Imobilizované katalyzátory využiteľné na výrobu prirodzených nukleozidov a modifikovaných analógov prostredníctvom enzymatických transglykozylačných reakcií

Číslo patentu: E 2611

Dátum: 16.01.2003

Autori: Zuffi Gabriele, Orsini Gaetano, Capra Emanuele, Tonon Giancarlo

Je ešte 7 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Predložený vynález sa týka prípravy nových biokatalyzátorov využiteľných V priemyselných procesoch na produkciu prirodzených nukleotidov amodiñkovaných analógov,ktoré sa môžu vo farmaceutickej oblasti používať ako medziprodukty alebo ako konečné produkty,v oblasti antitumorových aantivírusových liekov, ako aj na prípravu medziproduktov na syntézu olígonukleotidov zaujímavých z terapeutického hľadiska.Prirodzene nukleozidy, nukleozidové analógové zlúčeniny a ich deriváty, ktoré sú rôzne modifikované buď na ribofuranozylovej skupine, alebo na heterocyklickej báze naviazanej na sacharid, sa môžu vyrábať bežnými metódami chemickej syntézy, ktoré, najmä čo sa týka purínových derivátov, sú problematické V súvislosti s neuspokojivými výsledkami a/alebo nekompletnou stereo-selektivitou správnej anomérnej polohy a/alebo potreby využívať reakcie na vloženie/odstránenie labilných chemických skupín a/alebo v súvislosti s použitím zložitých purifikačných metód.Z vedeckej apatentovej literatúry sú známe altematívne prístupy kpríprave nukleozidov a analógov, ktoré sú založené na použití enzýmov, a ktoré môžu prekonávať problémy prípravy prostredníctvom chemickej syntézy.V tejto oblasti je zaujímavá najmä jedna trieda enzýmov, známych ako nukleozid fosforylázy tieto katalyzujú tak fosforylačné reakcie (pozostávajúce zodpojenia sacharidu od nukleozidu, čim vznikne zodpovedajúci sacharid-l-fosfát), ako aj reverzné reakcie (pozostávajúce zkondenzácie sachyrid-1-fosfátu na purínovú alebo pyrimídínovú bázu alebo na nitrátovaný heterocyklický akceptor), aby sa vytvoril nový nukleozid. Kombinácia týchto dvoch reakcií,katalyzovaných dvoma fosforylázami s rozličnými substrátovými špeciñcitami, umožňuje uskutočňovanie takzvanej transglykozylačnej reakcie v prítomnosti fosfátových iónov, táto transglykozylačná reakcia pozostáva z prenosu ribofuranozylovej alebo modifikovanej ribofuranozylovej skupiny z vhodného nukleozidu, ktorý má funkciu sacharidového donora, na vhodnú heterocyklickú bázu, ktorá sa správa ako sacharidový akceptor, čim s vytvára nový nukleozid v súlade s reakčnou rovnováhou, ktorá závisí na chemicko-fyzikálnych vlastnostiach rôznych substrátov, na ich relatívnych koncentráciách ana použitých operačných podmienkach, akými sú napríklad pH a teplota. Otto J. L., Werkman C. H. Coupled nucleoside phospohorylase reactions in Escherichia coli. Arch. Biochem. Bioophys. 69, 264-276, 1957 Doskocil J., Holy A. Speciñcíty of purine nucleoside phosphorylase from Escherichia coli. Collect. Czech. Chem. Commun. 42, 370-382,1977 Utagawa T. a ďalší, Mechanism of purine arabinose synthesis by bacterial transarabinosylation reactions. 49(8), 2425-2430, 1985.Konkrétne sa v kombinácii na pripravu prirodzených alebo modifikovaných nukleozidov vtransglykozylačných reakciách, ktoré využívajú rôzne pyrimidínové nukleozidy, ako napríklad uridín, 2-deoxyuridín, 2-3-dideoxyuridin alebo arabinofuranozyl uracil, ako sacharidové donory,a rôzne tak prirodzené, ako aj modifikované purinové bázy a nitrátované heterocyklícké zlúčeniny,slúžiace ako sacharidové akceptory, používali enzýmy uridín fosforylázu alebo UdP (E.C. 2.4.2.3) a purín nukleozid fosforylázu alebo PNP (E.C. 2.4.21). Hutchinson D. W. New approaches to the synthesis of antiviral nucleosides. Trends Biotechnol. 8, 348-353, 1990 Hanrahan J. R., Hutchinson D. W. The enzymatic synthesis of antiviral agents. J. Biotechnol. 23, 193-2120, 1992.Izolácia a štúdium UdP a PNP z rôznych druhov ukázali, že enzýmy odvodené z prokaryotických mikroorganizmov majú širšiu substrátovú špecificitu a väčšiu termálnu stabilitu ako napriklad zodpovedajúce enzýmy izolované z cicavcov, a sú preto výhodne ako katalyzátory na priemyselné použitie Mao C. a ďalší, The crystal structure of E. coli purine nucleoside phosphorylase. A comparison with the human enzyme reveals aconserved topology. Structure 5,1373-1383, 1997 Browska A. a ďalší, Properties of purine nucleoside phosphorylase of mammalian and bacterial origin. Z. Naturforsch. 45 c, 59-70, 1989.UdP a PNP izolované z prokaryotických mikroorganizmov vo forme rozpustných enzýmov sa použili ako katalyzátory transglykozylačných reakcií v homogénnej fáze avšak tento pristup nie je veľmi efektívny avo všeobecnosti je obmedzený na laboratóme meradle, keďže vyžaduje použitie purifikovaných enzýmov, ktoré sa nedajú znova použiť pre nasledujúce reakčné cykly,neumožňuje pracovanie pri teplote vyššej ako 37-40 °C a vyžaduje výnimočne dlhé reakčné časy.-2 Krenitsky T. Aa ďalší, Enzymatic synthesis of purine arabinonucleosides. EP-0002192, 1979 Krenitsky T. A. a ďalší Purine nucleoside synthesis, an efficient method employing nucleoside phosphorylase. Bíochemistry 20, 3615-3621, 1981 Krenitski T. A. a ďalší An enzymic synthesis of purine D-arabinonucleosides. Carbohydrate Res. 97, 139-146, 1981 Krenitsky T. A. a ďalší Imidazo 4,5-cpyridines (3-deaza purines) and their nucleosides as immunosupressive and antiinflammatory agents. J. Med.Chem. 29, 138-143, 1986.Nájdeme toho, že enzýmy UdP aPNP sa súčasne nachádzajú vcytoplazme mnohých štandardných kmeňov mikroorganizmov patriacich k rôznym rodom, a to v pomeroch kompatíbilných s funkciou katalyzovaných transglykozylačných reakcií, naznačovalo ich priame použitie, to znamená vo fonne celobunkových prípravkov, ako biokatalyzátorov na prípravu nukleozidov amodifikovaných analógov. Výhody tohto prístupu spočívajú v možnosti vyhnúť sa extrakcii apurifikovaniu UdP aPNP, ako aj vstabilite cytoplazmatickej enzymatickej aktivity,ktorá umožňuje, aby sa transglykozylačné reakcie uskutočñovali pri teplotách až do približne 60 °C,čo zvýhodňuje solubilizáciu substrátov a zvyšuje rýchlosť reakcie.Mnohé práce už dokumentovali aplikovateľnosť transglykozylačných reakcií katalyzovaných celými bunkamí mikroorganizmov patriacich krôznym druhom, ako napríklad Enterobacter aerogenes, Erwínia herbicala, Brevíbacteríum acezylícum, Escherichia coli, ato tak na laboratómej úrovni, ako aj vo výrobnom meradle. Utagawa a ďalší, Properties of nucleoside phosphorylase from Enterobacter aerogenes. Agric. Biol. Chem. 49, 3239-3246, 1985 Utagawa T. Enzymatic preparation of nucleoside antibiotics. J. Molec. Catalysis B Enzymatic 6 (3-4), 215-222,1999 Cotticelli G. a ďalší, Production of nucleosides by large-scale bioconversion. Nucleosides Nucleotides 18 (4-5), 1135-1136, 1999 Yokozeki K, Tsuji T. A novel enzymatic method for the production of purine-Zldeoxynucleosides. J. Molec. Catalysis B Enzymatic, 10, 207-213, 200.Použitie celých bakteriálnych buniek, umožňujúce uskutočňovanie reakcií v heterogénnej fáze, taktiež potenciálne umožňuje opätovnú izoláciu buniek na ich recyklovanie V nasledujúcich reakciách, hoci je nevyhnutné počítať smožnosťou kontaminácie vdôsledku viac alebo menej rozsiahlej bunkovej lýzy, aso skutočnosťou, že opätovná izolácia buniek komplikuje produkčný proces, keďže vyžaduje ďalšie filtračné a/alebo ultrafiltračné alebo centrifugačné kroky. Opísané boli aj prístupy, vktorých sa recyklácia buniek používaných ako biokatalyzátory uskutočňovala použitím buniek vopred agregovaných s glutaraldehyom Zinchenko A. I. a ďalší, Synthesis of 9(B-D-arabinofuranosybguanine using whole cells of Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 32, 658-661, 1990 Barai V. N. a ďalší, A universal biocatalyst for the preparation of base- and sugar-modified nucleosides via an enzymatic transglycosylation. Helv. Chim. Acta 85, 1901-1907,2002, enkapsuláciou buniek v hydrofilných matriciach Votruba 1. a ďalší, Synthesis of Z-deoxy-BD-ribonucleosides and 2,3-dideoxy-B-D-pentofirranosides on immobilized bacterial cells. Collect. Czech. Chem. Commun. 59, 2302-2330, 1994, alebo inkorporovaním buniek do hydrofóbnych polymémych živíc Yokozeki K. a ďalší, Production of adeníne arabinoside by gel-cntrapped cells of Enterobacter aerogenes in water-organic cosolvent system. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 14, 225-231, 1982.Nakoniec, konštrukcia geneticky modifikovaných bakteriálnych kmeňov, ktoré sú schopne exprimovať vysoké hladiny rekombinantných foriem enzýmov UdP a PNP, tak oddelene v rôznych bunkách, ako aj simultànne v rovnakej bunke Bestetti G. a ďalší, Recombinant bacterial strains for the production of natural nucleosides and modified analogues thereof. W 0 00/39307, 1999 umožnili získanie mikroorganizmov, ktoré je možné výhodne využiť tak na produkciu UdP a PNP Esipov R. S. a ďalší, Overexpression of Escherichia coli genes encoding nucleoside phosphorylases in the pET/Bl 2 l (DE 3) system yields active recombinant enzymes. Protein Express. Purif. 24, 56-60, 2002, ako aj na použitie celých buniek ako biokatalyzátorov na produkciu prirodzených nukleozidov a analógov transglykozylačnými reakciami Spoldi E. a ďalší,Recombinant bacterial cells as efficient biocatalysts for the production of nucleosides. Nucleosides Nucleotides 20 (4-7), 977-979, 2001.Avšak vo všeobecnosti sa akceptuje, že enzýmy imobilizované na tuhom substráte predstavujú fyzikálnu formu, ktorá je najvýhodnejšia na produkciu priemyselného biokatalyzátora,keďže umožňujú, aby sa reakcie uskutočñovali v heterogénnej fáze, minimalizujúc alebo eliminujúc problém kontaminácie biologickým materiálom, pričom sa môžu pripraviť V takej fyzikálnej forme, 3 ktorá je jednoducho separovateľná od reakčnej zmesi na možné opätovné použitie, čo uľahčuje proces puriñkácie reakčnej zmesi, azjednodušuje produkčný proces, keďže sú kompatibilné s akoukoľvek konfiguráciou reaktorov na uskutočňovanie tak diskontinuálnych, ako aj kontinuálnych reakcií. Keďže enzymaticky aktívne formy UdP aPNP sú tvorené homohexamémymi komplexmi, ich imobilizácia na tuhý podklad zahŕňa radu problémov, pretože imobilizačný proces musi byť kompatibilný so zachovaním aktívnej oligomérnej konñgurácie Pugmire M. J., Ealick S. E. Structural analyses reveal two distinct families of nucleoside phosphorylase. Biochem. J. 361, 1-25, 2002. Bolo publikované, že vporovnaní smetódanli imobilizácie prostredníctvom vytvorenia kovalentných väzieb, metódy imobilizácie prostredníctvom nekovalentnej adsorpcie typicky oveľa menej porušujú štrukturálne charakteristiky enzýmov atým uľahčujú zachovanie imobilizovaného enzýmu v konfigurácii porovnateľnej s aktívnou prirodzenou konfrguráciou, ktorá sa nachádza v roztoku Bailey J. E., Ollis D. F. (a cura di). Bíochemical engineering fundamentals. 2. vydanie, McGraw-Hill, New York, 1986, str. 157).V súlade s týmito indikáciami, je jediná doteraz známa forma ko-imobilizácie UdP a PNP enzýmov prokaryotického pôvodu založená na adsorpcii prostredníctvom nekovalentných interakcií puriñkovaných prípravkov enzýmov na DEAE slabú zásaditú celulózovú živicu. Avšak tento prístup má obmedzenia čo sa týka priemyselnej využiteľnosti, keďže príprava katalyzátora vyžaduje separačnú purifikáciu dvoch enzýmov pred procesom adsorpcie na živicu, aby sa eliminovala prítomnosť iných externých enzýmov, ktoré by sa ko-adsorbovali a interferovali v následnej transglykozylačnej reakcii navyše, opätovné použitie imobilizovaného enzýmu je obmedzené na nové reakčné cykly Averett D.R. a ďalší ó-Methoxypurine arabinoside as a selective and potent inhibitor of varicella-zoster virus. Antimicrob. Agents Chemother. 35(5), 851-857, 1991 Mahmoudian M. Biocatalytíc production of chiral pharmaceutical intermediates. Biocatalysis Biotransforrn. 18, 105118, 2000.Teraz sa prekvapujúco zistilo, a predstavuje to principiálny predmet predloženého vynálezu,že ko-imobilízácia oboch enzýmov, UdP a PNP, prostredníctvom vytvorenia kovalentných väzieb stuhou matricou funkcionalízovanou sepoxyskupinami, umožňuje produkciu biokatalyzátorov svysokou špecifickou aktivitou, excelentnou tepelnou stabilitou akompatibilitou svysokými rozpúšťadlovými koncentráciami. Keďže tieto nové imobilizované katalyzátory sú jednoducho separovateľné od reakčnej zmesi a opätovne použiteľné V množstve následných reakčných cyklov,sú výnimočne vhodné na priemyselné využitie, ariešia problémy, ktoré boli doteraz spojené s priemyselnou produkciou nukleozidov prostredníctvom transglykozylačných reakcií.Ďalším predmetom predloženého vynálezu je možnosť použiť V ko-imobilizačnom procese nie len izolované enzýmy, ale aj surové roztokové frakcie enzýmov UdP aPNP, produkované bunkovými kultúrami (pričom tento výraz znamená frakciu, ktorá sa po bunkovej lýze acentrifugácii izoluje ako supematantová kvapalina - zložená zlyzačného tlmivého roztoku obsahujúceho bunkové komponenty vrátane enzýmov, ktoré sú rozpustné v tlmivom roztoku - ktorá je odseparovaná od nerozpustného peletu tvoreného zvyškami bunkových stien anelyzovanými alebo len čiastočne lyzovanými bunkami) v skutočnosti sa prekvapujúco zistilo, že všetky kontaminujúce enzymatické aktivity sa môžu úplne inaktivovať pred ko-imobilizačným procesom podrobením buniek mikroorganizmov produkujúcich enzýmy pôsobeniu tepla pri teplote 50-65 °C a výhodne pri teplote 60 °C, čo sa uskutočňuje 10 minút až 120 minút a výhodne počas 30 minút,bez toho, aby pôsobenie teplom poškodilo enzymatickú aktivitu UdP a PNP.V súlade s jedným uskutočnením predloženého vynálezu sa najlepšie výsledky koimobilizácie UdP aPNP dosiahli vytvorením kovalentných väzieb stuhou matricou funkcionalizovanou soxyranovými skupinami (epoxyskupinami) prostredníctvom reakcie, ktorá zahŕňa najmä laterálne aminoskupiny lyzínových zvyškov, ktoré sa nachádzajú na polypeptidových reťazcoch enzýmov, procesom, ktorý nevyžaduje drastické reakčné podmienky, ako napriklad vystavovanie vysokým teplotám alebo širokým rozsahom pH alebo použitie vysokých koncentrácii chaotrópnych činídiel. Zistilo sa, že ako imobilizačné substráty je výhodné použiť komerčne dostupné epoxyživice, ktorých niektoré technologické charakteristiky, ktore sú dôležité pre priemyselné použitie, ako napríklad veľkosť častíc, ich vysoká hustota a poróznosť, ich odolnost voči stlačeniu, ich odolnosť voči mikrobiálnemu útoku, atď., sú známe a garantované.-4 Vsúlade sďalším uskutočnením predloženého vynálezu sa enzýmy UdP aPNP koimobilizujú vytvorením kovalentných väzieb na tuhých substrátoch, ako napríklad na agarózovom géli, silikagéli, polyméroch založených na metakrylamid-bisakrylamide alebo na polymetakrylátových polyméroch funkcionalizovaných s epoxyskupinami. Spomedzi rôznych tuhých substrátov, ktoré sú komerčne dostupné a ktoré sú použiteľné na ko-imobilizáciu UdP a PNP, ako je opísaná vpredloženom vynáleze, možno medzi inými spomenúť nasledujúce materiály Epoxyaktivovaná Sepharose® Fractogel®, TSK AF-Epoxy Eupergit® C a Eupergit® CZSOL Sepabeads® EC-EP/M a Sepabeads® EC-EP.Hoci všetky z vyššie uvedených materiálov sa môžu použiť ako substráty na koimobllizácíu enzýmov UdP a PNP vytvorením kovalentných väzieb, tuhé substráty tvorené metakrylovými polymérmi funkcionalizovanými s oxyránovými skupinami (epoxyskupinami),ktoré sú prítomné v koncentrácii nie menšej ako 50 mo 1 ov/gram vlhkej živice avýhodne v koncentrácii približne 100 molov/gram vlhkej živice, sa ukázali byť výnimočne vhodnými na prípravu katalyzátora priemyselne využiteľného na produkciu nukleozidov. Živica Sepabeads ECEP/M alebo ekvivalentné živice, ktoré sú charakterizované veľkosťou častíc medzi približne 200 a 600 m akoncentráciou aktívnych epoxyskupín rovnou alebo väčšou ako 100 molov/gram vlhkej živice, sa výhodne používajú na ko-imobilizáciu enzýmov UdP a PNP V súlade s operačnými metódami opísanými v predloženom vynálezu.Tieto živice je možné komerčne získať vpredaktivovanej forme, teda nesúcich epoxyskupiny v stave vysokej reaktivity schopnej rýchlo vytvárať kovalentné väzby reagovaním výhodne s a-aminoskupinou lyzínových zvyškov, ktoré sa nachádzajú v polypeptidových reťazcoch enzýmov, ktoré sa majú imobilizovať, podľa nasledujúcej reakčnej schémyO živicaw H 2 N-(CH 2)4-enzým ĺ živica-CHg-CH-CHg-NH-(CH 2)4-enzým | Ol-l epoxyživica enzým imobilizovaný enzýmKo-imobilizácia enzýmov UdP a PNP na Sepabeads epoxyživiciach alebo na ekvivalentných živiciach sa skúmala miešaním surovej enzymatickej zmesi s imobilizovaným substrátom v prítomnosti tlmivého roztoku s pH približne 7-7,5 počas až 72 hodín.Finálne podmienky bunkovej lýzy ako-imobilizácie sa stanovili skúmaním nasledujúcich prevádzkových parametrov (v zátvorke sú uvedené optimálne podmienky vybrané pre každý zo skúmaných parametrov)a) lýza bunkovej biomasy a imobilizácia v 0,5 M, IM a 1,5 M fosfátovom tlmivom roztoku(vybrané podmienky IM fosfátový tlmivý roztok)b) ímobilizačná teplota približne 20 °C (teplota okolia) a 50 °C (vybrané podmienky teplota okolia)c) kontaktný čas medzi zmesou surových bunkových lyzátov a živicou - 12 hodín, 24 hodín,48 hodín a 72 hodín (vybrané podmienky 48 hodín)d) pomer medzi UdP enzymatickou aktivitou a PNP enzymatickou aktivitou v zmesi surových bunkových lyzátov UdP/PNP 0,5 UdP/PNP l UdP/PNP 2 UdP/PNP 3 (vybrané podmienky pomer UdP/PNP enzymatickej aktivity l)e) pomer medzi transglykozylačnou katalytickou aktivitou (vyjadrený vjednotkách ml, ako sú definované vpríklade 3 c) zmesi surového bunkového lyzátu amnožstva živice 90 jednotiek na 2 gramy vlhkej živice 90 jednotiek na 3 gramy vlhkej živice 90 jednotiek na 4 gramy vlhkej živice (vybrané podmienky približne 90 jednotiek na 3 gramy vlhkej živice, čo zodpovedá približne 30 jednotkám na gram vlhkej živice)f) koncentrácia transglykozylačnej katalytickej aktivity (vyjadrená v jednotkách ml, ako sú definované V príklade 3 c) v zmesi surových bunkových lyzátov, 2 jednotkyml, 6 jednotiekml a 10 jednotiekml (vybrané podmienky približne ójednotiekmľl)

MPK / Značky

MPK: C12N 9/10, C12N 11/00, C12P 19/00

Značky: enzymatických, katalyzátory, využitelné, modifikovaných, prirodzených, výrobu, prostredníctvom, analógov, nukleozidov, reakcií, transglykozylačných, imobilizované

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/15-e2611-imobilizovane-katalyzatory-vyuzitelne-na-vyrobu-prirodzenych-nukleozidov-a-modifikovanych-analogov-prostrednictvom-enzymatickych-transglykozylacnych-reakcii.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Imobilizované katalyzátory využiteľné na výrobu prirodzených nukleozidov a modifikovaných analógov prostredníctvom enzymatických transglykozylačných reakcií</a>

Podobne patenty