Spôsob čistenia interferónových proteínov

Číslo patentu: 287827

Dátum: 31.10.2011

Autori: Scapol Lucia, Viscomi Giuseppe Claudio

Je ešte 5 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Je opísaný spôsob čistenia farmakologicky účinných proteínov, najmä interferónových proteínov, ktorý pozostáva z katexovej chromatografie na tuhej matrici pri zásaditejšom pH ako zodpovedá izoelektrickému bodu pI čistených proteínov, pričom pri tomto pH sú proteíny ešte absorbované, a elúcie týchto proteínov zvýšením iónovej sily a/alebo pH vodných tlmivých roztokov.

Text

Pozerať všetko

Predmetom vynálezu je spôsob čistenia farmakologícky účinných proteínov, najmä interferónových proteínov, založený na použití katexovej chromatografie na tuhej matrici. Na tento účel sa používajú tlmivé roztoky s hodnotou pH a iónovou silou, ktoré sa menia v závislosti od času a druhu interferónových proteínov,ktoré sa majú čistiť.Doteraj ší stav technikyŠiroká oblasť biomedicínskych vied je založená na použití farmakologicky účinných proteínov prírodného pôvodu, ktoré sa získali extrakčnými technikami, ako aj syntetického pôvodu, ktoré sa ziskali pomocou techník rekombinantnej DNA. Úroveň čistoty produktov záujmu je význanmá v obidvoch prípadoch, pretože ich účinnosť určená možnosťou presného spojenia biologického účinku s prítomnosťou viazaného množstva proteínu.V tomto kontexte čistenie farrnakologicky účinných proteínov predstavuje významnú časť, pretože čistota získaných proteínov má značný význam pri prítomnosti účinných látok alebo excipientov V medicinálnych výrobkoch. Možnost zapríčinenia toxických účinkov a/alebo nepriaznivých vedľajších účinkov počas liečenia tlačí inštitúcie zodpovedné za registráciu a certifikáciu predaja liekov založených na proteínoch k zavádzaniu prísnejších pravidiel na stanovenie kvality a výroby jednotnejších účinných látok proteínového pôvodu, ktoré sú obsiahnuté v predávaných liekoch.Z uvedeného je zrejmý význam čistenia proteínov, v ktorom hlavný problém spočíva v skutočnosti, že farmakologicky účinné proteíny sú vždy v zložených zmesiach spoločne s mnohými inými proteínmi.Táto skutočnosť sa týka prírodných zdrojov používaných na extrakciu farmakologicky účinných proteínov, ako je napríklad krv, extrakty z orgánov zvierat alebo rastlín, ako aj použitých techník rekombinantnej DNA, pretože proteíny vykazujú podobné fyzikálno-chemické vlastnosti medzi sebou nezávisle od zdroja ich pôvodu.Z uvedeného vyplýva, že v prípade čistení farmakologicky účinných proteínov, je proteín zmiešaný s inými proteínmi s podobnými vlastnosťami a často výrazne prevyšujúcimi množstvo želaného proteínu, ktorý sa má izolovat s vysokým stupňom čistoty.Úlohou je spresnenie niekoľkých krokov čistenia, ktoré sa bežne používajú na získanie potrebných úrovní čistoty. Čistiace procesy sa takto stali komplexnýrni a úspech priemyselnej výroby proteínu je v podstate spojený s účinnosťou čistiaceho procesu, pretože táto požiadavka určuje náklady na výrobu.Na čistenie proteínov sa používajú mnohé techniky ako napríklad selektívne zrážanie vo vodných a organických rozpúšťadlách alebo s kaotrópnyrni činidlami, separácie pomocou filtrácie a/alebo dialýzy, procesy imuno-zrážania vo vhodných protilátkach, chromatografickć procesy. Tieto ostatne procesy nadobudli v posledných rokoch veľký význam, pretože umožňujú dosiahnuť požadované stupne čistoty, ako je zrejmé z článku Regniera F. E. V J. Chromatogr. 418, 115-143, (1987).Mnohé techniky sú uvedené vo vedeckej literatúre a môžu sa roztriediť na základe mechanizmu pôsobenia aplikovaného pri separácií proteínov ako napr. separácia na základe molekulovej hmotnosti, absorpcía na polámych matriciach, ktoré sa tiež uvádzajú ako normálne Stacionárne fázy, absorpcia na nepolárnych matriciach, ktoré sa tiež nazývajú obrátené stacionárne fázy, absorpcia pomocou selektívnej afinity k ligandom naviazaným na inertne maüice, ako sú ťažké kovy ako meď, zinok, železo a platina, chemické farbivá, ako je briliantová modrá, proteíny ako proteín A a proteín G, uhľovodíky, ako sú polysacharidy a glukózaminoglykány, absorpcia pomocou imuno-añnity so špecifickýrni protilátkamí naviazanými na inertných matriciach,absorpcia iónovou interakciou s elektrostaticky nabitými ligandrni naviazanými na inertné matrice.Selektivita, t. j. schopnost selektívne rozpoznať želaný proteín, náklady a možnost použitia na priemyselnej úrovni sú parametre používané na vyjadrenie prevádzky rôznych chromatografických techník.Na základe týchto parametrov sa imuno-afinitná Chromatografia považuje, že zaručuje väčšiu selektívnosť, ale tiež vykazuje nedostatky, ako je vysoká cena pri použití, nebezpečenstvo denaturácie protilátky a nebezpečenstvo spojené s bezpečnosťou čisteného produktu, pretože protilátka je živočíšneho pôvodu.Chromatografia, ktorá používa iónovú interakciu, sa tiež nazýva ionexovou chromatografiou a je považovaná za menej riskantnú techniku na udržanie farmakologickej aktivity proteínov a ľahšie sa uskutočňuje v priemyselnom meradle s nižšími nákladmi uskutočnenia, ale vykazuje nedostatok spočívajúci v nižšej selektivíte.Preto by bolo výhodné nájsť podmienky vykonávania ionexovej chromatograñe so zvýšenou selektivitou,ktorá by umožnila jej vyrovnanie s ostatnými techníkami z hľadiska čistoty ziskaného produktu.Ionexová chromatografia sa zvyčajne uskutočňuje s použitím kolón rôznych veľkostí, plnených s tuhými matricamí s chemíckýmí skupinami, ktoré sú trvalo alebo v zvláštnych podmienkach elektrostaticky nabité.Zlúčenína vložená do ionexovej kolóny interaguje prostredníctvom elektrostatického vzájomného pôsobenia/ odpudzovania s nábojmi naviazanýrni na matricu. Rôzne zlúčeniny obsiahnuté v zmesi sú schopné samotné sa viazať na stacionámu fázu ako funkcia množstva získaného náboja a následne budú viac alebo menej zadržané, čím sa určí ich separácia na výstupe z kolóny.Chromatografia sa nazýva katexovou chromatograñou, keď sú náboje matrice negatívne, pretože sa zadržiavajú katióny, zatiaľ čo o anexovú chromatograñu ide, ak náboje matrice sú pozitivne.Proteíny sú zlúčeniny majúce vysokú molekulovú hmotnosť, vyššiu ako 10 000 Daltonov zložené z heterogénnych polymérov aminokyselín, niektoré aminokyseliny majú vo svojom vedľajšom reťazci ñinkčné skupiny, ktoré sa môžu ionizovať negatívnym spôsobom ako funkcia pH roztoku, ako sú kyslé arninokyseliny, alebo pozitívnym spôsobom, ako sú zásadité aminokyseliny, a preto všetky proteíny majú vysoké n-možstvo negatívnych a pozitívnych nábojov. Izoelektrický bod pl proteínu je pH, pri ktorom je proteín neutrálny,pretože prispevok negatívnych nábojov sa rovná príspevku pozitívnych nábojov, protein V prostredí elektrického poľa nie je priťahovaný ani jednou z polarít elektrického poľa.Množstvo negatívnych nábojov vzrastá pri pH vyššom ako pI a proteín dosahuje sieťový negatívny náboj,zatial čo opak nastáva pri pH nižšom ako pI a proteín získava pozitívny sieťový náboj. Každý proteín má svoje vlastné charakteristické pI, ktoré ho odlišuje od ostatných a niektoré proteíny Hrajú tendenciu byť nerozpusmými pri ízoelektríckom bode.Ked je proteín v roztoku pri pH nižšom ako pl má pozitívny sieťový náboj, a preto môže interagovať s negatívne nabitou matricou a môže sa podrobiť katexovej chromatograñi, zatial čo sa môže protein podrobiť anexovej chromatograñi pri pH vyššom ako jeho pl, ako je uvedene v článku F.E. Regniera, Science, 238,319-323, (1987) a z článku Yamamota S. a kol., Chromatographic Science Series, 43, (1988), Marcel Dekker, Inc. Publisher, New York.Oproti uvedenému sa neočakávane zistilo a na tejto skutočnosti je založený samotný predmet tohto vynálezu, že je možné nájsť rozsah hodnôt pH, ktoré sú vyššie ako zodpovedajúce pI proteínu, ktoré je také, že proteíny ešte stále zostávajú absorbované na matriciach katexovej chromatograñe, takže je stále možné uskutočniť katexovú chromatografiu. Takýto stav je zvlášť výhodný, pretože vysoká selektivíta medzi proteínmi sa dosahuje v týchto podmienkach, pretože veľmi malé rozdiely v pl medzi proteínmi sa stávajú dostatočné na získanie významných separácií, čim sa dosahuje vysoká účinnosť čistenia.Tento posledný aspekt je najmä významný v čistiacich procesoch rekombinantných proteínov, kde je želaný produkt často sprevádzaný príbuznými nečistotami, t. j. obsahujú veľmi malé štruktúrne zmeny produktu, ako napríklad rôzne oxidačné stavy, acetylácie, strata amidových funkcií atď. Tento druh nečistôt je veľmi ťažké odstrániť tiež prostredníctvom imuno afinitnej chromatografie, pretože vo väčšine prípadov nie je možné ich protilátky.Mechanizmus, ktorý môže vysvetliť zistený jav, ktorý je založený na skutočnosti, že distribúcia nábojov pozdĺž vonkajšieho povrchu proteínov nie je jednotné tak, že ak je aj pH o niečo vyššie ako pl a proteín má celkový negatívny sieťový náboj, stále tu existujú niektoré pozitívne náboje umiestnené v molekule, ktoré môžu interagovať s negatívnou stacionárnou fázou.Na uskutočnenie tohto mechanizmu je dôležité, aby nadbytok negatívnych nábojov nebol taký výrazný, v opačnom prípade by vytvorené elektrické polia z negatívnych nábojov boli také vysoké, že by bránili interakcii celého proteínu s negatívne nabitou chromatografickou matrícou.Navyše je potrebné kontrolovať íónovú silu roztokov používaných ako eluenty, pretože vysoká iónová sila by mohla spôsobiť tienenie proteínu a tak brániť jeho interakcii so stacionárnou fázou.Larnspon G.P. a kol., Anal. Biochem., 11, 374-377, (1965) v článku potvrdzujúcom uvádza prípad proteínov, ako je ľudský y-globulín, ribonukleáza, hemoglobín, ô-chymotrypsín, globín a lyzozým, v ktorých pri malých zmenách pH, ale pri udržaní príliš vysokej íónovej sily danej 0,1 M fosforečnanovým roztokom, elúcia V katexových chromatograñách nastala pri pH takmer o 0,4 jednotiek nižšom, ako je pI, Uvedený princip, na ktorom sa zakladá samotný vynález, nebol doteraz využitý na uskutočnenie účinného procesu čistenia proteínov.Možnosť použitia rozdielov v ízoelektríckom bode proteínov na optimalizáciu čistiacich procesov opísaných A.K. Kontturim a kol. v Acta Chem. Scand., 50 (2), 102-106, (1996) sa v skutočnosti týka konvenčného použitia ionexovej chromatograñe, kde sa katexová Chromatografia vždy uskutočňuje pri pH nižšom, ako je izoelektrický bod, zatiaľ čo anexová Chromatografia sa uskutočňuje pri pH vyššom, ako je izoelektrický bod. Spôsob opísaný v predloženej patentovej prihláške je taký, že katexové Chromatografia sa oproti tomu uskutočňujú pri pH vyššom, ako je izoelektrický bod proteínu.Spôsob opísaný v predloženej patentovej prihláške sa môže považovať za všeobecný, ako je ukázané v uvedených príkladoch, ktoré uvádzajú jeho úspešné použitie na proteín prírodného pôvodu, ako aj proteín pochádzajúci z rekombinantnej DNA. Rozdiel medzi proteínom a proteínom je vo veľkosti rozsahu pH, vyššieho ako pI, vhodného na čistenie potrebného proteínu. Skutočne napríklad ako bude ukázané v nasledujúcich príkladoch, taký rozsah je okolo 0,2 jednotiek pH v prípade interferónových proteínov, zatial čo v prípade albumínu ide o jednu jednotku pH.Použitie predloženého vynálezu na čistenie rekombinantného a interferónu (rIFNoz), ktorého izoelektrický bodje 5,9, ako je uvedené v Thacher D. a Panayotatos N., Methods Enzymol. 119, 166-177, (1986), ukazuje,ako je možné a výhodné čistiť ho výmenou katiónov pri pH 6,1. Navyše príklad uvádza ľudský sérový albumín, ktorého pI je 4,9, ako je uvedené Rylattom D.B. a kol., J. Chromatogr., 865, 145-153, (1999) a naznačuje, ako je možné a výhodné čistiť ho katiónovou výmenou pri pH 6,0.Výhody spôsobu, ktorý je predmetnom vynálezu, sú výrazné v porovnaní s výsledkami spôsobov opísaných vo vedeckých publikáciách a/alebo patentoch týkajúcich sa čistenia a interferónu a ľudského sérového albumínu, a ktoré zvyčajne vyžadujú využitie troch alebo niekoľkých po sebe idúcich spracovaní a skutočne sú veľmi nákladné a majú nižšie výťažky.Thatcher D. a Panaoytatos N. opisujú čistenie ľudského rekombinantného oz-interferónu rIFN-oa, Methods Enzymol., 119, 166-177, (1986) cez päť po sebe idúcich spracovaní, a) katexová Chromatografia, b) anexová Chromatografia, c) añnitná Chromatografia ťažkých kovov, d) spracovanie s nasýteným roztokom síranu amónneho, e) molekulová Vylučovacia chromatograña.Európsky patent 0108585 opisuje na čistenie interferónu následné použitie troch typov chromatograñe a) imuno-añnimej, b) katexovej, c) molekulovej vylučovacej. Americký patent US 4765903 týkajúci sa čistenia interferónu opisuje následné použitie štyroch typov Chromatografia a) imuno-afinitnej s monoklonálnou protilátkou, b) obrátenou fázou, C) katexovou, d) molekulovou vylučovacou.Európsky patent 0679718 opisuje spôsob výroby a interferónu, ktorý uvádza nasledujúce štyri chromatografické kroky a) kovovo-chelatačné, b) katexové, c) anexové, d) gélovú filtráciu.Ďalšie publikácie a patenty opisujú tri alebo viacero spracovaní, ktoré sú potrebné na čistenie interferónových proteínov, napríklad americký patent US 4732683, medzinárodná patentová prihláška WO 8604067 a publikácia od Khana F.R. a Rai V.R., Bioprocess Technol., 7, 161-169, (1990).Uvedené príklady pokrývajú väčšinu príslušných problémov spojených s čistením interferónu vo všeobecnosti a najmä a-interferónu. Ukazujú, ako je jeho čistenie náročné a vyžaduje mnohé kroky. Navyše je potrebne podčiarknuť, ako sa dosahujú vysoké úrovne čistenia najmä pomocou imuno-añnitných Chromatograñí s použitím monoklonálnych protilátok myšieho pôvodu. Ale prítomnost takej chromatograñckej techniky V procese priemyselnej výroby zameranej na výrobu aktívnych látok na farmaceutické použitie u ľudí zapríčiňuje nebezpečenstvo možných vírusových znečistení myšieho pôvodu kvôli prítomnosti možných imunogénnych fragmentov pochádzajúcich od myšich imunoglobulínov v konečnom produktu a kvôli ťažkostiam s výberom chromatograñckých matríc z priemyselného hľadiska.Navyše zo stručne uvedených príkladov vyplýva, že katexová Chromatografia sa široko využíva, ale niekedy nie ako jediná separačná technika, pretože jej realizácia je obmedzená vzhľadom na zvyšovanie úrovní čistoty.Publikácie od Babu K. R. a kol., Appl. Mícrobiol. Biotechnol., 53 (6), 655-660, (2000) a Bouyona R. a kol., Biotechnologia Aplicada, 14, 189-192, (1997), opisujú spôsoby čistenia a-interferónu v jednom kroku prostredníctvom ionexovej chromatograñe v soľnom gradiente, Ale v oboch prípadoch na získanie produktu s dostatočnou čistotou autori publikácií mohli izolovať iba niektoré z chromatograñckých frakcií, v ktorých bol obsiahnutý a-interferón, čím sa získali veľmi malé výťažky, až do 7,5 minima. Navyše opísané chromatografické čistiace procesy v soľnom gradiente nie sú schopné priemyselného použitia.Mnohé techniky chromatograñckého čistenia sú tiež opísané pre prípad ľudského albumínu a vychádzajú z albuminových prípravkov získaných frakcionáciou ľudského séra alebo pomocou technik rekombinantnej DNA, komplexných techník a zriedkavo prenesiteľných na priemyselnú úroveň, čo potvrdzuje, že problém účinného čistenia ľudského albumínu prírodného, ako aj rekombinanmého pôvodu stále existuje.Americké patenty US 6150504 a 5521287 opisujú čistenie albumínu prostredníctvom ionexovej Chromatograñe a hydrofóbnej interakcie. Schéma čistenia opísaná v americkom patente US 6034221 uvádza čistenie albumínu prostredníctvom dvoch chromatograñckých krokov, jedným je ultrafiltračný proces a druhým dva ďalšie kroky chrornatografického čistenia.Menej bežné spôsoby čistenia albumínu, v ktorých sa používajú anexové chromatograñe vo tluidnom lôžku alebo añnimć chromatografie interagujúce s komerčne dostupnými matricami, ako je Streamlinek alebo napríklad s vhodne pripravenými časticami modíñkovaného zirkónu alebo s emulziami períluóruhľovodíkov,sú opísané v americkom patente US 5962649 a publikáciách od Sumi A, a kol., Bioseparation, 8 (1-5), 195200, (1999), Mullick A. a Flickinger M.C., Biotechnol. Bíoeng., 65 (3), 282-290, (1999) a Mc Creath G.E. a kol., J. Chromatogr., 597 (1-2), 189-196, (1992).Nakoniec sú opísané techniky čistenia albumínu na ťažkých kovoch Yangom L. a kol., Sheng Wu kung Cheng Hsueh Pao, 16 (l), 74-77, (2000) a añnitné techniky na matriciach, ku ktorým sú naviazané molekuly farbív ako napríklad Cibacron Ble F 3 G, sú opísané v Compagnini A. a kol., J. Chromatogr. A, 736 (1-2),115, (1996).Všetky tieto techniky ukazujú rôznym spôsobom problémy spojené s komplexným uskutočnením a vysokými nákladmi, pričom problém charakterizácíe nových spôsobov čistenia farmakologicky účinných proteínov ľahko a účinne na priemyselnej úrovni a ekonomicky výhodne nie je vyriešený.Opísaný vynález dáva odpoved na tieto významné požiadavky poskytnutím spôsobu čistenia farmakologicky účinných proteínov ľahkou priemyselnou uskutočniteľnosťou a nízkymi nákladnú s významnými ekonomickýrni výhodarni, Podstata vynálezuPredložený vynález sa týka spôsobu čistenia interferónových proteínov, ktorý pozostáva z katexovej chromatografie na tuhej matrici pri zásaditej šom pH ako zodpovedá izoelektríckému bodu pI čistených proteínov, pričom pri tomto pH sú proteíny ešte absorbované, a elúcie týchto proteínov zvýšením iónovej sily a/alebo pH vodných tlmivých roztokov.Účinné uskutočnenie predloženého vynálezu vyžaduje určenie správnej kombinácie medzi použitou chromatografickou matricou, hodnotou pH vyššou ako pl a použitou iónovou silou v chromatograñckých eluentoch, pretože keď sa definuje chromatografická matrica, účinné čistenie sa získa vykonaním lirnitovaných variácii pH a /alebo iónovej sily často v rozmedzí desatín pH jednotiek, a/alebo variácií iónovej sily v rozmedzí niekoľkých stotín S.Môžu sa použiť všetky funkcionalizované tuhé matrice bežne používané ako Stacionárne fázy, najmä silné katexy sú uprednostňované, ked je pl čisteného proteínu nižšie ako 6, zatial čo Stacionárne fázy so silným, ako aj slabým katexom sa môžu bez výnimky pre proteíny s pl vyšším ako 6. Tieto stacionáme fázy môžu byť kremičitýnni alebo polymémymi matricarni funkcionalizovanými so sulfoskupinami alebo karboxylovými skupinami vo forme kyslých alebo zásaditých solí. Dostupné Stacionárne fázy, ktoré sa môžu použiť, sú napríklad Source S (Pharmacia Biotech), SepharoseR SP-Fast Flow, SepharoseR SP-High Performance, Sp SepharoseR XL (Pharmacia Biotech), FractogelR S (Merck, Darmastadt), Mustang S (Pall Corporate),CM SepharoseR FF (Pharmacia Biotech), DOWCXR, Bio-Rad AG (Bio-Rad), PorosR S (perSeptive Biosystenis), ShodexR-S, ToyopearlR SP (Tosohass)Rozsah pH hodnôt, pri ktorých sa vynález môže účinne uskutočniť je veľmi široký, v závislosti od ízoelektrických bodov farmakologicky účinných proteínov, ktoré sa majú čistiť, a je medzi 2 a ll, výhodne medzi 4 a 8,5.Rozšírenie rozsahu pH hodnôt vyšších, ako je pl, v ktorom sa spôsob podľa vynálezu uskutočňuje, sa mení od pH hodnôt korešpondujúcich s pl farmakologicky účinných proteínov k jednej pH jednotke nad tento pl a vykazuje významné rozdiely medzi proteínmi.Napríklad sa zistilo, že V prípade rekombinantného oz 2 b interferónu (rIFNa-Zb) je možné získat absorpciu proteínu na katexovej matrici až do 0,2 jednotiek pH nad jeho pl 5,9, a preto je možné uskutočniť jeho čistenie pomocou katexovej chromatograñe, zatiaľ čo v prípade ľudského sérového albumínu sa zistilo, že zostáva absorbovaný do jednej pH jednotky nad svoj pl.Rozsah koncentrácii solí vodných roztokov, ktoré sú použiteľné ako eluenty, závisí od druhu čisteného fannakologicky účinného proteínu a zistilo sa, že je medzi hodnotami l mM a 100 mM, výhodne medzi 1 mM a 30 mM.Napríklad V prípade čistenia rekombinantného a 2 h interferónu (rIFNoz-Zb) je koncentrácia roztokov solí medzi lmM a 30 mM, výhodne medzi 5 a 15 mM.Potreba mať presné a stabilné hodnoty pH použitých eluentov na chromatograñu podľa predloženého vynálezu je veľmi vhodná, hoci nie absolútne nevyhnutná, pri používaní vodných roztokov vhodne tlmených obsahujúcich 5 až 100 mM, výhodne 10 až 20 mM tlmivé zmesi. Každá chemická látka alebo zmes chemických látok, ktorá má tlrnivú silu v oblasti pH medzi 2 a ll sa môže výhodne použiť, pretože pH hodnoty eluentov, ktoré sa môžu použiť sú medzi 2 a 1 l.Mnohé vodné tlmivé roztoky sa môžu výhodne použiť pri uskutočňovaní predloženého vynálezu a majú nasledujúce zloženie glycín a chlorid sodný, kyselina maleínová a hydroxid sodný, kyselina malónová a hydroxid sodný, kyselina mliečna a hydroxid sodný, kyselina rnravčia a hydroxid sodný alebo lítny, kyselina sukcínová a hydroxid sodný, N-metylpiperazín a kyselina chlorovodíková, piperazín a kyselina chlorovodíková a kyselina octová, L-hystidín a kyselina chlorovodíková, 4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazínetánsulfónová kyselina a hydroxid sodný alebo lítny, N-metyldietanolamín a kyselina sírová, N-metyldietanolamín a kyselina chlorovodíková alebo kyselina octová, pyrídín a kyselina mravčia, citran sodný a hydroxid sodný, ftalát draselný a kyselina chlorovodíková, ftalát draselný a hydroxid sodný, hydrogénfosforečnan draselný a dihydrogénfosforečnan sodný, bicín a hydroxid sodný, barbital sodný a kyselina chlorovodíková, boritan sodný a kyselina chlorovodíková, boritan sodný a hydroxid sodný, 1,3-diaminopropán a kyselina chlorovodíková, kyselina citrónová a fosforečnan monosodný, octan sodný a kyselina octová, irnidazol a kyselina chlorovodíková, trietanolamín a kyselina chlorovodíková alebo octová, tris(hydroxymetylaminometán) a kyselina chlorovodíková, uhličitan sodný a kyslý uhličitan sodný, etanolamín a kyselina chlorovodíková, piperidín a kyselina chlorovodíková, trimetylamín a kyselina mravčia, pyrídín a kyselina octová, trimetylarnín a kyselina chlo

MPK / Značky

MPK: C12N 15/09, C07K 14/56, C07K 14/76, A61P 31/12, C07K 1/18, A61K 38/00, A61K 38/21, A61P 43/00, C07K 14/555

Značky: interferónových, proteínov, spôsob, čistenia

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/13-287827-sposob-cistenia-interferonovych-proteinov.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob čistenia interferónových proteínov</a>

Podobne patenty