Nosič na čistenie dvojvláknovej DNA a spôsob jeho prípravy

Číslo patentu: 288366

Dátum: 25.05.2016

Autori: Scherman Daniel, Crouzet Joël, Wils Pierre

Je ešte 7 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Opisuje sa nosič na čistenie dvojvláknovej DNA, ktorý je kovalentne viazaný s oligonukleotidom schopným vytvárať prostredníctvom hybridizácie trojitú závitnicu so špecifickou sekvenciou dvojvláknovej DNA, pričom uvedený oligonukleotid obsahuje homopyrimidínovú sekvenciu vybranú zo sekvencie (CCT)n, sekvencie (CT)n a sekvencie (CTT)n, v ktorej n je celé číslo medzi 1 a 15. Taktiež sa opisuje aj spôsob prípravy nosiča.

Text

Pozerať všetko

Vynález sa týka nosiča na čistenia dvojvláknovej DNA, ktorý využíva špecifickú hybridizáciu medzi sekvenciarni DNA a oligonukleotidom. Spôsob prípravy tohto nosiča spočíva V kovalentnom naviazaní oligonukleotidu na uvedený nosič.Techniky génovej a bunkovej terapie prežívajú V súčasnosti mimoriadny rozvoj. Ale tieto techniky prinášajú možnosť produkovať veľké množstvá farmaceuticky čistej DNA. V skutočnosti sa pri týchto nových terapiách liečivo často pozostáva zo samotnej DNA a je dôležité môcť vyrábať túto DNA V zodpovedajúcich množstvách, izolovať ju a čistiť ju spôsobom vhodným na terapeutické účely V humánnej medicíne.Vynález poskytuje jednoduchý a obzvlášť účinný nový spôsob čistenia DNA. Predovšetkým umožňuje získať zvlášť Vysoké čistoty vo Vysokých výťažkoch.Spôsob podľa vynálezu V podstate spočíva V špecifickej interakcii medzi sekvenciou Vloženou do DNA,ktorá má byť čistená, a oligonukleotidom tvoreným prírodnými alebo modifikovanými bázami.Nedávno bolo dokázané, že niektoré oligonukleotidy sú schopné špecificky interagovať vo veľkej ryhe dvojzávitnice DNA za lokálneho vzniku trojitej závitnice, čo Vedie k inhibícii transkripcie cielených génov(Héléne et Toulmé, Biochim. Biophys. Acta 1049 (1990) 99). Tieto oligonukleotidy selektívne rozpoznajú dvojzávitnicu DNA na sekvenciách oligopurín-oligopyrimidín, t. j. V oblastiach majúcich oligopyrimidínovú sekvenciu na komplementarnom retazci, a tvoria tam lokálne trojitú závitnicu. Bázy tretieho reťazca (oligonukleotid) tvoria Vodíkové väzby (väzby Hoogsteen alebo obratené väzby Hoogsteen) s purínmi párov Watson-Crickových báz.Použitie tohto typu interakcie na izolovanie plazmidu bolo opísané V doterajšom stave techniky. Tak Ito a kol. (PNAS 89 (1992) 495) opisujú použitie biotinylovaných oligonukleotidov schopných rozpoznať konkrétnu sekvenciu plazmidu a vytvoriť s touto sekvenciou trojitú závitnicu. Takto vytvorené komplexy sú potom uvedené do styku s magnetickými guľôčkami pokrytými streptavidínom. Interakcia medzi biotínom a streptavidínom potom umožňuje potom izolovať plazmid magnetickou separáciou guľôčok a potom elúciou. Ale tento spôsob má niektoré nedostatky. Predovšetkým sú tu potrebné dve za sebou idúce špecifické interakcie, pričom prvá interakcia prebieha medzi oligonukleotidom a plazmidom a druhá interakcia prebieha medzi biotinylovaným komplexom a streptavidínovými guľôčkami. Okrem toho môže byť výsledný roztok kontaminovaný biotinylovaným oligonukleotidom, ktorý sa nemôže použiť Vo farmaceutickej kompozícii.Spôsob podľa vynálezu predstavuje nový, zlepšený spôsob čistenia DNA, ktorý Využíva uvedený typ interakcie. Konkrétnejšie, spôsob podľa vynálezu využíva oligonukleotidy, ktoré sú viazané kovalentnou väzbou k nosiču. Tento spôsob je mimoriadne rýchly a dosahuje sa pri ňom vysoká miera čistoty a hlavne vysoké výťažky. Navyše spôsob podľa vynálezu umožňuje čistiť DNA z komplexných zmesí obsahujúcich, predovšetkým, ďalšie nukleové kyseliny, proteíny, endotoxíny (také ako lipopolysacharidy), nukleázy a podobne. Použité nosiče môžu byť navyše ľahko recyklované a získané DNA majú zlepšenú vlastnosti farmaceutickej bezpečnosti. Navyše sa spôsob podľa vynálezu realizuje iba na jedinom stupni, na rozdiel od spôsobov doterajšieho stavu techniky.Predmetom vynálezu je teda spôsob čistenia dvojvláknovej DNA, ktorého podstata spočíva V tom, že sa roztok obsahujúci uvedenú DNA V zmesi s ostatnými zložkami zavedie na nosič, ku ktoremu je kovalentne naviazaný oligonukleotid schopný hybridizaciou Vytvoriť trojitú závitnicu so špecifickou sekvenciou prítomnou V uvedenej DNA. Uvedenou špecifickou sekvenciou môže byť sekvencia, ktorá je prirodzene prítomná V dvojvláknovej DNA alebo syntetické umelo zavedená sekvencia.Oligonukleotidy, ktoré sa používajú V rámci vynálezu, sú oligonukleotidy priamo hybridizujúce s dvojvláknovou DNA. Tieto oligonukleotidy môžu obsahovať nasledovné bázy- tymín (T), ktorý je schopný tvoriť triplety s dubletmi A. T dvojvláknovej DNA (Rajagopal a kol., Biochem 28 (1989) 7859),- adenín (A), ktorý je schopný tvoriť triplety s dubletmi A. T dvojvláknovej DNA,- guanín (G), ktorý je schopný tvoriť triplety s dubletmi G. C dvojvláknovej DNA,- protónovaný cytozín (C), ktorý je schopný tvoriť triplety s dubletmi G. C dvojvláknovej DNA (Rajagopal a kol., citovaný vyššie),- uracil (U), ktorý je schopný tvoriť triplety s pármi báz A. U alebo A. T.Použitý oligonukleotid Výhodne obsahuje homopyrimidinovú sekvenciu bohatú na cytozín a špecifickou sekvenciou prítomnou V DNA je homopurínová-homopyrimidínová sekvencia. Prítomnosť cytozínu umožňuje mať stabilnú trojitú závitnicu pri kyslom pH, ked sú cytozíny protónované, a destabilizovanú trojitú závitnicu pri alkalickom pH, kde sú cytozíny neutralizované.Na umožnenie tvorby trojitej závitnice hybridizáciou je dôležité, aby oligonukleotid a špecifická sekvencia prítomná V DNA boli komplementáme. V tomto ohľade sa na dosiahnutie najlepších výsledkov a najlepšej selektivity V spôsobe podľa vynálezu používa oligonukleotid a špecifická sekvencia, ktoré sú plne komplementárne. Predovšetkým môže ísť o oligonukleotid poly-CTT a o špecifickú sekvenciu poly-GAA. Ako príklad možno uviesť oligonukleotid so sekvenciou 5-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3 (GAGG(CTT 7 (SEQ ID n° 1), V ktorom bázy GAGG netvoria trojitú závitnicu, ale umožňujú oddeliť oligonukleotid od Väzobného ramena. Takisto je možné uviesť sekvenciu (CTT)7 (SEQ ID n° 26). Tieto oligonukleotidy sú schopné tvoriť trojitú závitnicu so špecifickou sekvenciou obsahujúcou komplementárne motívy (GAA). Môže predovšetkým isť o oblasť obsahujúcu 7, 14 alebo 17 motívov GAA, ako je to opísané V príkladovej časti.Ďalšou zaujímavou špecifickou sekvenciou je sekvencia 5 CAAGGGAGGGAGGAGAGGAAS (SEQ 1 D n° 5).Táto sekvencia tvorí trojitú závitnicu s oligonukleotidmi 5-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3 (SEQ ID n 6) alebo 5-TTGGTGTGGTGGGTGGTT-ď-S (SEQ 1 D n° 7).V tomto prípade sa oligonukleotid fixuje V antiparalelnej orientácii k polypurínovému Vláknu. Tieto trojité závitnice sú stabilné iba V prítomnosti Mg (Vasquez a kol., Biochemistry, 199 S, 34, 7243 - 7251, Beal a Dervan, Science, 1991, 251, 1360 - 1363).Ako už bolo uvedené, môže byť špecifickou sekvenciou sekvencia, ktorá je V dvojvláknovej DNA prítomná prirodzeným spôsobom, alebo sekvencia syntetická, ktorá je do dvojvláknovej DNA zavedená umelo. Je obzvlášť zaujímavé použiť oligonukleotid schopný vytvoriť trojitú závitnicu so špecifickou sekvenciou,ktorá je prirodzene prítomná V dvojvláknovej DNA, napríklad pôvodom z replikácie plazmidu alebo V markerovom géne. Z tohto hľadiska prihlasovateľ uskutočnil sekvenčné analýzy plazmidov a mohol takto dokázať, že niektoré oblastí týchto DNA, ktoré sú hlavne replikačného pôvodu, môžu obsahovať homopurínové homopyrimidínové oblasti. Syntéza oligonukleotidov schopných vytvoriť trojité závitnice s týmito homopurínovými homopyrirnidínovými oblasťami prirodzeného pôvodu, výhodne umožňuje aplikovať spôsob podľa vynálezu na nemodifikované plazmidy, hlavne na komerčné plazmidy typu pUC, pBR 322, pSV atď. Z homopurínových homopyrimidínových sekvencií, ktoré sú prirodzene prítomné V dvojvláknovej DNA,možno uviesť sekvenciu obsahujúcu celok alebo časť sekvencie 5-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3 (SEQ ID n° 2),ktorá je prítomná V replikačnom začiatku ColEl z Escherichia coli. V tomto prípade má oligonukleotid tvoriaci trojitú závitnicu sekvenciu 5-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-S (SEQ ID n° 3)a viaže sa alternatívne na obe vlákna dvojzávitnice, ako to opísali Beal a Dervan (J . Am. Chem. Soc. 1992,114, 4976 - 4982) a Jayasena a Johnston (Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279 - 5288). Takisto možno uviesť sekvenciugénu beta-laktamázy plazmidu pBR 322 (Duval-Valentin a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 504 až 508). Použitie oligonukleotidu schopného vytvoriť trojitú závitnicu so sekvenciou prítomnou V replikačnom začiatku alebo V markerovom géne je obzvlášť Výhodné, lebo umožňuje rovnakým oligonukleotidom čistiť ľubovoľnú DNA obsahujúcu uvedený replikačný začiatok alebo uvedený markerový gén. Nie je teda nevyhnutné modifikovať plazmid alebo dvojvláknovú DNA tak, aby sa do nej inkorporovala špecifická sekvencia.Akokoľvek sú plne komplementárne sekvencie výhodné V rámci spôsobu podľa vynálezu, je samozrej mé,že je možné tolerovať určité nedokonalé spárovanie medzi sekvenciou oligonukleotidu a sekvenciou prítomnou V DNA V prípade, že tieto nedokonalosti V párovaní nevedú k príliš veľkej strate afinity. Takto možno uviesť sekvenciu 5-AAAAAAGGGAATAAGGG-3 (SEQ 1 D n° 8) prítomnú V géne beta-laktamázy Escherichia coli. V tomto prípade môže byť tyrnín prerušujúci polypurínovú sekvenciu rozpoznaný guanínom tretieho reťazca tvoriac takto triplet ATG, ktorý je stabilný, keď je zarámovaný dvoma tripletmi TAT (Kiesling a kol., Biochemistry, 1992, 31, 2829 - 2834).V rámci špecifickej formy uskutočnenia vynálezu obsahujú oligonukleotidy podľa vynálezu sekvenciu(CCT), sekvenciu (CT) alebo sekvenciu (CTT), V ktorej n znamená celé číslo od 1 do 15. Je obzvlášť výhodné použiť sekvencie typu (CT) alebo (CTT). Prihlasovateľ V skutočnosti preukázal, že výťažok čistenia je ovplyvnený množstvom C V oligonukleotide. Ako je to uvedené V priklade 7, vzrastá výťažok čistenia V prípadoch, ked oligonukleotid obsahuje menej cytozínov. Je samozrejme, že oligonukleotidy podľa vynálezu môžu byť takisto kombinované s motívmi (CCT), (CT) alebo (CTT).Použitým oligonukleotidom môže byť prírodný oligonukleotid (tvorený prirodzenými nemodifikovanými bázami) alebo chemicky modifikovaný oligonukleotid. Použitý oligonukleotid môže Výhodne obsahovať niektoré chemické modifikácie umožňujúce zvýšiť jeho odolnosť alebo ochranu proti nukleázam alebo jeho afinitu k špecifickej sekvencii.Pod pojmom oligonukleotid sa V rámci vynálezu rozumie ľubovoľný reťazec nukleozidov, ktorý podstúpil modifikáciu skeletu na zvýšenie jeho rezistencie proti nukleázam. Z možných modifikácií možno uviesť oligonukleotido-fosforotioáty, ktoré sú schopné vytvoriť trojité závitnice s DNA (Xodo a kol., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322 - 3330), takisto ako oligonukleotidy majúce formacetálový alebo metylfosfonátový skelet (Matteuci a kol., J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, 7767 - 7768). Takisto je možné použiť oligonukleotidy syntetizované s alfa-anomérmi nukleotidov, ktoré takisto tvoria trojité závitnice s DNA (Le Doan a kol., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749 - 7760). Ďalšiu modifikáciu skeletu predstavuje fosforamidátová väzba. Možno napríklad uviesť internukleotidovú väzbu N 3-P 5-fosforoamidátového typu opísanú Gryaznovom a Chen-om, ktorá poskytuje oligonukleotidy tvoriace s DNA obzvlášť stabilné trojité závitnice (J . Am. Chem. Soc., 1994, 116, 3143 - 3144). Z ostatných modifikácii skeletu možno takisto uviesť použitie ribonukleotidov, 2-O-metylribózy, fosfodiesteru, (Sun a Héléne, Curr. Opinion Struct. Biol., 116, 3143 - 3144). Fosforovaný skelet môže byť nakoniec nahradený polyamidovým skeletom, ako je to V prípade PNA (peptidnukleovej kyseliny), ktorý môžu takisto tvoriť trojité závitnice (Nielsen a kol., Science, 1991, 254, 1497 až 1500 Kim a kol., J. Am. Chem. Soc. , 1993, 115, 6477 - 6481), alebo skeletom na báze guanidínu, ako je tomu v prípade DNG (deoxyribonukleo-guanidínu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097 - 6101),a polykatiónovými analógmi DNA, ktoré tiež tvoria trojité závitnice.Tymín tretieho reťazca môže byť tiež nahradený S-bróm-uracilom, čo zväčšuje afinitu nukleotidu k DNA(Povsic a Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 3059 - 3061). Tretí reťazec môže takisto obsahovať neprírodné bázy, medzi ktorými možno uviesť 7-deaza-2-deoxyxantozín (Milligan a kol., Nucleic Acids Res.,1993, 21, 327 - 333), 1-(2-deoXy-beta-D-ribofuranozyl)-3-metyl-5-amino-1-H-pyrazolo/4, 3-d/pyrimidín-7-on (Koh a Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470 - 1478), 8-oxoadenín, 2-aminopurín, 2-O-metyl-pseudoizocytidín alebo ľubovoľnou inou známou modifikáciou (pozri revue Sun a Héléne, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3, 345 - 356).Ďalší typ modifikácie oligonukleotidu má za úlohu predovšetkým zlepšiť interakciu alebo/a afinitu medzi oligonukleotidom a špecifickou sekvenciou. V tomto ohľade spočíva obzvlášť výhodná modifikácia podľa vynálezu V tom, že sa metylujú cytozíny oligonukleotidu (pozri príklad 5). Takto metylovaný oligonukleotid má pozoruhodnú vlastnosť tvoriť stabilnú trojitú závitnicu so špecifickou sekvenciou V oblastiach pH bližších neutrálnej reakcii (pH Vyššie alebo rovné 5). Táto modifikácia takto umožňuje pracovať pri vyšších hodnotách pH, než je tomu v prípade oligonukleotidov patriacich do rozsahu súčasného stavu techniky, t. j. pri hodnotách pH, pri ktorých je výrazne nižšie riziko degradácie plazmidovej DNA.Dĺžka oligonukleotidu použitého V rámci spôsobu podľa vynálezu sa rovná aspoň 3 bázam a výhodne sa pohybuje V rozsahu od 5 do 30 báz. Výhodne sa použije oligonukleotid majúci dlžku vyššiu ako 10 báz. Dĺžka oligonukleotidu môže byť samotným odbornikom V danom odbore prispôsobená selektivite a stabilite požadovanej na uvedenú interakciu.Oligonukleotidy použité V rámci vynálezu môžu byť syntetizované ľubovoľnou známou technikou. Hlavne môžu byť pripravené s použitím syntetizérov nukleových kyselín. Jednako len je zrejmé, že na tento účel môže byť použitá i akákoľvek iná známa metóda.Na dosiahnutie kovalentného naviazania oligonukleotidu na nosič je oligonukleotid Všeobecne funkcionalizovaný. Takto môže byť nukleotid modifikovaný koncovou tiolovou skupinou, amínovou skupinou alebo karboxylovou skupinou V polohe 5 alebo 3. Predovšetkým zavedenie tiolovej, amínovej alebo karboxylovej skupiny umožňuje, napríklad, naviazanie oligonukleotidu na nosič nesúci funkčné skupiny disulfid, maleimid, amín, karboXyl, ester, epoxid, brómkyán alebo aldehyd. Tieto naviazania sa realizujú vytvorením disulfidovej, tioéterovej, esterovej, amidovej alebo amínovej väzby medzi oligonukleotidom a nosičom. Takisto môže byť použitá i akákoľvek iná metóda, ako napriklad metóda spočívajúca V použití bifunkčných väzobných reakčných činidiel.Inak môže byť na zlepšenie hybridizácie s viazaným oligonukleotidom Výhodné, aby oligonukleotid obsahoval rameno a dištančnú sekvenciu báz (spacer). Použitie uvedeného ramena umožňuje v skutočnosti fiXovať oligonukleotid Vo zvolenej vzdialenosti od nosiča, čo zase umožňuje zlepšenie podmienok interakcie s DNA. Uvedené rameno je výhodne tvorené lineárnym uhlíkovým reťazcom obsahujúcim 1 až 18, výhodne 6 alebo 12 skupín (CHZ), a amínom, ktorý umožňuje väzbu na nosič. Rameno je spojené s fosfátom oligonukleotidu alebo dištančnou sekvenciou báz tvorenou bázami, ktoré neinterferujú s hybridizáciou. Uvedená dištančná sekvencia báz môže obsahovať purínové bázy. Tak napríklad dištančná sekvencia báz môže obsahovať sekvenciu GAGG. Uvedené rameno je Výhodne tvorené lineárnym uhlíkovým reťazcom obsahujúcim 6 alebo 12 uhlíkových atómov.V rámci vynálezu môžu byť použité rôzne typy nosičov. Môže ísť o funkcionalizované chromatograñcké nosiče, a to voľne sypané alebo prekoncionované V kolóne, funkcionalizované povrchy plastických hmôt ale 10bo 0 funkcionalizované latexové guľôčky s magnetickým alebo nemagnetickým charakterom. Výhodnými sú chromatograñcké nosiče. Ako príklady takýchto nosičov možno z chromatografických nosičov uviesť agarózu, akrylamín alebo dextrán, takisto ako ich deriváty (ako Sephadex, Sepharose, Superose,), polyméry, ako poly(styréndivinylbenzén) alebo očkovaný alebo neočkovaný oxid kremičitý (silika). Použité Chromatografické kolóny môžu byť používané na princípe difúzie alebo perfúzie.Na dosiahnutie lepších výsledkov čistenia je obzvlášť výhodné použiť na plazmide sekvenciu obsahujúcu niekoľko polôh hybridizácie s oligonukleotidom. Prítomnosť niekoľkých hybridizačných polôh priaznivo ovplyvňuje a uprednostňuje interakcie medzi uvedenou sekvenciou a oligonukleotidom, čo zase vedie k zlepšeniu výťažku čistenia. Takto je pre oligonukleotid obsahujúci n repetícií motívov (CCT), (CT) alebo (CTT) výhodné použiť sekvenciu DNA obsahujúcu aspoň n komplementárnych motívov, výhodne n 1 komplementárnych motívov. Sekvencie nesúce n 1 komplementárnych motívov takto ponúkajú oligonukleotidu dve hybridizačné polohy. Výhodne sekvencia DNA obsahuje 11 hybridizačných polôh, t. j. n 10 komplementárnych motívov.Spôsob podľa vynálezu môže byť použitý na čistenie ľubovoľnej dvojvláknovej DNA. Ide napnklad o kruhovú DNA, akou je plazmid nesúci všeobecne jeden terapeuticky zainteresovaný gén alebo niekoľko terapeuticky zainteresovaných génov. Takýto plazmid môže takisto niesť počiatok replikácie, markerový gén atď. Spôsob podľa vynálezu môže byť tiež aplikovaný priamo na bunkový lyzát. Pri tomto spôsobe uskutočnenia vynálezu sa plazmid amplifikovaný transformáciou, a potom bunkovou kultúrou čistí priamo po lýze buniek. Spôsob podľa vynálezu môže byť takisto použitý na číry lyzát, t. j. supernatant získaný po neutralizácii a odstredení bunkového lyzátu. Spôsob podľa vynálezu môže byť úplne jasne aplikovaný na roztok predbežne čistený známymi metódami. Spôsob podľa vynálezu takisto umožňuje čistiť lineárnu alebo kmhovú DNA nesúcu zainteresovanú sekvenciu zo zmesi obsahujúcej DNA rôznych sekvencií. Spôsob podľa vynálezu môže byť takisto použitý na čistenie dvojvláknovej RNA.Bunkovým lyzátom môže byť lyzát prokaryotických alebo eukaryotických buniek.V prípade prokaryotických buniek môžu byť napríklad uvedené baktérie Escherichia coli, B. subtilis,S. typhimurium alebo Streptomyces. V prípade eukaryotických buniek možno uviesť živočíšne bunky, kvasinky, huby atď. a predovšetkým kvasinky Kluyveromyces alebo Saccharomyces alebo bunky COS, CHO,C 127, NIH 3 T 3 atď.Spôsob podľa vynálezu je obzvlášť výhodný vzhľadom na to, že umožňuje získať rýchlym a jednoduchým spôsobom plazmidovú DNA veľmi vysokej čistoty. Predovšetkým tento spôsob umožňuje, čo je napokon ilustrované v príkladoch, účinne oddeliť uvažovanú plazmidovú DNA od kontaminujúcich zložiek, akýn 1 i sú fragmentovaná chromozomálna DNA, endotoxíny, proteíny, nukleázy atď. Spôsob podľa vynálezu predovšetkým umožňuje získať preparáty dvojvláknovej DNA, a to zvlášť plazmidovej DNA, ktorej obsah chromozomálnej DNA je nižší alebo rovný 0,5 . Ešte výhodnejšie majú prípravky DNA získanej s použitím spôsobu podľa vynálezu obsah chromozomálnej DNA nižší alebo rovný 0,2 . Spôsob podľa vynálezu teda poskytuje kompozície obsahujúce plazmidovú DNA použiteľné predovšetkým v génovej alebo bunkovej terapii. Vzhľadom na to je predmetom vynálezu takisto farmaceutická kompozícia obsahujúca lineárnu alebo plazmidovú dvoj vláknovú DNA pripravenú opísaným spôsobom.Vynález sa tiež týka preparátov plazmidovej DNA s obsahom chromozomálnej DNA nižším alebo rovným 0,5 , výhodne rovným 0,2 a ešte výhodnejšie rovným 0,1 .Uvedené kompozície môžu obsahovať samotnú plazmidovú DNA alebo DNA združenú s transportnými vektormi, akými sú lipozćmy, nanočastice, katiónové lipidy, polyméry, proteíny, rekombinantné vírusy atď.V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie objasnený pomocou príkladov jeho konkrétneho uskutočnenia, pričom tieto príklady majú iba ilustračný charakter a nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený formulaciou patentových nárokov.Všeobecné techniky klonovania a molekulárnej biológieVšeobecné metódy molekulárnej biológie, akými sú digescia reštrikčnými enzýmami, elektroforéza na géli, transformácia u Escherichia coli, precipitácia nukleových kyselín atď., sú opísané V literatúre (Maniatis a kol., T. E. F. Fritsch a J. Sambrook, 1989, Molecular Cloning a laboratory manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York Ausubel F. M., R. Brent, R. E. Kinston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman a K. Struhl, 1987, Current protocols in molecular biology 1987 - 1988, John Willey and Sons, New York). Nukleotidové sekvencie boli stanovené metódou terminácie reťazcov podľa už uvedeného protokolu (Ausubel a kol., 1987).Reštrikčné enzýmy boli poskytnuté firmou New-England, Beverly, MA (Biolabs).Na ligáciu sa fragmenty DNA inkubujú V Tris-HCl-pufri s pH 7,4, 50 mM, MgClg 10 mM, DTT 10 mM,ATP 2 mM, v prítomnosti DNA ligázy fága T 4 (Biolabs).

MPK / Značky

MPK: C12Q 1/68, C12Q 1/00

Značky: přípravy, dvojvláknovej, spôsob, čistenie, nosič

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/15-288366-nosic-na-cistenie-dvojvlaknovej-dna-a-sposob-jeho-pripravy.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Nosič na čistenie dvojvláknovej DNA a spôsob jeho prípravy</a>

Podobne patenty