Rastlinný materiál cukrovej repy rezistentný voči herbicídom, spôsob jeho produkcie a spôsob kontroly burín v prítomnosti týchto rastlín

Číslo patentu: 286017

Dátum: 27.12.2007

Autori: Penner Donald, Wright Terry

Je ešte 5 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Opísané sú rastliny cukrovej repy, ktoré sú rezistentné proti imidazolinónovým herbicídom. Rastliny cukrovej repy sú odvodené z buniek rastlín citlivých proti herbicídu selekciou na mutované imidazolinónovo rezistentné bunky. Rezistentné rastliny odvodené z takýchto buniek sa môžu pestovať na poliach, ktoré boli ošetrené imidazolinónmi proti burine.

Text

Pozerať všetko

Predkladaný vynález sa týka spôsobu produkcie rastlín cukrovej repy ( Beta vulgarís L.), ktoré sú rezistenmé proti imidazolinónovým herbicídom využívaným na kontrolu burín. Presnejšie, predkladaný vynález sa týka rastlín cukrovej repy odvodených z buniek citlivej cukrovej repy selekciou na mutáciu génov, ktorý kóduje acetolaktát syntázu (ALS), tiež známu ako syntáza acetohydroxykyselinyZnámy stav opisuje genetickú zmenu génu acetolaktát syntázy rekombinanmou technikou, ako je to opísané v USA patentoch číslo 5 013 659 5 141 870 a 5 378 824 Bedbrook et al. Tento spôsob modifikácie cukrovej repy je tiež uvedený ako príklad IV vpatente 5 378 824. Výsledky boli málo uspokojivé v smere produkcie a pravého šľachtenia rastlín na rezistenciu proti herbicídom.Niektoré rezistentné rastliny boli produkované a šľachtené krížením. Saunders a iní v Crop Science 32 1357 - 1360 (1992) tiež opisuje produkciu rastlín cukrovej repy (CR-IB), ktoré sú rezistentné proti sulfonylmočovine, a to zcitlivého samoopelivého klonu cukrovej repy (REL-l) selekciou na mutantnć bunky V kultivačnom médiu obsahujúcom herbicíd. Mnohé rezistentné rastliny boli produkované a krížené. í et al. (Weed Science. 40 317 - 324 (1993) ďalej charakterizovali rezistentné linie a prišli k Záverom, že rezistencía bola navodená zmenou ALS aktivity a nevykazovala rezistenciu ku herbicídom inhibujúcim ALS, ktorá by vznikla krížením. Táto rezistencia bola kódovaná jediným sernidominantným génom.Nie sú dostupné publikácie opisujúce imidazolinnónovú rezistenciu získanú modiñkáciou ALS alebo AHAS v rastlinách cukrovej repy. Rôzne linie kukurice s touto rezístenciou boli vyvinuté tak,ako je to opísané v práci Newhouse a iní. Theoretical and Applíed Gentics 83 65 - 70 (1991).Komerčná cesta ku ochrane rastlín vedie cez využitie ochranných prostriedkov tak, ako to opisuje Európsky patent č. 375 875. Tento spôsob vnáša ďalšie chemikálie do pôdy. Účinnejšia metóda je však vyvinúť rastliny cukrovej repy rezistentne ku imidazolinónovým herbicídom.Je preto cieľom tohto vynálezu poskytnúť metódu na sprostredkovanie rezistencie ku imidazolinónovým herbicidom v rastlinách cukrovej repy cestou selekcie mutácii génu acetolaktát syntázy kódujúceho túto rezistenciu. Ďalej je cieľom predkladaného vynálezu pripraviť rastliny cukrovej repy rezistentne ku tomuto herbicídu. Tieto a ďalšie ciele sa stanú nanajvýš zrejmé odkazmi na nasledujúci opis a náčrty.Prehľad obrázkov na výkresochObrázok l je schéma spôsobu podľa vynálezu na produkciu rastlín cukrovej repy rezistentných ku imidazolinónom. R Rezistentný IM irnidazolinón S citlivý SU sulfonylmočovina Sur ALS alela dominantná pre SU-R, TP-R a IM-S SIR-l 3 ALS alela dominantná pre SU-S, TP-S a IM-R TP triazolopyrirnidín. REL-l bol východiskový materiál na získanie imidazolinónovej rezistencie.Obrázok 2 je kontinuálny diagram prezentujúci jednotlive stupne postupu pri produkcii rastlín mutanta cukrovej repy.Obrázok 3 je graf prezentujúci rezistenciu ku imazetapyru aplikovaného postrekom na klíčiace rastliny cukrovej repy.Obrázok 4 je graf prezentujúci imazetapyrovú rezistenciu v ALS analýzach V bunkovej kultúre.Vynález sa týka rastlinného materiálu cukrovej repy, ktorý pozostáva z mutovaných buniek s mutovaným acetolaktátovým syntázovým génom kódujúcim syntázu, kde je nukleotid modifikovaný z guaninu na adenín V pozícii 337, pričom mutované bunky majú rezistenciu ku imidazolinónovému herbicidu a táto rezistencia sa prenáša konvenčným kríženírn rastlín vyprodukovaných z buniek a tietobunky sú regenerovateľnć na rastliny. Rastlinný materiál je odvodený z citlivých buniek materských rastlín cukrovej repy označených ako REL-l a uložených pod označením ATCC 97885, ktoré nemajú žiadnu rezistenciu proti herbicí 10dom, kultiváciou citlivých buniek V kultivačnom médiu s herbicídom s cieľom výberu mutovaných buniek.Podľa ďalšieho uskutočnenia je rastlinný materiál uložený vo forme semíen pod označením ATCC 97534 (SIR -13Pri rastlinnom materiáli ide o semená alebo klíčne rastliny zo sernien.Vynález sa týka aj spôsobu produkcie herbicídne rezistentnej rastliny cukrovej repy, ktorý zahrnujea) vystavenie prvých buniek rastlín cukrovej repy pôsobeniu irnidazolinónového herbicídu, na ktorý sú prvé bunky citlivé v kultivačnom médiu ab) selekciu sekundámych buniek, ktoré majú rezistenciu proti herbicídu s mutovaným acetolaktát syntázovým génom, kódujúci túto syntázu, kde nukleotid je modifikovaný z guanínu na adenín v pozícii 337, pričom rezistencia sa môže prenášať krížením rastlín obsahujúcich sekundáme bunky.Vynález sa týka aj spôsobu vnesenia herbicídnej rezistencie do ostatných druhov repy, ktorý zahrnujea) vystavenie prvých buniek rastlín cukrovej repy pôsobeniu imídazolinónového herbicídu, ku ktorému sú tieto citlivé v kultivačnom médiu, b) výber sekundárnych buniek, ktoré majú rezistenciu proti herbicíduc) vypestovanie prvých rastlín zo sekundárnych buniek tak, že táto rastlina má rezistenciu proti herbicídu s mutovaným acetolaktát syntázovým génom kódujúcim syntázu, kde nukleotid je modifrkovaný z guanínu na adenín v pozícii 337 ad) kríženie prvých rastlín so sekundámymi rastlinami na produkciu krížencov, ktoré majú rezistenciu proti herbicídu.Podľa výhodného uskutočnenia je rezistencia proti herbicídom vnesená do cukrovej repy.Ďalej sa vynález týka aj spôsobu kontroly burin V porastoch cukrovej repy, ktorý zahrnujea) vysievanie do poľa semená cukrovej repy, ktoré obsahujú bunky s mutovaným acetolaktát syntetázovým génom kódujúcim syntázu, kde nukleotid je modifrkovaný z guanínu na adenin v pozícii 337,kde mutované bunky majú rezistenciu proti imidazolinónovým herbicídom a kde rezistencia je prenášateľná konvenčným lcrížením rastlín produkovaných z buniek na tvorbu rastlín cukrovej repy ab) aplikáciu imidazolinónových herbicídov na rastliny v poli s cieľom kontroly burin.Rastliny cukrovej repy REL-l (Regenerujúce, East Lansing - l) je možné získať od dr. Jozefa Saundersa, výskumníka genetika, USA Oddelenie poľnohospodárstva, East Lansing, Michigan , a boli schválené v roku 1987. Sú dostupne bez finančnej odplaty. REL -1 je citlivá ku nasledovným herbicídom irnidazolinónu (IM-S) sulfonylmočovíne (SU - S ) a triazolopyridín sulfónanridu (TP-S), ako to vidieť na obrázku 1.Využijúc kalusové a suspenzné kultúry, bola vypestovaná línia buniek, ktorá bola heterozygotná pre imidazolinónovú rezistenciu (IM-R). Táto bunková línia ( aj semená) boli zaslané a sú uchované v kolekcií American Type Culture collection pod označením ATCC 97534 dňa 6. mája 1996 na základe Budapeštianskej zmluvy, kde ju vedú pod označením Sir-l 3. Bunková línia je dostupná na požiadanie po udaní mena a čísla, ale udelenie licencie nie je možné z dôvodov uloženia v menovanej zbierke. Šľachtením s elitnými líniami cukrovej repy, hlavne s Beta vulgaris L. je možné produkovať komerčne užitočné rezistentné rastliny cukrovej repy. Tradičné Šľachtiteľská postupy môžu byt použité na prenos írnidazolinónovej rezistencie na iné repy, ako je červená repa.Rastliny cukrovej repy rezistentrré ku irnidazolinónovýrn herbicídom, hlavne imazetapyru, tiež riešia problém s rezíduami, ktoré zostávajú v pôde po aplikácii tohto herbicídu na plochy porastené cukrovou repou. V súčasnosti je potrebné dodržať 40 mesačný odstup od aplikácie herbicídu, až pokým je možné na takúto pôdu znovu vysadiť cukrovú repu. Napokon, vysoká úroveň rezistencie cukrovej repy proti herbicídu, umožňuje využitie inridazolinónu na ničenie burín v porastoch cukrovej repy.Nasledujúci príklad 1 ukazuje odvodenie a šľachtenie inovovaných rastlín cukrovej repy (Sir -13).1. Selekcia imidazolinónovo rezistentných variantov cukrovej repy (Sír- 13)Rel -l (Regenerujúci East Lansing -1) je dobre regenerovateľná samčia fertilná línia cukrovej repyvyužívaná na inieiálnu selekciu mutantov s rezistenciou proti imidazolinónom a je využívaná ako senzitívna kontrola pre väčšinu experimentov, 10Sir -13 Tento izolát buniek cukrovej repy bol vyvinutý nanesenirn Re -l buniek na kultivačné médium obsahujúce imazetapyr. Tento variant je rezistenmý proti irnidazolinónu, ale nie krížmo rezistenmý proti sulfonylmočovine.Sir - 30 lzolát buniek, ako vzorka, ktorá dávala vznik nefertilným rastlinám. Toto bol aberantný výsledok procesu kultivácie buniek.a. Rastliny boli selektované ako zdroj materiálu na somaklonálnu selekciu založenú na schopnosti buniek tvorit kalus v podmienkach vysokej hladiny cytokininov (na B 1 médiu) a tvorit výhony z kalusu.Protokol pre Bl médium1 m .ľl benz larnino urín pH 5,95B 1 tuhé kultivačné médium bolo autoklávovanć s 9 g.l 1 agarom pre pletivové kultúry a bolo modifikované ñlter-sterilizovaným zásobným roztokom herbicidu podľa selekčnej schémy. Agarové médium bolo potom nalievané do 15 x 100 mm jednorazových plastových Petriho misiek.B 1 tekuté kultivačné médium sa pridávalo v alikvótnych čiastkach po 40 ml do 125 rnl Erlenmyerových nádob a bolo autoklávované na použitie pre tekuté suspenzné kultúry. Východiskovým materiálom na selekciu irnidazolinón rezistentného variantu, Sir -13 boli bunkovć línie Rel -1, b. Na selekciu irnidazolinón rezistentného variantu sa použil postup, ako to opisuje obr. 2.Listové disky, ktoré slúžili ako explantáty sa pripravili z rýchlo expandujúcích listov donomých rastlín. Listy je potrebné povrchovo sterilizovat (krok l) dvomi po sebe nasledujúcimi 20 minút trvajúcimi premývaniami roztokom 15 komerčného bielidla s pridaním 0,025 Tritonu X-100 (T-9264, Sigma Chemicals Co., St.Luis, MO). Listy sa potom premyli ešte dvakrát sterilnou deionizovanou vodou. Disky z listov sa vykrojili použitím plameňom sterilizovaného korkovrtu.Listové disky sa asepticky umiestnili na tuhé B 1 médium (krok 2). Disky sa inkubovali v tme pri teplote 30 C počas 4 - 8 týždňov, pokiaľ na listových diskoch neproliferoval rozpadavý biely kalus. Kalusové pletivo sa následne mechanicky separovalo pinzetou a prenieslo do 125 ml Erlenmeyerovej nádoby (krok 3), ktoré obsahovalo 40 ml tekutého kultivačného média B 1. Nádoby sa umiestnili na trepačku pri 50 Hz za nízkej intenzity flurescentného svetla (30 E/m 2 s).Tekuté kultúry sa pasážovali na čerstvé B 1 kultivačné médium po l týždni.Dva týždne po iniciácii tekutej kultúry sa vzniknuté zhluky buniek separovali za využitia sitiek na separáciu buniek (Sigma CD- l) s veľkosťou ôk 60 mesh. V priemere dve tretiny obsahu tekutého média sa odstránilo po sedimentácii kultúry. V kroku 4 sa bunky resuspendovali v zostávajúcom médiu a alikvotné množstvo 1 ml sa rovnomerne nanieslo na tuhé B 1 médium, ktoré sa v tomto pripade doplnilo 50 nM imazetapyru (PURSUIT, American Cyanamid, Wayne, NJ) herbicidom. Petriho misky s kultúrami sa zabalili a inkubovali pri slabom tluorescenlnom osvetlení (5 až 10 E/m 2 s) počas 8 až 12 týždňov.c. Pri koncentrácii 50 nM imazetapyru všetky citlivé bunky odumreli. Zhluky buniek, ktoré prežili a rástli pri tejto koncentrácii je možné označiť ako možne rezistentné. V lcroku 5 tieto zhluky buniek(1 - 3 mm v priemere) boli prenesené na čerstvé kultivačné médium B 1 bez herbicídu a nechali sa rásť za nízkej intenzity osvetlenia (10 - 20 E/m 2 s). Každý údajne rezistentný variant bol individuálne ohodnotený a identifikovaný a narábalo sa sním aj ďalej oddelene.d. V kroku 6 biely rozpadavý kalus bol rozdelený každé 4 - 6 týždne a znovu pestovaný na čerstvom B 1 kultivačnom médiu, pokiaľ sa na kaluse začali objavovať výhony. Tieto výhony boli prenesené na médium M 20, na ktorom výhony rástli ďalej.Protokol pre médium M 20 30 gll sacharózyTuhé kultívačnć médium M 20 sa autoklávovalo s 9 gľl agarom pre pletívové kultúry a modifikovalo sa s ñlter-sterilizovaným zásobným roztokom herbicídu, ako to vyžadovala selekčná schéma. Agarové médium sa nalievalo do 30 x 100 mm jednorazových Petriho misiek.Kultúry výhonov sa udržiavali a pestovali pri slabom fluorescenčnom osvetlení 10 až 20 E/m 2 s a nmožené rozrezanirn výhonkov skalpelom Vybrané výhony boli ďalej množené ahodnotené na úroveň rezistencie tak, ako sa opisuje ďalej.2. Úroveň imidazolinovej rezistencie v kultúre výhonov.V kroku 7 sa výhonky hodnotili na herbicídovú rezistenciu tak, že sa na kultivačné médium M 20 s logaritrnicky sa zvyšujúcou koncentráciou herbicídu imazetapyru v rozhraní od lnM až do 0,1 mM nasadili tri malé ale rovnako dlhé segmenty výhonov do každej Petriho misky. Reakcia kultúry Sir -13 sa porovnávala s kultúrou výhonov odvodených z citlivej kontroly (Rel - l). Výhonkovć kultúry sa udržiavali pri intenzite osvetlenia 20 E/m 2 s pri 25 °C počas 3 týždňov. Reakcia výhonkových kultúr sa hodnotila na základe počtu poškodených výhonov a čerstvej hmotnosti kultúr po 3 týždňoch po prenesení na selektívne médium. Rozsah herbicídnej rezistencie sa určovala pomerom rezistenmej ku citlivej hodnote 150 (prípad, keď herbicíd vyvolá 50 -né poškodenie).Hodnota viacnásobnej rezistencie pri každom variante sa určovala obdobne ako v predošlom prípade, len výmenou herbicídu. Kultúra výhonkov variantu Sir-l 3 vykazovala 220-násobne vyššiu hladinu rezistencie ku imazetapyru, ale nevykazovala viacnásobnú rezistenciu ku herbicídu na báze sul fonylmočoviny, chlórsulfurónu alebo ku triazolopyrimidín sulfónanilídu a ku Ílumetsulamu, ako to ukazuje tabuľka l.

MPK / Značky

MPK: A01H 1/00, C12N 5/00, A01H 3/00, C12N 15/01, A01H 1/04, A01H 5/00, C12N 5/04, C12N 15/00, A01H 1/06, A01H 4/00

Značky: voči, spôsob, produkcie, týchto, burín, materiál, kontroly, herbicídom, rezistentný, cukrovej, rastlín, rastlinný, přítomnosti

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/13-286017-rastlinny-material-cukrovej-repy-rezistentny-voci-herbicidom-sposob-jeho-produkcie-a-sposob-kontroly-burin-v-pritomnosti-tychto-rastlin.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Rastlinný materiál cukrovej repy rezistentný voči herbicídom, spôsob jeho produkcie a spôsob kontroly burín v prítomnosti týchto rastlín</a>

Podobne patenty