelného genetického balíčka (rgdp), ktorý taktiež na povrchu obsahuje polypeptídy a expresia druhého polypetidového reťazca multiméru v rekombinantncm hostiteIskom organizme, a spösobovanie alebo umožnenie spojenia polypeptídových reťazcov za tvorby multiméru ako súčastí rgdp, exprese namenej jedného z polypeptidových reťazcov je z nukleové kyseliny, ktorá je schopná byt spracovaná do balíčka, za použitia komponentov, kde geneticky materiál každého rgdp kóduje polypeptidový reťazec. Taktiež popisuje fasmidové vektory v ktorých sú scFv nukleotidové sekvencie začleněné do gIII povrchového proteínu vláknitého fágu a pripravu menovaných scFv. W 0 93/112236 popisuje metódu pre pripravu knižnice replikovatelných genetických balíčkov (rgdp),ktoré majú na svojom povrchu člen špecifického väzbového páru (sbp), a každý obsahuje nukleovou kyselinu so sekvenciou odvozenou zo druhov cicavcov kódujúcou polypeptidový reťazec, ktorý je komponentom člena sbp prítomného na povrchu a (b) selekciu vázbou so self-antigénom (Ag) jedného alebo viacej sbp členov so špeciñčnosťou pre self-anligén.0019 Teda predmetom súčasného objavuje vektor vhodný pre účinnú selekciu a/alebo maturácíu rekombínantnej protilátky náležiacej do skupiny ScFv, aktívne fragmenty protilátok, humanizované sekvencie protilátok, menovaný vektor je charakterizovaný tým, žei) obsahuje aspoň jeden prvok schopný znížit hladinu exprese rekombinantnej protilátky zo skupiny a) potlačený terminálny kodón vo vnútri sekvencie kódujúci navádzací peptid alebo protilátku b) nízkoúčinný promótor spúšťajúci transkripciu kódujúcej sekvencie menované protilátky a ii) má zvýšenou účinnost projekcie menovaných protilátok pomocou a) začlenenia kódujúcej sekvencie rekombinantnej protilátky do sekvencie kódujíce C-koncovú časť plll proteínu a b) použitím navádzacieho peptidu alkalické fosfatázy E. Coli ako navádzacieho peptidu rekombinantnej protiIátky,- a c) elimináciou stôp (amber) kodónov medzi sekvenciou kódujúcou rekombinantnu protilátku a sekvenciou kódujúcou plll,kde úroveň expresie rekombinantnej protilátky môže byt znížená inhibítorom promótoru riadiaceho transkripciu menovanej kódujúcej sekvencie protilátky. 0020 Promótory s nízkou účinnosťou sú známy v oboru a ich príklady sú uvedené v Biochem J. 1970 117 741-746). Vhodné inhibítory promótorov sú známy v oboru a ich príklady sú uvedené v J. Bacteriol. 1979,138(1)40-7. 0021 Ďalším predmetom tohto objavuje fazmidový vektor s nukleotidovou sekvenciou SEQ ID N 0 1. 0022 Tento Vektor, označovaný pKM 19, je navrhnutý pre prenos rembinantných protilátok v jednoreťazcovom formáte na povrchu vláknitého fágu. 0023 Ďalším predmetom objavu je fágová protilátková knižnica získaná klonovaním cDNA do vektoru objavu. V ideálnom prípade je knižnica zlskaná klonovaním cDNA z buniek produkujúoich protilátky, pokiaľ možno z tumor inñltrujúcich lymfocytov (TIL) alebo lymfocytov periférnej krvi (PBL). Preferovaným aspektom je prípad, ked sú tieto protilátky produkujúce bunky izolované zo subjektu ovplyvneného tumorom, pokial možno subjektu postihnutého rakovinou prsníka. Alternatívou je knižnica skladajúca sa zo syntetických alebo sami-syntetických protílátkových knižníc, tiež mutovaných pre atinitnú maturáciu protilátok. 0024 Ďalším predmetom tohto objavu je hostitelská bunka transformovaná pomocou vektora, ktorý je predmetom objavu. Ďalším predmetom objavu je metóda pre zlepšovania selekcie a/alebo maturácie rekombinantnej protilátky zahŕňajúca krok klonovania a expresie cDNA alebo syntetické alebo semi-syntetické sekvencie protilátok, i mutovaných za účelom añnitnej maturácie protilátok, do vektorov, ako sú popísané vyššie. 0025 Objav bude ďalej opísaný pomocou príkladov, ktoré nie sú Iimitujúce a odkazujú k nasledujúcim obrázkomDetailní opis obrázkov 0026Obrázok 1. Schematický opis základných elementov pKM 16, plazmidu využívaného k produkcii rozpustných protilátok v scFv formáte a základné elementy pKM 17, pKM 18 a pKM 19 plazmidov využívaných pri produkcii phage-display protilátok. Tieto plazmidy riadia expresiu protilátok pod kontrolou pLac promótoru. Unikátny Ncol a Notl klonovacie miesta umožňujú inzerciu génu protilátky pre expresiu jednoreťazcových protilátok s navádzacím peptidom bakteriálneho periplazmatického enzýmu, alkalickej fosfatázy (PhoA leader peptide). Plazmld pKM 17 kóduje celý protein plll (406 ak) a plazmidy pKM 18 a pKM 19 kódujú C-koncovú část plll (197 ak). Plazmld pKM 19 obsahuje amber kodon v navádzaoej sekvencii alkalickej fosfatázy.Obrázok 2. Popisuje detailnú štruktúru fasmidového vektoru pKM 19. Špecifické modifikácie sú uvedené na obrázku a opísané v textu.Obrázok 3. Produkcia rozpustných scFv za použití plazmidu pKM 16. Tri nezávislé klony získané klonovaním génu pre scFv anti-karcino-embryonálny antigén (CEA) v pKM 16 boli testované pre produkciu rozpustných scFv(gélové linky 1-3). Frakcie periplazmatických proteínov boli purítikované z baktérií metódou opakovaného rozmrazovania. Markér veľkosti proteínovje zahmutý.Western blotová membrána bola vyvinutá s anti-FLAG AP-konjugovanou sekundámou protilátkou. Pásma zodpovedajúce rozpustným scFv protilátkam (očakávaná molekulová hmotnost 26 kDa) migrujú medzi 24,5 a 35,9 kDa pásmami.Obrázok 4. uvádza účinnost plazmidov pKM 17, pKM 18 a pKM 19 v porovnaní so systémom klasických fasmidov. Anti-CEA scFv protilátky nesené tromi rôznymi plazmidy boli stanovované testom ELISA proti CEA proteínu a porovnané s MA 39 fágom (anti-CEA/pDN 322). Pomocný fág, M 13 KO 7, ktorý nenesie fragmenty protilátok, bol použitý ako negatívna kontrola. Uvádzané dáta sú priemerné hodnoty duplikátne vykonaných skúšok. Najvyššia koncentrácia fágov, označená hviezdičkou, zodpovedá 10 TU pre všetky fágy a 3 x 10 TU pre anti-CEA/pKM 17. ELISA test bol vykonaný za použitia anti-M 13 (panel A) alebo altematívne anti-FLAG sekundárnej protilátkyObrázok 5. Filtrácia vzoriek fágov. Asi 2 x 10 TU/jamku každého preparátu alebo zodpovedajúce množstvá vzoriek ñltrátu boli testované systémom ELISA a vyvinuté bud s anti-M 13 (panel A) alebo anti-FLAG (panel B) sekundárnymi protilátkami. Uvádzané dáta sú priemerné hodnoty vykonaných skúšok. Dáta prestavujú reaktivitu ñltrátov voči CEA ako percento hodnoty pôvodnej reaktivity neíiltrovaných vzoriek (100).Obrázok 6. Kompetícia s rozpustnými anti-CEA scFv. Čerstvo pripravené supernatanty MA 39 (10 l) a antiCEA/pKM 19 (5 l) fágov boli porovnané s rôznymi množstvami puritikovanej rozpustnej anti-CEA protilátky. Dáta sú vyjadrené ako percento hodnoty reaktivity supernatantov bez kompetílorov. irelevantné rozpustné anti-SP 2 scFv boli použité ako negatívna kontrola.Obrázok 7. Kompetícia s ñltrátom supernatantu fágov. Čerstvo pripravené supernatanty MA 39 (10 I) a antiCEA/pKM 19 (5 l) fágov boli porovnané s 10 l alebo 50 l tiltrátov supernatantov rovnakých fágov. Dáta súvyjadrené ako percento reaktivity supernatantov bez kompetítorov.Obrázok 8. Western blot PEG-puriñkovaných rekombinantných fágov. Proteínové extrakty z približne 5 x 109 PFU fágov MA 39, anti-CEA/pKM 18 a anti-CEA/pKM 19, a 1 x 109 PFU anti-CEA/pKM 17 boly frakcionovány pomocí SDSPAGE a prenesené na nitrocelulózovou membránu. Prúžky membrány boli vyvinuté anti-FLAG AP-konjugovanou protilátkou. Marker veľkosti proteínu je zahrnutý (posledný prúžok). ScFv-plll (66,1 kDa) a scFv-Aplll (45,2 kDa) proteíny migrovali v pásmu vyššej molekulovej hmotnosti kvôli skôr opísanej anomálnej časti pIII proteínuObrázok 9. Selekcia voči SPZ-GST proteínu. Ukazuje reaktivitu súboru fágov získaných z prvého a druhého cyklu panningu scFvEC 23 knižnice. GST (glutathion S-transferáza), mlieko a streptavidín, prítomné v selekčnom systéme sú zahrnuté ako negatívna kontrola. Dáta sú uvádzanéa ako priemer hodnôt získaných v duplicitne vykonávaných skúškach. Fágový vstup bol normalizovaný. pretože v ELISA testu bolo použité 3 x 109 TU každého preparátu na jednu jamku.Obrázok 10. Atinitná selekcia maturovaného anti-CEA génu z maturačnej knižnice. V tejto skúške boli vyvíjané pozitívne imunitné reakcie anti-FLAG AP-konjugovanými sekundárnymi protilátkami, aby boli zmiernené pozitívne signály a zviditeľnenà zvyšujúca sa reaktivita v priebehu procesu selekcie. Pomocný fág, M 13 K 07, ktorý nenesie fragmenty protilátok, bol zahrnutý ako negatívna kontrola. Uvedená je reaktivita pôvodnej anti-CEA protilátky v pkM 19 (anti-CEA/pKM 19), maturačnej knižnica (Lib.), súbory fágov po prvom a druhom cykle selekcie (l round,II round) a jednotlivé klony (cl 1, cl 2) zo súboru fágov po druhom cykle afinitnej selekcie, testované na CEA a irelevantnom GST protelne. Uvedené dáta sú priemerné hodnoty duplicitne vykonaných skúšok.Obrázok 11. Reaktivita rozpustných maturovaných scFv v testu ELISA. Rôzne množstvá rozpustných protilátok bola testované na CEA-potiahnutých doštičkách. Zachytené scFv boli vyvinuté za použitia anti-FLAG sekundàrnej protilátky. Uvedené dáta sú priemerné hodnoty duplicitne vykonaných skúšok. Ako kontrola boli zahrnuté irelevantné anti-SP 2 protilátky a maturované anti-CEA E 8 protilátky, získané skôr (Pavoni et al., 2006).Obrázok 12. Špecifickosť maturovaných klonov. Približne 250 ng na jamku pôvodných a maturovaných protilátok v rozpustné forme bolo stanovené s CEA a rôznymi irelevantnými proteinmi. Ako negatívna kontrola bola použitáirelevantné protilátka anti-SP 2. Uvedené dáta sú priemerné hodnoty duplicitne vykonaných skúšok. Obrázok 13. V(D)J analýza génov TIL-odvodených protilátok. A. SMART cDNA odvodené z 10 rôznychnádorových vzoriek (pacienti E 84, E 85, 887, 889, E 90, E 91, E 92, 893, E 95, E 96), z normálnych prsných tkanív,semennikov a Iymfocytov od štyroch zdravých darcov (L 1, L 2, L 3, L 4), boli použité ako templát pre amplilikaciu V(D)J oblastí protilátok. Vzorky cDNA boli normalizované amplifikáciou prevádzkového génu fl-aktinu. V(D)J fragmenty bolí ampliñkované zo všetkých templátov mimo cDNA normálnych semennikov. B. Rovnaké PCR produkty boli frakcionované pomocou PAGE za zisku pásiem DNA s vyšším rozlíšením.Obrázok 14. Distribúcia podtríed protilátok, PCR-ampliñkované vzorky normálnych prsných tkanív a E 84 cDNA,nevykazujúce oligoklonálne pásma v V(D)J testu, vykazujú prevalenciu lgA pásiem v porovnani s lgG 1 a lgG 2(ľavý panel), zatial čo tri vzorky vykazujúce silne oligoklonálne pásma v predchádzajúcom teste (E 921, E 92 a E 93) vykazujú lgG 1 alebo lgG 1 a lgG 2 prevalenciu v porovnaní s lgA (pravý panel).Obrázok 15. Aminokyselinové sekvencie variabilných oblastí 30 náhodných klonov získaných klonovaním yretazca génov protilátok získaných z cDNA E 92 a 893. Peptídová sekvencia je uvedená v jednopísmennom kode. Identicke aminokyseliny sú v rovnakých klonoch predstavované pomlčkou.Obrázok 16. Selekcia na proteínoch ED-B, MUC 1 a CEA, Bola testované reaktivita fágov získaných z druhého a tretieho cyklu selekcie v porovnaní s originálnymi knižnicami. GSTje zahrnuto ako negatívna kontrola. V pripade ED-B panningu bol ako ďalšia negatívna kontrola použitý proteín D s 6 His koncom, ako cielový proteín použitý pri selekcii. Uvedené dáta sú priemerné hodnoty duplicitne vykonaných skúšok. Knižnica ScFvEC 23 je odvodená z PBL. MixTIL je zmes 4 z TIL odvodených knižníc (ScFvE 87, ScFvB 95, ScFvE 96 a ScFvmix), ako je vyznačené v tabuľke 1.Obrázok 17. Reaktivita scFv protilátok nesených jednotlivými klony fágov v testoch ELISA. Reaktivita jednotlivých klonov fágov selektovaných proti ED-E (klony EDE 1, EDE 3, EDE 5, EDE 5, tabuľka 5), MUC 1 (klony ME 1, ME 2,M 85, tabulka 5) a CEA (klony C 83, CE 37, C 840, CB 41, C 853, C 880, tabuľka 5) bola testované po treťom cykle selekcie za použitia zodpovedajúcich proteínov. Uvedené dáta sú priemerné hodnoty duplicitne vykonávaných skúšok. Niekoľko irelevantných proteínov a anti-SP 2 irelevantné fágová protilátka boli zahrnuté v teste ako negatívna kontrola.Obrázok 18. Bola testovaná reaktivita fágov, odvodených zo štvrtého a piateho cyklu vysievania na bunky, voči fixovanému karcinómu prsníka (MCF 7) a humánnym tibroblastickým bunkám (HFF) v porovnani s reaktivitou pôvodných knižníc. Uvedené dáta sú priemerné hodnoty trikrát vykonaných skúšok. Knižnice scFv 896 a mixLIE sú definované v tabuľke 2.Obrázok 19. Reaktivita jednotlivých klonov fágov proti ñxovaným bunkám v bunkových ELISA testoch. Uvedené dáta sú priemerné hodnoty trikrát vykonanej skúšky. Ako negatívna kontrola bolo zaćlenené vyvljenie s irelevantnou anti-SP 2 protilátkou. MCF 7 a MDA-M 8-468 ñxované bunky karcinómu prsníka HFF humánny tibroblast a MCF 10-2 A normálne epitelové prsné bunky.Obrázok 20. Pôvod anti-MCF 7 scFv protilátok. Jeden l každé scFv fágovej knižnice bol ampliñkovaný PCR za použití oligonukleotidových primérov špeciñckých pre gény analyzovaných protilátok. Zodpovedajúce PEGpurifikované fágy boli použité ako kontrola (posledný riadok). Také bol testovaný gén anti-SP 2 protilátky známeho pôvodu, vybraný skôr z scFvEC 23 knižnice, odvozený z PBL. Anti-MUC 1 M 85 protilátka a anti-CEA C 837 protilátka boli selektované zo zmesi TIL-odvodených knižníc. Mix 11, mix 12, mi× 17 a mix 39 protilátky boli selektované zo zmesí TIL a PBL odvodených knižníc. Protilátky sú deñnované v tabuľke 5.

MPK / Značky

MPK: C40B 40/08, C12N 15/10, C07K 16/30, C12N 15/13, C40B 50/06

Značky: výběr, efektívny, vektor, maturáciu, protilátky, použitie

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/152-e9775-vektor-pre-efektivny-vyber-a-alebo-maturaciu-protilatky-a-jeho-pouzitie.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Vektor pre efektívny výber a/alebo maturáciu protilátky a jeho použitie</a>

Podobne patenty