Nukleová kyselina zahrnujúca alebo kódujúca vlásenku so slučkou a poly (A) sekvenciu alebo polyadenylačný signál na zvýšenie expresie kódovaného proteínu

Číslo patentu: E 17453

Dátum: 12.08.2011

Autori: Schlake Thomas, Thess Andreas, Probst Jochen

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

NUKLEOVÁ KYSELINA ZAHRNUJÚCA ALEBO KÓDUJÚCA VLÁSENKU so SLUČKOU APOLY (A) SEKVENCIU ALEBO POLYADENYLAČNÝ SIGNÁL NA ZVÝŠENIE EXPRESIE KÓDOVANÉHO PROTEÍNU0001 Predložená prihláška opisuje kódujúcu sekvenciu nukleovej kyseliny, najmä mediátorovú RNA(mRNA), zahmujúcu alebo kódujúcu histónovú vlásenku so slučkou a poly(A) sekvenciu alebo polyadenylačný signál na použitie na zvýšenie expresie kódovaného proteínu. Opisuje jej použitie na prípravu farmaceutickej kompozícíe, najmä vakcíny na použitie napríklad pri liečbe nádorových ochorení,kardiovaskulárnych ochorení, infekčných ochorení, autoimunitných ochorení alebo genetických ochorení,alebo v gćnovej terapií.0002 Okrem kardiovaskulámych ochorení a infekčných ochorení je výskyt nádorov a nádorových ochorení jednou z najčastejších príčin smrti v modernej spoločností a vo väčšine prípadov sa spája so značnými nákladmi na terapiu a následné rehabilitačné opatrenia. Liečba nádorov a nádorových ochorení V značnej miere závisí napríklad od typu vytvoreného nádoru, veku, distribúcie nádorových buniek u pacienta, ktorý sa má liečiť, atď. Liečba nádorov sa V súčasnosti popri invazívnych operáciách bežne uskutočňuje použitím liečby ožarovaním alebo chemoterapiou. Avšak takéto bežné terapie obvykle vystavujú imunitný systém extrémnej záťaži a v niektorých prípadoch ich možno použiť len v obmedzenej miere. Okrem toho sa pri väčšine týchto bežných terapií vyžadujú dlhé intervaly medzi jednotlivými terapiami na umožnenie zregenerovania imunitného systému.0003 Preto sa v posledných rokoch zisťovali dodatočné postupy k takzvaným bežným terapiám, aby sa zabránil alebo aspoň zmenšil vplyv takýchto terapií na imunitný systém. Jedna z týchto dodatočných terapií konkrétne zahmuje génové terapeuticke prístupy alebo genetickú vakcináciu, o ktorej sa už zistilo, že je veľmi sľubná na podporenie týchto bežných terapií.0004 Génová terapia a genetická Vakcinácia sú metódy molekulámej medicíny, ktoré sú už overené v terapií a prevencii ochorení a vo všeobecnosti vykazujú významný efekt na každodennú lekársku prax,predovšetkým na liečbu vyššie uvedených ochorení. Génová terapia sa používa aj v ďalších oblastiach medicíny, napríklad v prípade genetických ochorení, čiže (dedičných) ochorení, ktoré sú zapríčinené defektom deíinovaného génu a dedia sa podľa Mendelových zákonov. Najznámejšie príklady takýchto ochorení zahrnujú okrem iného mukovíscidózu (cystickú ftbrózu) a kosáčikovitú anémiu. Obe metódy, Lj. génová terapia aj genetická Vakcinácia, sú založené na zavedení nukleových kyselín do buniek alebo tkanív pacienta a následnom spracovaní informácie kódovanej nukleovou kyselinou, ktorá bola zavedená do buniek alebo tkanív, čiže (proteínovà) expresia požadovaných polypeptidov.0005 V prístupoch génovej terapie sa obvykle používa DNA, hoci z posledných výskumov je známa aj RNA. Dôležité je, že vo všetkých týchto prístupoch gěnovej terapie mRNA funguje ako mediátor pre informáciu o sekvencii kódovaného proteínu, bez ohľadu na to, či sa použije DNA, vírusová RNA alebo mRNA.0006 RNA sa vo všeobecnosti považuje za nestabilnú molekulu RNázy sú všadepritomne aje veľmi dobreznáme, že sa ťažko inaktívujú. Okrem toho je RNA aj chemicky lnbilnejšia ako DNA, .le teda možnoprekvapujúce, že pre bežný stav mRNA v eukaryotickej bunke je charakteristická relatívna stabilita a na urýchlenie rozkladu jednotlivých mRNA sú potrebné špecifické signály. Hlavnou príčinou tohto javu sa zdá byt to, že rozklad mRNA v bunkách je katalyzovaný takmer výlučne exonukleázamí. Konce eukaryotíckých mRNA sú však chránené voči týmto enzýmom špecifickými koncovými štruktúrami a ich súvisiacimi proteínmi m 7 GpppN čiapočka na 5 konci a obvykle poly(A) sekvencia na ZŠ konci. Predpokladá sa teda, že odstránenie týchto dvoch koncových modiñkácii ovplyvňuje mieru obmedzenia rozkladu mRNA. Hoci bol charakterizovaný stabilizačný element v 3 UTR alfa-globínovej mRNA, RNA sekvencie ovplyvňujúce premenu eukaryotíckých mRNA obvykle fungujú ako promótor rozkladu, a to zvyčajne urýchlením deadenylácie (prehľad pozri v práci Meyer, S., C. Temme, a spol. (2004), Crit Rev Biochem Mol Biol 39(4) l 97-216.).0007 Ako bolo uvedene vyššie, 5 konce eukaryotíckých mRNA sa obvykle posttranskripčne modiñkujú,aby mohli niesť metylovanú štruktúru čiapočky, napr. m 7 GpppN. Okrem úlohy v RNA zostrihu, stabilizácií a transporte, štruktúra čiapočky výrazne zvyšuje naberanie 40 S ríbozomálnej podjednotky na S koniec mRNA počas iniciácie translácie. Táto druhá funkcia vyžaduje rozpoznanie štruktúry čiapočky komplexom cukaryotického iniciačného faktora eIF 4 F. Poly(A) sekvencia dodatočne stimuluje transláciu prostredníctvom zvýšeného naväzovania 40 S podjednotiek na mRNA, pričom tento efekt vyžaduje zásah poly(A) väzbového proteínu (PABP). O PABP sa zasa nedávno zistilo, že fyzicky interaguje s eIF 4 G, ktorý je súčasťou eIF 4 F komplexu naviazaného na čiapočku. Uzatvorená slučka sa teda stanovila ako model iniciácie translácie na čiapočkou ochránených, polyadenylovanýeh mRNA (Michel, Y. M., D. Poncet, a spol. (2000), J Biol Chem 275(41) 32268-76.)0008 Takmer všetky eukaryotické mRNA končia takouto poly(A) sekvenciou, ktorá sa pridá k ich 3 koncu všadeprítomným procesom štiepenia/polyadenylácic. Prítomnosť poly(A) sekvencie na 3 konci je jedným z najznámejších znakov eukaryotíckých mRNA. Po štiepení väčšina pre-mRNA, s výnimkou histónových transkriptov závislých od replikácie, získa polyadenylovaný koniec. V tomto kontexte je spracovanie 3 konca jadrovým ko-transkripčným procesom, ktorý podporuje transport mRNA z jadra do cytoplazmy a ovplyvňuje stabilitu a transláciu mRNA. Vytváranie tohto 3 konca sa uskutočňuje v dvojkrokovej reakcii riadenej procesom štiepenia/polyadenylácie a závisí od prítomnosti dvoch sekvenčných prvkov v prekurzoroch mRNA (pre-mRNA) vysoko konzervovaného hexanukleotidu AAUAAA (polyadenylačný signál) a downstream sekvencie bohatej na G/U. V prvom kroku sa pre-mRNA šticpia medzi týmito dvomi prvkami. V druhom kroku tesne nadväzujúcom na prvý krok sa novo vytvorený 3 koniec rozšíri pridaním poly(A) sekvencie pozostávajúcej z 200-250 adenylátov, čo následne ovplyvňuje všetky aspekty metabolizmu mRNA, vrátane exportu, stability a translácie mRNA (Dominski, Z. and W. F. Marzluff (2007),Gene 396(2) 373-90).0009 Levy a spol. poskytujú sekvenciu a funkčnú charakterizáciu koncového exónu ľudského receptorového génu pre inzulín a identifikáciu štyroch polyadenylačných domén zodpovedných za spracovanie 3 konca ľudskej receptorovej mRNA pre inzulín (Levy a spol. (1995), Biochimica et Biophysica Acta l 263(3)253-257).0010 W 0 Ol/ 12824 A 1 poskytuje metódy a prostriedky zníženia expresie požadovanej nukleovej kyseliny,čím sa zmení fenotyp organizmu, konkrétne rastliny, doduním výhodne nepolyadenylovanej, cieľovejšpecifickej RNA do jadra hostiteľskej bunky.0011 Jedinou výnimkou z tohto pravidla sú histónové mRNA závislé od replikácie, ktoré končia histónovou vlásenkou so slučkou namiesto poly(A) sekvencie. Príklady sekvencíí histónových vláseniek so slučkou sú opísané v práci Lopez a spol. (Dávila López, M., 8 L Samuelsson, T. (2008), RNA (New York, N.Y.), l 4(1),l-l 0. doí 10.l 261/ma.782308.).0012 Vlásenky so slučkou V histónových pre-mRNA sú obvykle nasledované sekvenciou bohatou na purín,známou ako histónový downstream element (HDE). Tieto pre-mRNA sa spracovávajú v jadre jednoduchým endonukleolytíckým štíepením približne 5 nukleotidov downstream od vlásenky so slučkou, katalyzovaným pomocou U 7 snRNP prostredníctvom párovania báz U 7 snRNA s HDE.0013 Z dôvodu potreby zavedenia novo syntetízovanej DNA do chromatlnu sa histónová syntéu reguluje v súlade s bunkovým cyklom. Zvýšená syntéza histónových proteínov počas S fázy sa dosiahne aktiváciou transkripcie histónových génov, ako aj posttranskripčnou reguláciou histónových hladín mRNA. Možno preukázať, že histónová vlásenka so slučkou je zásadná pre všetky posttranskripčné kroky regulácie histónovej expresie. Je potrebná na účinné spracovanie, export mRNA do cytoplazmy, väzbu na polyribozómy a reguláciu stability mRNA.0014 Vo vyššie uvedenom kontexte sa identiñkoval proteín s veľkosťou 32 kDa, ktorý je asocíovaný s histónovou vlásenkou so slučkou na 3-konci histónových signálov v jadre aj v cytoplazme. Hladina expresie tohto proteínu naviazaného na vlásenkou so slučkou (SLBP - stem-loop bindíng proteín) je regulovaná bunkovým cyklom a najvyššia je počas S-fázy, ked sú zvýšené hladiny histónových mRNA. SLBP je potrebný na účinné spracovanie 3 konca histónovej pre-mRNA pomocou U 7 snRNP. Po ukončení spracovania SLBP zostane asociovaný s vlásenkou so slučkou na konci zrelých histónových mRNA a stimuluje ich transláciu do histónových proteínov v cytoplazme. (Dominski, Z. a W. F. Marzluff (2007),Gene 396(2) 373-90). Je zaujímavé, že RNA väzbová doména SLBP je konzervovaná u mnohobunkovcov aj prvokov (Dávila López, M., 8 L Samuelsson, T. (2008), RNA (New York, N.Y.), l 4(1), 1-10. doil 0.l 261/ma.782308) adá sa dokázať, že jeho viazanie na sekvenciu vlásenky so slučkou závisí od štruktúry vlásenky so slučkou a že minimálne väzbove miesto obsahuje najmenej 3 nukleotidy 5 a 2 nukleotidy 3 vlásenky so slučkou (Pandey, N. B., a spol. (1994), Molecular and Cellular Biology, l 4(3),1709-1720 a Williams, A. S., Marzluff, W. F., (1995), Nucleic Acíds Research, 23(4), 654-662.).0015 Aj ked sa histónové gény všeobecne klasifikujú bud ako závislé od replikácie, čím vznikajú ukončenia mRNA v histónovej vlásenke so slučkou, alebo ako nahradzujúceho typu, čím namiesto toho vznikajú mRNA nesúce poly(A)-koniec, v niektorých veľmi zriedkavých prípadoch sa identifikovali prirodzene sa vyskytujúce mRNA obsahujúce histónovú vlásenku so slučkou a jej poly(A) alebo oligo(A) 3. Sanchez a spol. skúmali vplyv prirodzene sa vyskytujúcich oIigo(A) koncov pripojených cez 3 histónovej vlásenky so slučkou histónovej mRNA počas oogenézy Xenopus s použitím luciferázy ako reportérového proteínu a zistili, že oIígo(A) koniec je aktívnou časťou translačného represívneho mechanizmu, ktorý umlčuje histónovú mRNA počas oogenézy a jej odstránenie je súčasťou mechanizmu, ktorý aktivuje transláciu histónových mRNA (Sanchez, R. and W. F. Marzluff(2004), Mol Cell Biol 24(6) 2513-25). 0016 Zhong a spol. opisujú proteín viažuci dvojvláknovú RNA, potrebný na aktiváciu potlačených signálov v cicavčích zárodočných bunkách (Zhong, J, a spol. (1999), 22(2) 1 .lunezl 7 l-l 74).0017 Ďalej sa skúmala potreba regulácie histónov závislých od replikácie na úrovni spracovania mRNA astability mRNA s použitím umelých konštruktov kódujúcich markerový proteín alfa globín, využivajúc fakt,že globínový gén obsahuje intróny. na rozdiel od histónových génov bez intrónov. Na tento účel sa vytvorili konštrukty, v ktorých za sekvencíou kódujúcou alfa globín nasledoval signál hístónovej vlásenky so slučkou(za histónovou vlásenkou so slučkou nasledoval histónový downstream prvok) a polyadenylačný signál(1987). Moleeular and Cellular Bíology, 7(12), 4557-4559. Pandey, N. B., a spol. (1990). Nucleic Acids Research, 18(l 1), 3161-3170).0018 V ďalšom pristupe Lüscher a spol. skúmali reguláciu rekombinantného histónověho H 4 génu závislú od bunkového cyklu. Vytvorili sa konštrukty, v ktorých za H 4 kódujúcimi sekvenciami nasledoval signál pre histónovú vlásenku so slučkou a polyadenylačný signál, čo sú dva signály na spraeovávanie náhodne oddelené sekvenciou kódujúcou galaktokínázu (Lüscher, B. a spol., (1985). Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82(13), 4389-4393).0019 Okrem toho, Stauber a spol. identiflkovali minimálnu sekvenciu potrebnú na zabezpečenie regulácie histónových H 4 mRNA hladín podľa bunkového cyklu. Na tieto výskumy sa použili konštrukty, zahmujúce kódujúcu sekvenciu pre selekčný marker xantínzguanín fosforibozyl transferázu (GPT) predchádzajúcu signál pre histónovú vlásenku so slučkou, za ktorým nasledoval polyadenylačný signál (Stauber, C. a spol., (1986). EMBO J, 5(l 2), 3297-3303).0020 Pri skúmaní spracovania histónových pre-mRNA Wagner a spol. sa identiñkovali faktory potrebné na štiepenie histónových pre-mRNAts použitím reportćrového konštruktu a umiestnením EGFP medzi signál pre histónovú vlásenku so slučkou a polyadenylačný signál, takže sa exprimoval len v prípade prerušenia spracovania hístónovej pre-mRNA (Wagner, E. J. a spol., (2007). Mol Cell 28(4), 692-9).0021 Treba poznamenať, že translácia polyadenylovanej mRNA obvykle vyžaduje, aby bola 3 poly(A) sekvencia v blízkosti 5 čiapočky. To sa sprostredkuje proteín-proteínovou interakciou medzi poly(A) väzbovým proteínom a eukaryotickým iniciačným faktorom eIF 4 G. Čo sa týka histónových mRNA závislých od replikácie, zistil sa analogický mechanizmus. V tejto súvislosti Gallie a spol. ukázali, že histónová vlásenka so slučkou je funkčne podobná poly(A) sekvencii v tom, že zlepšuje účinnosť translácie a je kodependentná od 5 ~čiapočky, aby sa zabezpečila účinná hladina translácie. Ukázali, že histónová vlásenka so slučkou je dostatočnú a potrebná na zvýšenie translácie reportérovej reporter mRNA v transfekovaných bunkách vaječnikov čínskeho škrečka, ale musi byť umiestnená na 3 konci, aby optimálne fungovala. Preto sa podobne ako poly(A) koniec na iných mRNA zdá byť 3 koniec týchto histónových mRNA zásadný na transláciu in vivo aje funkčne analogický s poly(A) koncom (Gallie, D. R., Lewis, N. J., Marzlutf, W. F.0022 Ling a spol. ukázali, že proteín víažuci 3-koniec vlásenky so slučkou zlepšuje transláciu prostredníctvom funkčnej a fyzikálnej interakcie s eukaryotickým iniciačným faktorom 4 G (elF 4 G) a elF 3(Ling, J. a spol. (2002), Moleeular and Cellular Biology, Zv. 22, Č. 22, 7853-7867).0023 Okrem toho možno dokázať. že SLBPje viazaný na cytoplazmatickú hístónovú mRNA a je potrebný na jej transláciu. Hoci SLBP neinteraguje priamo s elF 4 G. doména potrebná na translácíu hístónovej mRNA interaguje s nedávno identiñkovaným proteínom SLlPl. V ďalšom kroku SLlPl interaguje s elF 4 G a umožňuje cirkularizovať histónovú mRN A a podporiť íxčinnú transláciu hístónovej mRNA podobnýmmechanizmom, akoje translácia polyadenylovanýeh mRNA.

MPK / Značky

MPK: C12N 15/67

Značky: polyadenylačný, proteínu, sekvenciu, kódovaného, nukleová, kódujúca, zvýšenie, expresie, signál, kyselina, zahrnujúca, slučkou, vlásenku

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/149-e17453-nukleova-kyselina-zahrnujuca-alebo-kodujuca-vlasenku-so-sluckou-a-poly-a-sekvenciu-alebo-polyadenylacny-signal-na-zvysenie-expresie-kodovaneho-proteinu.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Nukleová kyselina zahrnujúca alebo kódujúca vlásenku so slučkou a poly (A) sekvenciu alebo polyadenylačný signál na zvýšenie expresie kódovaného proteínu</a>

Podobne patenty