Spôsob odstránenia vírusov z roztokov fibrinogénu

Číslo patentu: E 4719

Dátum: 03.03.2004

Autori: Ristol Debart Pere, Fernandez Rodriguez Jesus

Je ešte 6 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 Tento vynález sa týka spôsobu odstránenia vírusov zroztokov íibrinogénunanofiltráciou a tiež sa týka fibrinogćnu na terapeutické použitie získaného týmto spôsobom.0002 Fíbrinogén z plazmy, glykoproteín s relatívnou molekulovou hmotnosťou 340 000 daltonov je koagulačný faktor aktivovaný pri hemostáze na konci koagtllačnej kaskády. Tento ñbrínogćn sa zúčastňuje na primárnej hemostáze pri agregácií doštičiek a na sekundámejhemostáze pri tvorbe fibrínovej zrazeniny.0003 Fibrinogén ako terapeutický výrobok, čo je bielkovina získaná prečistením z ľudskej plazmy, sa okrem iných aplikácií používa V substitučnej terapii v situáciách, kde je deňcit tohot proteínu a ako zložka fibrínových adhezív, vhemostáze a pri sceľovaní rán, rekonštrukciitkanív, ako biologické adhezívum a ako vehikulum (prenášač) na uvoľňovanie liekov a0004 Na komerčne účely sa fibrínogén pripravuje zľudskej plazmy od rôznych darcov(pool - krvná hotovosť). Napriek kontrolám uskutočňovaným na darcoch a na dodávkach vkrvných bankách, plazmových centrách, malých krvných hotovostiach a priemyselných krvných hotovostiach na frakcionácíu, nie je možne vylúčiť kontamináciu krvnými vírusmi. Preto sa do spôsobov čistenia plazmového proteínu zavádzajú špecifické etapy na elimináciu vírusov. To má veľký význam pre tento proteín, ktorý je možné vpriemyselnom meradle prečistit počínajúc od kryoprecipitátu alebo od FrI (prvá frakcía) pri použití Cohnovho spôsobu Cohn J. a ďalší I. Am. Chem. Soc. (1946), 68, 459 -47 S, pretože je potenciálne väčšia časť obsiahnutých vírusov strhávaná od okamžiku, keď je vstupný materiál nasadený na počiatkufrakcionácie plazmy, a okrem toho nie je redukovaný následnou frakcionáciou s etanolom.0005 Zo spôsobov znižovania obsahu vírusov používaných v spôsoboch čistenia plazmových proteínov si zaslúžia zvláštnu pozornosť nasledujúce spôsoby, pretože sú široko používané a ich- tepelná úprava. Tieto spôsoby majú schopnosť znížiť efektívny obsah vírusov vzhľadom na obalené vírusy aj na vírusy bez obalu. Ich účinnosť je v priamom vzťahu k tepelnej odolnosti proteínu a k pridanému stabilizátoru. Preto je ich nedostatkom, že proteínová molekula podliehazmenám, ktoré vedú ku vzniku neoantigénnosti CPMP/viď smernica týkajúca sa produktov- úprava organickými rozpúšťadlami (OSD). Vďaka ich vysokej účinnosti pri inaktivácii vírusov s lipidovým obalom je to veľmi rozšírená úprava, ktorú je možné považovať za preukaznú (referenčnú) pre vírusy tohto typu. Na druhej strane nemá žiadny účinok na vírusy bez lipidového obalu ako je Parvovírus a vírus hepatitídy A (Burnouf T. Blood Reviews (2000),14, 94 - 110 Martinowitz U. Curr. Opin. Hematol (1996) 3, 395 - 402).0006 V súčasnosti však existuje tendencia začleniť pri eliminácii vírusov aspoň dve vzájomne sa doplňujúce etapy- filtrácia roztokov filtrami s veľkosťou pórov schopnou zadržať vírusové častice je spôsob V posledných rokoch stále rozšírenej šia. Je to fyzikálny spôsob, ktorý z princípu nie je schopný ovplyvniť štruktúru proteínov a vykazuje efektívnu schopnosť odstraňovať obsah vírusov v závislosti od veľkosti použitých pórov. Veľkost pórov je zvlášť určená priestorovými rozmermi filtrovanej bielkovinovej molekuly (ktorá má prejsť filtrom). Filtrácia filtrami s veľkosťou pórov 20 nm alebo menej môže zaistiť zníženie množstva vírusov bez obalu malých rozmerov ako je vírus hepatitídy A a Parvovírus, ktoré majú veľkost medzi 20 a 30 nm. Nadruhej strane filtrácia filtrami sväčšou veľkosťou pórov (35 nm alebo viac) nezaručujedostatočnú bezpečnost ochrany proti vírusom. Obtiažnosť tohto spôsobu je zrejme neriešiteľná, keď majú Veľkostné rozdiely medzi vírusom a proteínom sklon miznúť (J. J. Morgenthaler, Vox0007 Priemyselná aplikácia nanoñltrácie roztoku fibrinogénu filtrom s veľkosťou pórov 35 nm bola opísaná, ale nie pre filtre s menšou veľkosťou pórov. V dôsledku veľkosti molekuly a stability je fibrinogén proteín, s ktorým sú filtračné problémy aj pri testoch so sterilizácioupomocou filtrácie cez filtre s veľkosťou pórov 0,2 m.0008 PCT patent W 0 99/23111 opisuje a nárokuje filtráciu roztoku fibrinogénu filtrom s veľkosťou pórov 35 mn pomocou prídavku detergentu, ktorý filtráciu umožňuje a pritombráni podstatným stratám proteínu, ktoré by túto priemyselnú aplikáciu učinili nereálnou.0009 Patent W 0 98/37086 zisťuje, že prítomnosť proteínov svysokou molekulovou hmotnosťou (vyššou než 150 kD) zahŕňajúcich ŕibrinogén komplikuje filtráciu menších proteínov nanofiltrami s veľkosťou pórov 15 mn. Tento patent opisuje spôsob odstránenia uvedených vysokomolekulárnych proteínov (vrátane fibrinogénu) so zámerom umožniť nanofrltráciu. Preto toto nie je predmetom tohto vynálezu, ale dokumentuje to problém0010 Patentová prihláška EP l 161 958 A 1 opisuje spôsob inaktivácie vírusov v biologických kvapalínách. Vopísanom spôsobe je veľkost pórov nanofrltra závislá od veľkosti proteínu určeného na filtráciu, pričom príklady uvádzajú filtráciu s veľkosťou pórov 35 nm a zahŕňajú predbežnú chromatograñu roztoku určeného na filtráciu s cieľom uľahčiť uvedenú nanofiltráciu. Demonštruje ťažkosti pri realizácii nanoñltrácie aj pri póroch veľkosti 35 nm, keď má proteín značný rozmer.0011 Patentová prihláška US 2001/0051154 A 1 opisuje stabilizáciu proteínov vrátane fibrinogénu s cieľom chrániť ich pred stratou aktivity alebo denaturácíou pri úprave zameranej na zníženie obsahu vírusov ako pri pasterizácii tak pri nanoñltrácii. Zahŕňa pridanie značného množstva cukrov ( 0,5 g/ml) a jednej alebo viacerých aminokyselín (0,5 mol/l). Tento patent však neopisuje ani neponúka príklady nanoñltrácie frbrínogénu, takže zneho nie je možné odvodiť, že nanoñltráciu ñbrinogénu je možné uskutočňovať ñltrami s pónni sveľkosťoukomerčne dostupné (M.R.Jackson, The American Journal of surgery 2001) 182, lS - 7 S. Nanoñltrácia sa nezdá byť vhodným spôsobom, pravdepodobne kvôli skutočností, že filtrácia pórrni veľkosti 35 nm (alebo viac) nie je účinná pre malé vírusy, ktoré neboli odstránené OSD0013 Tento vynález umožňuje filtráciu ñbrinogénového roztoku filtrom s nominálnou veľkosťou póru pod 35 nm v podmienkach času spracovania, frltračnej plochy a recyklácie proteínu, ktoré dovoľujú jeho priemyselnú aplikáciu pri výrobe prečistenćho frbrinogénu akoterapeutickćho výrobku. Táto filtrácia sa deje po predbežnom zmrazení a roztopeníprečisteného roztoku ñbrinogénu za kontrolovaných podmienok. Vynálezcovia s prekvapením zistili, že vpodmienkach kontrolovaného zrnrazenia a roztopenia sa vyzráža nerozpustný, agregovaný alebo čiastočne denamrovaný materiál, ktorý by inak prakticky znemožňovalfiltráciu roztoku pórmi menších rozmerov než 35 nm. Oddelenie vyzrážaného materiáluumožňuje nanoñltráciu pri póroch menších než 35 mn.0014 Najmä predkladaný vynález zahŕňa postup podľa nároku l.0015 Kryoprecípitát, prvá frakcia (FrI) Cohnovej metódy, alebo ekvivalentná frakcia obsahujúca ñbrinogén, sa môže použit ako Východiskový materiál na prečistenie tibrinogénuz ľudskej plazmy, z ktorého sa frbrinogćnová zrazenina získa precipitáciou, výhodne glycínom.0016 Vstupná frakcia sa pred rozpustením a vyčírením môže upraviť zmesou organického rozpúšťadla a detergentu (OSD) s cieľom deaktivovať vírusy s lipidovým obalom, ktoré môžu byt prítomné. OSD sa odstraňuje ktorýmkoľvek známym spôsobom ako je Chromatografia, alebo v tomto prípade výhodne vyzrážanim glycínom.0017 Prečistená frakcia bohatá na íibrinogén sa môže rozpustiť, Vyčíriť ñltráciou alebo odstredením a upraviť stabilizátonni, výhodne aminokyselinami (arginín, glycín a pod.) aglycidmí (sacharóza) pri pH výhodne medzi 6,0 a 8,0 a s obsahom iónov upraveným chloridomsodným pri fyziologicky prijateľných koncentráciách.0018 Pri zahájení práce s vyššie uvedeným upraveným a prečisteným roztokom fibrinogénu pri čistote výhodne 80 alebo vyššej vynálezcovia prekvapivo zistili, že účinkom zmrazenia a roztopenia roztoku pri kontrolovanej teplote medzi 5 a 20 °C a výhodne medzi 8 a 13 °C sa jednoducho agregované alebo denaturovane nestabilné komponenty spojené sñbrinogénom stali nerozpustnými. Tieto materiály je možné ľahko oddeliť čírením cez nylon, kovovú sieťku alebo výhodne dekantáciou, odstredením alebo priamou ñltráciou, výhodne filtrom s odstupňovanou veľkosťou pórov alebo kombináciou ktorýchkoľvek skôr spomenutých spôsobov. Výsledný materiál je možne prekvapivo podrobiť ñltrácii aü pórmi menšími než 35mn s veľmi prijateľnou produktivitou a výťažkom.0019 Ďalej bude opísaný výhodný spôsob uskutočnenia tohto vynálezu. Materiál izolovanýpri čirení zriedený na koncentráciu 1,5 Ing/l alebo nižšiu vprítomnosti aspoň jednej

MPK / Značky

MPK: A61K 38/36, C07K 1/00, C07K 14/435

Značky: fibrinogenu, roztokov, spôsob, vírusov, odstránenia

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/14-e4719-sposob-odstranenia-virusov-z-roztokov-fibrinogenu.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob odstránenia vírusov z roztokov fibrinogénu</a>

Podobne patenty