Metóda pozitívnej selekcie geneticky transformovaných buniek založená na využití manózy alebo xylózy

Je ešte 5 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Opisuje sa spôsob identifikácie a selekcie buniek z populácie eukaryotických buniek, ktoré majú v dôsledku transformácie metabolickú výhodu a ktoré sú kultivované na alebo v médiu obsahujúcom aspoň jednu zlúčeninu, kde: i) bunky sú transformované nukleotidovou sekvenciou alebo sa do nich táto nukleotidová sekvencia vkladá spolu s inými sekvenciami, pričom aspoň jedna z nich obsahuje oblasť, ktorá: a) kóduje proteín, ktorý sa zúčastňuje metabolizmu menovanej zlúčeniny a/alebo b) reguluje aktivitu génu kódujúceho takýto proteín
a ii) menovanou zlúčeninou je manóza alebo xylóza, alebo ich deriváty alebo prekurzory, alebo substrát uvedeného proteínu, alebo iná zlúčenia, ktorá môže byť transformovanými bunkami metabolizovaná na taký substrát, okrem prípadu, keď zlúčeninou je manóza a proteínom je manóza-6-fosfát izomeráza.

Text

Pozerať všetko

Vynález opisuje taký spôsob selekcie geneticky transformovaných buniek, do ktorých bola vložená požadovaná nukleotidová sekvencia, pri ktorom transformované bunky získajú selekčnú výhodu. Takáto selekčná výhoda transforrnovaných buniek môže byť daná ich lepšou schopnosťou využívat pridanú zlúčeninu ako živinu, rastový faktor alebo zdroj energie.Vieme, že pri prenose genetického materiálu do populácie buniek sa iba určitý počet buniek úspešne transformuje. Na identifikáciu a separáciu transformovaných buniek sa tradične používa negatívna selekcia. Pri tomto postupe sú transformované bunky schopné prežiť a rásť,zatiaľ čo netransformované bunky sú inhibované v raste alebo dokonca usmrtené látkou, ktorú transformované bunky dokážu, vďaka svojej transformácii, tolerovat.Ak sa napríklad transfomiuje populácia rastlinných buniek, selekcia transformantov sa bežne opiera o prítomnosť selekčného génu v transformovaných bunkách. Selekčným génom je gén zabezpečujúci rezistencíu proti antibiotikám alebo herbicidom. Selekčný gén, ktorý sám osebe nemá v transformovaných rastlinách žiadnu užitočnú funkciu (v skutočnosti môže byť v rastline dokonca nežiaduci),sa spojí alebo vloží do požadovaného génu, ktorý sa potom inkorpomje do rastliny. To znamená, že oba gény sú vložené do populácie buniek alebo skôr do niektorých buniek V populácii, pretože je ťažké, ak nie nemožné transformovať všetky bunky. Bunky sa potom kultivujú na alebo V médiu,ktoré obsahuje antibiotikum alebo herbicíd, proti ktorému sú geneticky transfonnované bunky odolné vďaka selekčněmu génu. Týmto sa umožňuje identifikácia transforrnovaných buniek, pretože netransformované bunky, ktoré neobsahujú gén rezistencie proti antibiotiku alebo herbicidu,sú rastovo inhibované alebo usmrtené.Takéto negatívne selekčné metódy majú určité nevýhody. Napríklad netransforrnované bunky môžu byt usmrtené vďaka prítomnosti antibiotika alebo herbicídu v kultivačnom médiu, v dôsledku čoho vzniká riziko usmrtenia aj pre transforrnované bunky, ak je bunková populácia koherentným tkanivom. Toto riziko vzniká tým, že smrť netransformovaných buniek môže zabrániť prisunu živín k transforrnovaným bunkám, alebo môžu poškodené či umierajúce bunky vylučovať toxické zlúčeniny.Ďalšou nevýhodou negatívnej selekcie je, že môže byť nežiaduca prítomnosť nepodstatného génu, napriklad génu pre rezistenciu proti antibiotikám. Ochrancovia životného prostredia a vládne inštitúcie majú obavy týkajúce sa bezpečnosti vkladania génov na rezistenciu proti antibiotikám do rastlín a mikroorganizmov. Tieto obavy sú veľmi opodstatnene vo vzťahu k potravinárskym rastlinám a mikroorganizmom, ktoré nie sú určené na pestovanie v uzavretých podmienkach (ale napríklad V poľnohospodárstve), ako i k mikroorganízmom určeným na použitie v uzavretých podmienkach, ale ktoré by z nich mohli nedopatrenim uniknúť.Ďalšou nevýhodou negatívnej selekcie je, že rastlinné bunky ošetrené toxickými látkami sa stávajú citlivejšími na bakteriálne infekcie. Toto je závažný problém najmä Vtedy,ak je transformačným vektorom baktéria Agrabacterium,kedy sú ošetrené tkaniva alebo bunky predstihnuté v raste baktériami a to i napriek tomu, že sa na inhibíciu rastu baktérií používajú antibiotiká.Selekcia buniek alebo tkanív pomocou negatívneho výberu vyžaduje navyše presné načasovanie expresie vložených génov v selekčnom procese. V prípade, že na transgénne bunky pôsobí toxická zlúčenina skôr, než je exprimovaný detoxifikačný gén, alebo skôr než je k dispozícii dostatočné množstvo produktu tohto génu tak, aby boli účinky toxickej zlúčeniny eliminované, sú tak netransformované, ako aj transformované bunky usmrtené. Ak sa selekčné činidlo použije príliš neskoro, môže byť selekcia transgénnych tkanív alebo buniek brzdená napríklad tvorbou výhonkov alebo kalusov z netransforrnovaných buniek alebo tkanív, ktoré tvoria bariéru prieniku toxickej zlúčeni ny.Uvedené nevýhody sú spôsobom podľa vynálezu(označovanom ako pozitívna selekcia alebo kombinovaná pozitívne/negatívna selekcia) prekonané a to najmä v miere postačujúcej na identifikáciu a izoláciu geneticky transformovaných buniek, bez toho, aby sa poškodili alebo usmrtili netransformovane bunky V populácii a aby došlo k nežiaducemu vloženiu génu pre rezistenciu proti antibiotikám či herbicidom. Okrem faktu, že sa eliminuje potreba génov na rezistenciu proti antibiotikám alebo herbicídom,je metóda pozitívnej selekcie podľa vynálezu omnoho účinnejšia ako tradičné negatívne selekcie a kombinácia pozitívnej s negatívnou selekciou má rovnako dobrú, ak nie lepšiu selekčnú frekvenciu transgénnych výhonkov ako použitie samotnej negatívnej selekcie. Ďalšou výhodou použitia pozitívnej selekcie je, že jediný gén sa môže využiť tak v úlohe referenčného (reportér) génu, ako aj v úlohe génu selekčného. Preto dochádza k zjednodušeniu konštrukcie vektorov, vzniku stabilnejších konštruktov a 100 korelácii medzi expresiou referenčného a selekčného génu.Pozitívna selekcia môže rovnako eliminovať spomenuté problémy s časovaním selekcie, pretože selektívne pôsobiace zlúčeniny môžu na konkrétnom substráte vznikať v dôsledku činnosti génového produktu, exprimovaného z vloženého génu. Takto sa môže selektívne pôsobiaca zlúčenina hromadiť v dôsledku expresíe selektivneho génu a selektivny účinok sa prejaví až vtedy, ak sa už vyprodukovalo dostatočné množstvo selektívnej zlúčeniny.Vynález opisuje spôsob identifikácie a selekcie buniek,ktoré majú v dôsledku transformácie metabolickú výhodu,z populácie eukaryotických buniek kultivovaných na alebo v médiu obsahujúcom aspoň jednu zlúčeninu, kdei) bunky sú transformované nukleotidovou sekvenciou alebo sa do nich táto nukleotidová sekvencia vkladá spolu s inými génmi, pričom aspoň jedna z nich obsahuje oblasť,ktoráa) kóduje proteín, ktorý sa zúčastňuje metabolizmu tejto zlúčeniny, a/alebob) reguluje aktivitu génu kóduj úceho tento proteín aii) zlúčeninou je manóza alebo xylóza, alebo ich deriváty, alebo prekurzory, alebo substrát uvedeného proteínu,alebo iná zlúčenina, ktorá sa môže transformovanými bunkami metabolizovať na taký substrát, okrem prípadu, ked zlúčeninou je manóza a proteínom je manóza-ó-fosfátizomeráza.Vynález ďalej opisuje spôsob identifikácie a selekcie buniek, ktoré majú v dôsledku transformácie metabolickú výhodu, z populácie eukaryotických buniek kultivovaných na alebo v médiu obsahujúcom aspoň jednu zlúčeninu, a kdei) bunky sú transformované nukleotidovou sekvenciou alebo sa do nich táto nukleotidová sekvencia vkladá spolu s inými génmi, pričom aspoň jedna z nich obsahuje oblasť,ktorá a) kóduje proteín, ktorý sa zúčastňuje metabolizmu tejto zlúčeniny a/alebo b) reguluje aktivitu génu kódujúceho tento proteín aii) do média sa pridá čínidlo, ktore znižuje bunkovú toxicitu uvedenej zlúčeniny.V prípade, že sa do média pridalo činidlo znižujúce toxicitu zlúčeniny je výhodné, aby touto zlúčeninou bola manóza a nukleotidom alebo kointrodukovanou nukleotidovou sekvenciou bola sekvencia kódujúca manóza-ó-fosfátizomerázu.Bunky, ktoré majú metabolickú výhodu, sú okrem iného schopné rýchlejšie rásť ako bunky bez tejto výhody a/alebo môžu výhodne využívať substráty (napr. prekurzory živín atď), ktoré nezvýhodnené bunky využívat nedokážu,a/alebo môžu detoxikovať substráty pre nezvýhodnené bunky toxické alebo rastovo inhibičné.Proteínom zúčastnený na metabolizme zlúčeniny je typicky, ale nie výlučne, enzým, ktorý priamo alebo nepriamo zodpovedá za produkciu a využitie zlúčeniny alebo jej derivátov či prekurzorov. Protein sa môže zúčastniť metabolizmu zlúčeniny aj tým, že sa na ňu viaže, prenáša ju z jedného miesta na iné v rámci bunky, tkaniva či organizmu, alebo ju iným spôsobom viaže a tým mení jej lokálnu dosiahnuteľnosť.Oblast nukleotidovej sekvencie, ktorá reguluje aktivitu génu kódujúceho proteín, môže ovplyvňovať úroveň expresie endogénneho génu bud tým, že je promótorom alebo má pre takýto gén promótorovú aktivitu a je vložená do blizkosti tohto génu. Blízkosťou sa rozumie vzdialenosť 10 000 kb. Prípadne môže dôjsť k nepriamej regulácii zmenou väzby RNA polymerázy na promótor štruktúmeho génu kódujúceho proteín alebo komplementámou väzbou nukleotidových sekvencií aspoň v jednej časti štruktúmeho génu, následkom čoho je zväčša zníženie množstva tohto proteínu v bunke.Pod derívátom manózy alebo xylózy sa rozumie zlúčenina, ktorá sa môže využívať, môže sa viazať, môže byt substrátom alebo môže byt produktom ľubovoľného proteínu, ktorý sa priamo alebo nepriamo zúčastňuje metabolizmu manózy alebo xylózy. V prípade manózy je nevyhnutne uvedomiť si, že takýmito derivátmi môžu byť sacharidy, ako napríklad glukóza alebo galaktóza, ktoré môžu byť predmetom aktivity epimeráz, pričom vzniká manóza alebo jej deriváty či prekurzory. Pod derivátmi sa tiež rozumejú manózové alebo xylózové zvyšky, ktorých hydroxylové skupiny sú kovalentne alebo iónovo substituované. Takými substitučnými skupinami môžu byt estery, étery,aminoskupiny, amidoskupiny, zvyšky kyseliny fosforečnej,sulfoskupiny, karboxylové a alkylkarboxylové skupiny a kombinácie uvedených skupín. Prekurzorrni môžu tiež byť deriváty manózy alebo xylózy a to v prípade, ak sa ich derivatizácía môže metabolicky odstrániť za vzniku manózy alebo xylózy.Pod termínom bunka sa v súvislosti s vynálezom rozumejú protoplasty a pod termínom populácia buniek sa rozumie tkanivo, orgán alebo jeho časť, populácia jednotlivých buniek na alebo v kultivačnom substráte, alebo celý organizmus, napríklad rastlina.Vynález ďalej opisuje transformovanć bunky selektovane spôsobom podľa vynálezu, rastlinné transformované bunky, ako aj rastliny, potomstvo či semená odvodené od týchto buniek. Spôsob selekcie podľa vynálezu sa môže uplatniť na rastlinách, ako sú napríklad ovocie ako rajčiaky, mango, broskyne, jablká, hrušky, jahody, banány amelóny poľné plodiny ako Slnečnica, tabak a cukrová repa drobnozmné obilniny ako pšenica, jačmeň a ryža, kukurica a bavlník zelenina ako sú zemiaky, mrkva, kapusta a cibuľa.Osobitne výhodnými rastlinami sú cukrová repa a kukurica.Použitie metódy pozitívnej selekcie in vivo podľa vynálezu je veľmi význanmé, napríklad v spojení s transformáciou realizovanou na celých rastlinách alebo na ich častiach, kde rastliny alebo ich časti obsahujú tak transformované ako aj netransformovane bunky, a to preto, že selekciu dosiahli bez toho, aby sa priamo poškodili susedné netransformované bunky. Transformované bunky v porovnaní s bunkami netransformovanými tak majú selektívnu výhodu (napr. schopnosť tvorit výhonky), ale bunky netransformované netrpia žiadnou výraznou ujmou v zmysle poškodenia alebo usmrtenia, ako je to pri použití antibiotík alebo herbicídov.Selektívna výhoda transformovaných buniek je typický rozdiel alebo prednosť, ktorá umožňuje ich prostú vizuálnu identifikáciu, to znamená bez použitia osobitného testu na prítomnosť signálneho (market) génu.Populácia buniek sa môže pestovať v alebo na kultivačnom médiu, ktore obsahuje aspoň jednu zlúčeninu, ktorá je inaktívna, ale je priamo či nepriamo aktivizovaná v transformovaných bunkách. Táto zlúčenina je neaktívna alebo je jej aktivita nižšia V netransformovaných bunkách než v bunkách transfonnovaných, takže transforrnované bunky majú selektívnu výhodu, ktorá umožňuje ich selekciu z celej bunkovej populácie.Populácia buniek sa tiež môže pestovať v alebo na kultivačnom médiu obsahujúcom zlúčeninu, dostupnú transforrnovaným bunkám vďaka expresii čí transkripcii vloženej nukleotídovej sekvencie, pričom pre netransformované bunky je táto zlúčenina nedostupné alebo je dostupná horšie. Tým majú transformované bunky selektívnu výhodu.Môže sa stať, že polypeptid kódovaný vloženou nukleotidovou sekvenciou v transfonnovaných bunkách priamo aktivizuje neaktívnu zlúčeninu a zároveň aj netransformované bunky endogénne obsahujú alebo produkujú uvedený polypeptid, ktorým je najčastejšie nejaký enzým. V takýchto prípadoch nie je nutné, aby neaktívna zlúčenina bola v netransfonnovaných bunkách úplne neaktívna, stačí ak je takáto zlúčenina alebo živina podstatne menej aktívna v netransformovaných bunkách ako v transformovaných,Inými slovami na selekčné účely postačuje kvalitatívny rozdiel medzi transformovanými a netransformovanými bunkami v aktivizácii pôvodne neaktívnej zlúčeniny. V takých prípadoch sa môžu k bunkám pridat substráty či inhibítory, ktoré kompetujú s natívnym enzýmom. Zvlášť výhodné sú inhibítory aktivizované natívnymi enzýmami, pri použití ktorých dochádza k autokatalwovanej produkcii aktívneho inhibítora, a to v takej koncentrácii, ktorá v podstate stačí na úplnú inhíbíciu natívneho enzýmu.Bunky sa môžu taktiež transformovať vloženou nukleotidovou sekvenciou, ktorá kóduje penneázu alebo iný transportný faktor, umožňujúci selekčnej zlúčenine prejst bunkovou membránou a vstúpiť dovnútra transfonnovaných buniek alebo prejst ich vnútrobunkovou membránou(napríklad membránou organely). V takom prípade je aktiváciou pôvodne neaktívnej zlúčeniny myslený selektívny príjem zlúčeniny transformovanými bunkami, pričom prijem tejto zlúčeniny bunkami netransformovanými je bud celkom nemožný, alebo prebieha na rádovo nižšej úrovni. Altematívne môže vložená nukleotidová sekvencia slúžiť namiesto na uľahčenie transportu selekčnej zlúčeniny do bunky na nasmerovanie produktu génu do príslušného bun SK 285107 B 6kového kompartmentu, v ktorom sa nachádza neaktívna zlúčenina, napríklad mimo plazmatickej membrány či do vakuoly alebo endoplazmatického retikula.Ak sa dve nukleotidové sekvencie spoločne vkladajú do buniek, môžu buď priamo na seba nadväzovať, alebo iným spôsobom spoločne introdukovať do bunky tak, aby prítomnosť jednej nukleotidovej sekvencie V bunke indikovala prítomnost alebo aspoň zvýšenú pravdepodobnosť výskytu sekvencie druhej. Takéto dve sekvencie sú typicky, nie však nevyhnutne súčasťou toho istého genetického konštruktu a môžu sa vkladať pomocou toho istého vektora.Pretože je nutné, aby vložené nukleotidové sekvencie boli tiež transfomiovanou bunkou exprimované, obsahuje typicky génový konštrukt oboch nukleotidových sekvencií tiež sekvencie regulačné, ktoré umožňujú expresiu týchto nukleotidových sekvencií, napríklad známe promótory či terminátory transkripcie. Vložená nukleotídová sekvencia je tak najčastejšie spojená s konštitutívnym alebo regulačným promótorom.Spôsob podľa vynálezu sa môže tiež použit V prípade,ak sú dve rôzne nukleotidové sekvencie vkladané do bunky nezávisle. To možno dosiahnut napríklad tak, že sa na inkorporáciu oboch génov použije rovnaká baktéria, pričom dôjde k vloženiu relatíme veľkého počtu kópií požadovaného nukleotidu do bunky, Pritom relatívne vysoká pravdepodobnosť, že bunky majúce expresiu kointrodukovaného génu budú takisto obsahovať a exprimovat požadovanú nukleotídovú sekvenciu. Nezávislé vloženie dvoch alebo viac génov, ktoré zapríčiní ich spoločnú expresiu v jednej bunke je všeobecný proces, vyznačujúci sa nízkou mierou pravdepodobnosti. Preto použitie metódy pozitívnej selekcie s vyššou selekčnou frekvenciu v týchto systémoch je zvlášť výhodné.Zlúčenina použitá na selekciu môže mať efekt tak na pozitívnu ako i na negatívnu selekciu. Napríklad manóza je v dostatočne vysokých koncentráciách toxická pre väčšinu rastlín, ale bunky, ktoré obsahujú enzýmy metabolizujúce manózu dokážu eliminovať jej negatívny efekt a navyše získajú výhodu použitia manózy ako zdroja sacharidov. V takom prípade má jediná zlúčenina spolu s jediným génom vlastnosti pozitívneho aj negatívneho selekčného systému. Takýto systém sa môže vytvoriť aj pomocou dvoch alebo viac génov, ktoré sú spoločne zodpovedné za inhibíciu negatívnych účinkov zlúčeniny a rozvinutie pozitívneho účinku v transformovaných bunkách.Vynález ďalej opisuje expresiu alebo transkripciu nukleotidovej sekvencie, v dôsledku ktorej dochádza k zablokovaniu metabolizmu zlúčeniny, ktorá je populáciou buniek zvonka dodávaná, alebo k zablokovaniu syntézy takej zlúčeniny v transformovaných bunkách, na základe čoho sa môžu rozpoznať alebo selektovat transformované bunky.Vynález ďalej opisuje spôsob selekcie transformovaných buniek kombináciou pozitívnej a negatívnej selekcie. Do transformovaných buniek spolu s už uvedenými nukleotidovýrni sekvenciami sa vkladá aj sekvencia nukleotídov,ktorá kóduje rezistenciu proti aspoň jednému členu zo skupiny pozostávajúcej z toxínov, antibiotík a herbicídov. Medium, v alebo na ktorom sú bunky kultivované, tiež obsahuje aspoň jednu látku zo skupiny pozostávajúcej z toxínov, antibiotík a herbicídov, a to takú, proti ktorej sú transformované rastliny rezistentné. Je výhodné, ak sa požadovaný gén vkladá do bunky spolu s dvoma rôznymi selekčnými génmi.Je výhodné, ak je selektívne pôsobiaca zlúčenina manóza alebo xylóza. Ale taká zlúčenina môže byt aj derivát manózy, napríklad manóza-G-fosfát, alebo derivát xylózy,napríklad xylóza fosfát, alebo prekurzor manózy čí xylózy.Bunky sa môžu transformovať ľubovoľne požadovanou sekvenciou. Touto sekvencíou môžu byť gény kódujúce rezistenciu proti hubám, vírom, baktériám alebo hlístam.Bunky sa môžu transformovať baktériamí, napríklad pomocou baktérií druhu A grobacterium, ktoré sú citlivé na použitie selekčnej zlúčeniny. Tým sa zníži riziko posttransformačnej infekcie transformovaných buniek použitými baktériami. Bunky sa môžu transformovať ľubovoľným všeobecne používanýrn spôsobom, napríklad elektroporáciou, mikro-injikáciou mikro-projektilovým delom a transformáciou pomocou Ri či Ti plazmidov. V celej rastline sa môžu regenerovať transformované bunky V prípade, ak majú rekombinantnú DNA stabilne inkorporovanú vo svojom genóme..le výhodné, aby uvedeným proteínom bol enzým, ktorý sa zúčastňuje metabolizmu manózy alebo xylózy. Takými enzýmami sú xyloizomerázy a fosfomanoizomerázy ako napríklad manóza-ó-fosfát-izomeráza a manóza-l-fosfát-izomeráza, fosfomano-mutáza, epimerázy manózy, ktoré konvertujú saeharidy na manózu alebo manózu na sacharidy, napriklad na glukózu alebo galaktózu fosfatázy ako napríklad manóza-ó-fosfatáza a manóza-l-fosfatáza permeázy, ktoré sa zúčastňujú transportu manózy alebo jej derivátov, alebo prekurzorov do bunky.Látkami, ktoré znižujú bunkovú toxicitu selekčnej zlúčeniny sú najčastejšie deriváty glukózy ako napríklad metyl-S-O-glukóza alebo florizín (tlóretín T-B-D-glukozid).Vynález bude ďalej opísaný v nasledujúcich príkladoch sprevádzaných obrázkami.Obrázok l zobrazuje prípravu reštrikčného fragmentu BCl/HíndIlI, ktorý obsahuje úsek kódujúci fosfomanózaizomerázu E. C 011.Obrázok 2 zobrazuje plazmid EPL (Pietrzak, M. a ďalší, Nucleíc Acid Res. 14, s. 5857 až 5868, (I 986. DW 2 t je Pst-Kpnl fragment CaMV terminátora izolovaný z plazmidu pDW 2.Obrázok 3 zobrazuje binámy plazmid p BKL 4 (Nielsen, K.K. a ďalší, Mol. Plant Microbe lnteract. 6, s. 495 až 506 (1993. Symboly zodpovedajú týmto reštrikčným miestamH II Hinc II Se Spe lB/Bc Bam HI/Bcll Bcll ligovaný do BamHl H/Sm Hind Ilľ/Sma l, vložený do miesta Hind III tupým koncom ligovaným s Sma IŠrafované úseky označujú promótory, vyplnené tenninátormí a prázdne sú kódujúce sekvencie. V úseku označenom šípkou nie je známy smer transkripcie.Obrázok 4 zobrazuje plazmid pBKL 4 obsahujúci gén man A vložený medzi gény GUS a NPT II.Konštrukcia binámeho plazmidu p(BKL 4-manóza) obsahujúceho sekvencie kódujúce fosfomanóza-izomerázu z E. coliGén pre fosfomanóza-izomerázu (EC 5.3.2.8) E. colí pochádza z plazmidu pGS 63 (Miles, H. a ďalší Gene 32, s. 41 až 48, (1984 (pozri obrázok l). Tento plazmid bol odvodený z plazmidu pBR 322, v ktorom bola oblast medziunikátnymi reštrikčnými miestami enzýmov PstI a HíndIII nahradená úsekom chromozómu E. coli, ktorý nesie štruktúmy gén (man A) kódujúci fosfomanóza-izomerázu a fragment priľahlého génu pre fumarázu (fum A). Plazmid pGS 63 tak stratil časť génu pre B-laktamázu a bol selektovaný na kultivačnom médiu s tetracyklínomFragment PstI/BamHI (s dĺžkou 2466 bp) obsahujúci celkový chromozonálny fragment PstI/HindIII a 357 bp dlhú časť pBR 322 bol naligovaný do viacnásobného klonovacieho miesta plazmidu pUCl 8, čím vznikol plazmid pDO 18 (pozri obrázok l).Plazmid pDO 18 bol naštepený reštriktázou HíndIII a vzniknuté voľné 3 boli zaplnené pomocou Klenowovej polymerázy. Otvorený plazmid pDO 18 so zaplneným miestom HíndIII (Hindllľ, pozri obrázok l) sa naštepi enzýmom Bell a Vzniknutý 1218 bp dlhý fragment BcIl-Hindllľ, ktorý obsahuje oblasť kódujúcu fosfomanóza-izomerázu sa naklonuje do plazmidu pEnhanced-Peter-Línker (pEPL), ktorý sa však predtým naštepí enzýmami Smal a BamHI. Vzniknutý plazmid sa nazýva p(EPL-manóza).Plazmid pEPL je skonštruovaný z plazmidu pCaMVCN(198 ) From a ďalší, Nature 319, s. 719 (1986, z ktorého bol štepením pomocou enzýmu PstI vybraný gén CAT. Do miesta Pstl bol vložený malý linker (linker Pstl-BamHIBall-PstI), čím vznikol plazmid zvaný pLise (pL). Plazmid pL sa naštepí enzýrnami HincII a Bglll a Vzniknutý fragment, ktorý obsahuje 35 S promótor a NOS terminator sa naklonuje do iného plazmidu pL, ktorý bol predtým naštepený enzýmami EcoRV a Bglll. Tak miesto EcoRV ako aj HincII sú tupo zakončené miesta. Vzniknutý konštrukt sa nazýva pEnhanced-Lise (pEL). Plazmid pEL sa od plazmidu pCaMVCN podstatne líši tým, že obsahuje variant promótora 35 S s tandemovou duplikáciou sekvencie 250 bp proti smeru transkripeie promótora. Tento variant promótora 35 S má približne desaťkrát vyššiu transkripčnú aktivitu ako prirodzený promótor 35 S (Kay a ďalší, Science 236, s. 1299 až 1302 (1987. Plazmid pEL sa naštepí enzýmami PstI a Bglll, čím sa odstráni terminator NOS a miesto neho sa na voľné miesto vloží terminator CaMV (DW 2 t). Nakoniec sa do miesta PstI medzi zosilnenýrn promótorom 3 e 5 S a CaMV terminátorom vloží línker (PstI-BamHI-Smal-Sacl-Sall-Sphl). Tento plazmid sa nazýva pEPL (pozri obrázok 2).Plazmid p(EPL-manóza) sa naštepí enzýmom HíndIII,čím sa uvoľní fragment, ktorý obsahuje úplný zosilnený promótor 35 S, oblasť kódujúcu fosfomanóza-izomerázu E. call a terminator CaMV. lzolovaný fragment sa naklonuje do Hindlll miesta bínámeho vektora pBKL 4 (pozri obrázok 4). Získaný plazmid sa nazýva p(BKL-manóza). Miesto pre enzým HíndIII sa v plazmide pBKL nachádza medzi génom pre rezistenciu proti kanamycínu a génom pre B-glukuronídázu (GUS, pozri obrázok 3). Každý z génov (chimerický manózový, pre rezistenciu proti kanamycínu aj GUS) má vlastný promótor aj terminator. Obrázok 4 ukazuje konštrukt p(BKL-manóza) s chimerickým genom pre fosfomanóza-ízomerázu vloženým medzi gény GUS a NPT ll plazmidu pBKL 4.Konštrukt p(BKL-manóza) sa izoluje z E. e 011 a použije sa na transformáciu baktérie Agrobacterium tumefaciens kmeňa LBA 4404, ktorá obsahuje nefunkčný pomocný plazmid pAL 4404 (Hoekema a ďalší, Nature, 303, s. 179 až 180 0983) Ooms a ďalší, Plazmid 7, s. 15 až 29 (1932 s použitím rozrnrazovacej metódy (Holsters a ďalší, Mol. Gen. Genet 163, s. 181 - 187, (1987.Sekvenciu štruktúmeho génu (man A) pre fosfomanóza izomerázu publikoval Miles a Guest (Gene 32, s. 41 až 48Výhonky Solanum luberosum a odrôd Satuma, Bintje alebo Dianella sa kultivujú podľa Linsmaiera a Skooga (Physiol. Plant. 18, s. 100 až 127, (1965 na substIáte LS (pozri ďalej), obohatenom 2 TM tiosiranu striebomého pri teplote 25 °C. Na kultiváciu sa použije cyklus 16 hodín svetla a 8 hodín tmy. Zásobné kultúry sa kultivujú 20 až 40 dní. Potom sa z výhonkov odrežú listy, naplátkujú sa na jednotlivé nodálne segmenty (približne po 0,8 cm) tak, aby každý z nich obsahoval jedno cievne zauzlenie.Kultivačné platne obsahujú substrát LS (sacharóza 30 g/l),agar (8 g/1), 2,4-dichloro-fenoxyoctovú kyselinu (2 mg/ml) a trans-zeatín (0,5 mg/ml).Výhonky z približne 40 dní starých kultúr (vysoké asi 5 až 6 cm) sa narežú na intemodálne segmenty (0,8 cm). Tieto segmenty sa umiestriia do tekutého LS substrátu (LS-médium), ktorý obsahuje baktérie Agrobacterium tumefaciens s binámym vektorom, ktorého gény majú byt vložené do buniek zemiakov. Takéto gény sú napríklad gény kódujúce B-glukuronidázu (GUS), gén NPT II zodpovedný za rezistenciu proti antibiotiku kanamycínu a/alebo gény kódujúce proteíny, ktore sa zúčastňujú metabolizmu manózy,napríklad gén pre manóza-ó-fosfát-izomerázu, manóza epimerázu, fosfomanomutázu atď. (pozri ďalej).Baktérie druhu Agrabacterium sa kultivujú cez noc na substráte YMB (trihydrát hydrogenfosforečnanu draselného 0,66 g/l, heptałiydrát síranu horečnatého 0,20 g/l, ehlorid sodný 0,10 g/I, manitol 10,0 g/l a kvasnicový extrakt 0,40 g/l). Substrát obsahuje tiež príslušné antibiotíkum podľa génov rezistencie použitého kmeňa baktérií Agrabacterium. Baktérie sa kultivujú po dosiahnutie optickej denzity približne 0,8 (merané pri vlnovej dĺžke 60 nm, OD-660). Suspenzia sa potom odstredí centrifúgou a bunky sa opät resuspendujú v LS-médiu na hodnotu 0 D-660 približne 0,5 .V tejto suspenzii baktérií Abrobacterium sa potom inkubujú spomenuté intemodálne segmenty asi 30 minút. Po tomto sa prebytočne baktérie odstránia ich preosiatím na sterilný íiltračný papier.Spoločná kultivácia segmentov výhonkov a baktérií AgrabacteríumSegmenty výhonkov sa kultivujú spolu s baktériarni 72 hodín na tiltračnom papieri napustenom LS-médiom (pozri skôr uvedené) v Petriho miskách pokrytých bielou papierovou tkaninou. Tento substrát ďalej označujeme ako kokultivačný substrát. Substrát i výhonky sa pokryjú sterilnými íiltračnými papiermi. Petriho misky sa inkubujú pri teplote 25 °C v cykle 16 hodín svetla a 8 hodín tmy.Po 48 hodinách spoločnej kultivácie sa segmenty výhonkov prenesú na LS médium obohatené 800 mg/1 carbenicilínu. Prenesené fragmenty sa potom jemne pretrepávajú tak, aby sa odstránili a zničili adherujúce baktérie Agrobacterium.Takto premytě fragmenty sa potom prenesú na substrát LS (taký istý ako skôr uvedený okrem toho, že koncentrácia trans-zeatínu je l mg/l, ďalej sa substrát obohatí gibirelovou kyselinou (0,1 mg/l) a karbenicílínom (800 mg/l) a

MPK / Značky

MPK: A01H 5/00, C12N 15/82, C12N 5/10, C12N 15/61

Značky: pozitívnej, transformovaných, založená, manózy, xylózy, metoda, buniek, využití, selekcie, geneticky

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/13-285107-metoda-pozitivnej-selekcie-geneticky-transformovanych-buniek-zalozena-na-vyuziti-manozy-alebo-xylozy.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Metóda pozitívnej selekcie geneticky transformovaných buniek založená na využití manózy alebo xylózy</a>

Podobne patenty