Tkanivový aktivátor plazminogénu t-PA, spôsob jeho výroby a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom

Číslo patentu: 279029

Dátum: 06.05.1998

Autori: Martin Ulrich, Kohnert Ulrich, Stern Anne, Fischer Stephan, Rudolph Rainer

Je ešte 5 strán.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Tkanivový aktivátor plazminogénu t-PA, ktorý nie je glykozylovaný a je tvorený reťazcom aminokyselín, ktorý je možné vyjadriť vzorcom (I). Tento aminokyselinový reťazec je kódovaný reťazcom DNA, sekvenciu ktorého je možné vyjadriť vzorcom (II). Uvedený aktivátor je hlavnou zložkou farmaceutického prostriedku na rozpúšťanie krvných zrazenín.

Text

Pozerať všetko

Vynález sa týka tkanivového derivátu plazminogénu t-PA, reťazca DNA, ktorý je kódom pre tento nový derivát,plazmidov na expresíu, ktoré obsahujú uvedený reťazec DNA, spôsobu výmoby týchto plazmidov, spôsobu výroby uvedeného derivátu a prostriedkov na rozpúšťanie krvných zrazenín, ktoré obsahujú uvedený derívát.Vytekajúca krv obsahuje ako hlavnú zložku bielkovinovej matríce polymémy fibrín. F ibrín je za fyzíologíckých podmienok rozpúšťaný fibrinolytickým systémom v reakčnej kaskáde, ktorej činnosť prebieha pri zrážani krvi. Centrálnou reakciou je aktivácia plazminogénu na plazmín,ktorá je ovplyvňovaná napríklad tkanivovým aktivátorom plazminogćnu t-PA (tissue type plasminogen activator). Plazmín rozpúšťa fibrín, ktorý je hlavnou zložkou bielkovínovej matríce pri zrážaní krvi. Enzymatická účinnosť prirodzeného t-PA alebo rovnakej látky, získanej z eukaryotických organizmov genetickou technológiou, najmä katalytická aktivácia plazminogénu na plazmín je V neprítomnosti fibrínu alebo štiepnych produktov fibrinogěnu veľmi malá, v prítomnosti týchto bielkovín však môže byť podstatne zvýšená a to aj viac než desaťkrát.Tkanívový aktivátor plazmínogěnu t-PA je štiepený v krvi prítomnými proteázami na dva reťazce, reťazec A a reťazec B. Oba tieto reťazce zostávajú spojene cystelnovýrn mostíkom. Stimulovateľnosť účinnosti t-PA znamená veľkú výhodu oproti iným aktivátorom plazminogćnu, ako je napríklad urokináza alebo streptokináza, ako bolo opísane napríklad v publikáciách M. Hoylaerst a ďalší, J. Biol. Chem. 257 (1982), 2912 až 29 | 9, W. Nieuwenhuizcn a ďalší, Biochem. Biophys. Acta, 755 (1983), 531 až 533.Mechanizmus účinku t-PA in vivo je opísaný napríklad v publikácii Korníger a Colle, Thromb. Hämostasis 46(1981), 561 až 565. Účinnosť enzýmu, zameraná na povrch fibrínu dovoľuje použiť túto látku ako prostriedok proti patologickým uzáverom ciev, napríklad pri srdcovom infarkte, ako už bolo dokázané klinickýmí pokusmi, opísanými v publikáciách Collen a ďalší, Circulation 70 (1984),1012, Circulation 73 (1986), 51 l.Nevýhodou použitia t-PA je zatiaľ rýchly pokles koncentrácie tejto látky v krvnej plazme (Clearance). V dôsledku toho je potrebné použiť pomerne veľké množstvo t-PA na to, aby bolo možné dosiahnuť in vivo účinné rozpúšťanie trombov. Pri vyšších dávkach však môže dôjsť k vedľajším účinkom, napríklad ku krvácaniu.V európskom patentovom spise č. 196 920 je opísaný prírodný produkt odbúravania t-PA, ktorý obsahuje ešte oblasti Kringel lI a oblasť proteazy, N-terminálne zakončeníe tohto produktu začína alanínom v polohe 160, reťazec aminokyselín je uvedený v publikácii Pennica a ďalší, Nature 301 (1983) 214 až 221.Clearance tohto produktu odbúravania nie je príliš odlišný od tej istej hodnoty pre prírodný t-PA. Až chemickou modifikáciou katalytíckej oblasti pripojením blokujúcej skupiny je možné dosiahnuť zlepšenie.Vynález si kladie za úlohu navrhnúť takú zmenu t-PA,aby vzniknutý derivát mal predĺžený polčas koncentrácie v krvnej plazme. Súčasne by mala byť uchovaná účinnosť pri rozpúšťaní trombov a stímulovateľnosť fibrínom.Predmetom vynalezu je teda tkanivový aktivátor plazminogénu t-PA, ktorý nie je glykolyzovaný a je tvorený nasledujúcim reťazcom aminokyselín(H) 1 SYQGHSIĽYF GNSÁTRIHH SLTĚDASCL PWNÉHILIG( WTLQNFSÄQ51 MŇIÄKFINYC RYIPIDDIKW CHVIXNERLT VÉICWFSIS TCGLRQYMP101 QFHIJCGOLFA DILŠÄYWM ITJIOWRSPG ERFĽJGJXLI SMWILSME15). otom-Fran LTVIIñMYR wmsnamcr Lvmvmąu rnnmxmm mzo Anmixsnss ncaąasswn rvcurtma Lrmmms armcmusr 251 mmxm vnmssmr samuuuvr DIMIDADIIIR sec-mmm301 .ADQGDNGPL YCLIIIXIIHTL WBIIEWIGC GQKWPOVYT KVTWILDIIR251 nmpričom na aminoterminálnorn konci (č. l S) môže byť reťazec ešte predĺžený pomocou M.Teraz bolo neočakávane zistené, že pri vypustení prebytočných, v nativnom t-PA sa nachádzajúcich oblastí, nedôjde k žiadnemu ovplyvneniu trombolytíckého účinku a stimulovateľnosť ñbrínu taktiež zostáva v podstate rovnaká. V deriváte podľa vynálezu však chýba väzba na fibrín,ale aj napriek tomu má derívát trombolytickú účinnosť in vivo ešte o niečo vyššiu, než je účinnosť natívneho t-PA. Rovnako prekvapujúca je skutočnosť, že pri podaní trombolytícky účinného množstva tohto derivátu zostáva systemieká íibrinolýza takmer neovplyvnená. Ukázalo sa teda,že derivát t-PA podľa vynálezu má za fyziologických podmienok typické vlastnosti natívneho t-PA, pokiaľ ide o špecificitu vzhľadom na fibrín. Tieto výsledky boli získané pri farmakologíckom sledovaní tohto derivátu, ako bude ďalej uvedené v príklade 6. Okrem toho má bielkovinový derivát podľa vynálezu veľmi vysokú špecifickú účinnosť, boli opísanć špecifické účinnosti od 500 až do 800 kjednotiek/mg.Predmetom vymálezu je tiež reťazec DNA, ktorý je kódom pre derivát t-PA a ktorý je možne vyjadriť ako nasledujúci reťazecL nmmecummcmmmecncmamurammcccamwmmącn a so cmmccmmcewmrmumccmxmeoumaurzcułoumanąnąc 10 izi AAGOHTACACÄGCÁĽÄBMDCDCAHGWCABOCAĽTGOGCCNGGCMACAIMHAĽ rec im -recoecnzecmummimccuncccmmcAeortcmuouccncmacm 24 a zu ACBEOGAĽVINCWIGHGTGCĽCNCIGCICCACCTCCGGCCIGADJĽAMACAMCM ou m ecrummscucumusoocrmrcaccmuceacncccwcccmmmu so m OCEANHNCCAACCACADMUGICLICCCMAGAMMHCĽIGNCWWGCÄTLCIC na A 21 ATCÄOCICCTOCTOGAHCTUTĚÍCOĚŇCCÄĽÍĚCTXCCÄMÄDÄĚHĚOCGCCCCM m m cmcmmnwmncmaoucmnmwmoeemwmceroammmemanm 940 m X 1 TMJEZICGAAAAATACAHGĽCCATMGGMTKDAIGANAUMIAĽGMMNAC sou m AITGCGCNCTGCAMTGAMICGGAITCWCCĽOHMOCOCJGDMAMAMGEGN sw m cmmmmammcaocccmmmmmcoaurwicanmmmmm 12 a m NCWCIAGGGCMMAIGADGCCHMCTUCTITCHHBOGABCMCMAAMAMH 180 Im cnvrcnuumrmccnccAacuocmcAcAmcu/umnnucmucmc me mi Accentucuacmmucmmmcmmmancomoocuaucnmrmcm 900 901 moccrucemoucuammamcccuccmmwxcmnemwcccnumr eso § 51 namemcmmmrmeąccmmwmąammuammcceoąammw moReťazec DNA tak, ako bol uvedený, je možne použiť na expresiu derivátu t-PA podľa vynálezu V prípade, že sa uloží do plazmidu na expresiu. Tento plazmid na expresiu predstavuje ďalší predmet vynálezu, rovnako ako plazmid na expresiu, ktorý má o niečo odlišný reťazec DNA, ktorý však je tiež kódom pre derívát t-PA podľa vynálezu. Na základe degenerácie genetického kódu sú na tento účel vhod né aj reťazce, ktore sú trocha odlišné od uvedeného reťazca DNA.Plazmid na expresiu výhodne obsahuje okrem reťazca,ktorý je kódom pre derivát t-PA ešte regulovateľný promótor, napríklad tac, účinný terminator, napríklad fd, značiacu oblasť, umožňujúcu selekciu, napríklad gén pre B-laktamázu a počiatok replikácie.Ďalším predmetom vynálezu je plazmid pA 27.3. Získanie tohto plazmidu je opísane v príklade 1, plazmid obsahuje reťazec DNA, ktorý je kódom pre derivát t-PA podľa vynálezu.Predmetom vynálezu je tiež spôsob výroby plazmidu na expresiu, ktorý obsahuje reťazec DNA, ktorý je kódom pre bielkovinu t-PA podľa vynálezu alebo jej derivát, ktorý obsahuje okrem oblasti Kringel ll a oblasti na proteázu ešte ďalšiu bielkovinu t-PA, spôsob spočíva v tom, že sa uvedený reťazec vnesie do plazmidu a riadenou mutagenézou sa odstránia tie oblasti, ktoré sú kódom pre aminokyseliny,ktoré sa v deriváte t-PA podľa vynálezu nachádzajú.Voľba plazmidu, do ktorého má byť zaradený reťazec DNA, ktorý je kódom pre derivát t-PA podľa vynálezu závislý od cieľových buniek, ktoré majú byť neskoršie použité na expresiu tohto derívátu. Vhodné plazmidy a minimálne požiadavky kladené na tieto plazmidy, napríklad počiatok replikácie alebo miesto pôsobenia reštrikčných enzýmov sú odborníkom známe. V rámci vynálezu je možné namiesto plazmidu použiť aj Cosmid, t. j. replikativnu formu fágu (lambda, M 13) s dvojitým reťazcom a ďalšie, odborníkom známe vektory. Postup na riadenú mutagenézu bol opísaný v publikácii Morinaga a ďalší, Biotechnology,21, (1984), 634 a pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu bol uskutočňovaný podľa tejto publikácie.Predmetom vynálezu je tiež spôsob výroby derivátu t-PA podľa vynálezu tak, že sa dosiahne expresia plazmidu podľa vynálezu vo vhodnej bunke a výsledný produkt sa izoluje zo živného prostredia, prípadne po rozrušení uvedených buniek. Na výrobu derivátu t-PA podľa vynálezu sa výhodne používajú bunky prokaryotických organizmov. Je zvlášť výhodné, najskôr z rozpustných častí bunky izolovať takzvané inkluzivne telieska (nerozpustnć agregáty bielkovín), tieto inkluzívne telieska, ktoré obsahujú t-PA sa solubilízujú pôsobením guanínhydroehloridu za redukčných podmienok, potom sa vytvorí derivát naviazaním GSSG a potom sa derivát t-PA renaturuje pridaním L-arginínu a GSH. Presný návod na aktiváciu t-PA z inkluzívnych teliesok je uvedený napríklad v európskych patentových spisoch č. 219 874 a 241 022. le však možne použiť aj inć postupy na získanie účinných bielkovín z inkluzivnych teliesok.Pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu na čistenie K 2 P sa postup uskutočňuje výhodne za prítomnosti L-argininu zvlášť v koncentrácii 10 až 1000 mmol/l.Výhodným spôsobom sa oddelenie cudzorodej bielkoviny uskutočňuje afinitnou ehromatograñou na stĺpci s použitím ETI (Eritrina Trypsin Inhibitor). ETI sa fixuje na nosič, napriklad Sepharosu. Čistenie s použitím stĺpca s ETI má tú výhodu, že na stĺpec s týmto materiálom je možne priamo naniesť koncentrovanú vzorku, určenú na renaturáciu v prítomnosti vysokých koncentrácii argininu, napriklad 0,8 mol/l. Zhlukovanie K 2 P, ktoré je možné uskutočňovať pri nízkych koncentráciách arginínu pod 10 mmol/1, teda nie je potrebne uskutočniť. Zvlášť výhodne je čistenie KZP stlpcom s obsahom ETI za prítomnosti 0,6 až 0,8 mol/l arginínu. Roztok s obsahom KZP má výhodne pH vyššie než 7, zvlášť 7,5 až 8,6.Vymývanie stĺpca s obsahom ETI sa uskutočňuje pri znížení pH, a to tak v prítomnosti, ako aj v neprítomnosti argininu za podmienok, umožňujúcich dobrú rozpustnosťKZP. Výhodne sa pri elúcii pH nachádza v kyslej oblasti,zvlášť v rozmedzí 3 až 5,5.K 2 P získaný spôsobom podľa vynálezu má špecifickú účinnosť t-PA v rozmedzí 550 000 i 200 000 jednotiek/mg pri čistote vyššej než 95 .Podľa vynálezu je možné získať aj derivát t-PA, ktorý má podstatne predĺžený polčas v plazma, vzhľadom na to,že je možné dosiahnuť zníženie clearance. Derivát podľa vynálezu pritom nestráca žiadnu zo svojich vlastností,vhodných najeho použitie k trombolýze. Je teda vhodný na podávanie ľuďom aj vzhľadom na to, že sa pri jeho použití nevyskytujú žiadne vedľajšie účinky, ako je lovácanie, ku ktorému dochádza pri použití pomeme vysokých dávok natívneho t-PA.Derivát t-PA podľa vynálezu má takú účinnosť, že stačí použiť štvrtinu množstva t-PA, ktoré by bolo potrebné použiť na dosiahnutie toho istého účinku.Vynález bude podrobnejšie opísaný v súvislostí s priloženými výkresmi.Prehľad obrázkov na výkresochNa obr. 1 je schematicky znázomená výroba plazmidu pA 27.3.Na obr. 2 je znázornená porovnanie väzby ñbrínu na derivát t-PA podľa vynálezu (krivka 1) s väzbou fibrínu na nativny t-PA, ktorého expresia bola dosiahnutá v bunkách CHO (tct-PA/CHO) t-PA s dvojitým reťazcom z buniek CHO, rozštiepený na fyziologickom štiepnom mieste Arg 275-lle 276, krivka 2 sct-PA/CHO t-PA s jednoduchýn reťazcom z buniek CHO, krivka 3.Na obrázku 3 a 4 je znázornený diagram farmakokínetickej účinnosti t-PA pre derivát t-PA podľa vynálezu v porovnaní s bežne dodávaným prostriedkom s obsahom t-PA(ActilyseR) na krivke 1 je hodnota pre KZP v dávke 200 000 jednotiek, 0,25 mg/kg vnútrožilovo, štyri pokusy na zvieratách. Na krivke 2 je výsledok pre prostriedok Actilyse v dávke 200 000 jednotiek/kg vnútrožilovo, šesť pokusných zvierat.Na obr. 5 je znázomená závislosť trombolýzy od dávky pre derivát t-PA podľa vynálezu a pre Actilyse. Je uvedená stredná hodnota plus štandardná odchýlka, jedna kilojednotka približne 1000 medzinárodných jednotiek. Na krivke 1 je výsledok pre K 213, na krivke 2 je výsledok pre prostriedok ActilyseR.Vynález bude vysvetlený nasledujúcimi prikladmi.Príklad 1 Konštrukcia plazmidu pA 27.3Východiskový plazmid pREM 7685, opísaný v európskom patentovom spise č. 242 836 má nasledujúce zložky tac-promótor, lac-operátorovú oblasť s kodónom ATG pre začiatok, kódovú oblasť pre derivát t-PA FK 2 P, terminator transkripcie z pKK 223-3, gén pre B-laktamázu, gén pre odolnosť proti kanamycínu a počiatok plazmidu pACYC 177, ide o plazmid, ktorý sa nachádm v bunke v malom počte kópií. Reťazec derivátu t-PA FK 2 P sa skladá z nukleotidov 190 až 336 (oblasť F), 715 až 1809 (oblasť K 2, proteáza, malý podiel 3 UT) a kodón ATG na začiatok. Polohy nukleotidov sú uvádzané podľa publikácie Pennica a ďalší, Nature 301 (1983) 214 až 221.Na vypustenie oblasti F z konštrukcie FKZP plazmidu pREM 7685 bol použitý v podstate postup podľa publikácie Morinaga a ďalší, Biotechnology 21 (1984), 634. Na tvorbu heteroduplexného útvaru boli z pREM 7685 izolované dva fragmenty. Fragment A pREM 7685 bol rozštiepený reštrikčným enzýmom ECoRI. Štiepne produkty boli oddelene elektroforćzou na géli a najväčší fragment EcoRl bol izolovaný. Fragment B plazmid pREM 7685 bol linearizovaný reštrikčným enzýmom Xhol. Linearizovaný plazmid bol po elektroforéze na géli získaný s vysokou čistotou. Na mutagenćzu bol synteticky vyrobený nasledujúci oligonukleotid5 TG TCT TAC CAA GGA AAC AGT GA 3Na tvorbu heteroduplexu sa zmieša fragment A, fragment B vždy v množstve 450 fmol a oligonukleotid v množstve 75 pmol a zmes sa inkubuje za prítomnosti 50 mmol/l chloridu sodnćho, 10 mmol/l tris-HCl s pH 7 a 10 mmol/l síranu horečnatého 3 minúty pri teplote 100 °C,potom sa zmes rýchlo prenesie do ľadu. Renaturácia DNA sa uskutočňuje 30 minút pri teplote 60 °C. Na syntézu sa k heteroduplexu pridajú ešte nasledujúce zložkyDesoxynukleotrifosfáty v množstve vždy 0,25 mmol/l,ATP l mmol/l, chlorid sodný 100 mmol/l, tris-HCl s pH 7,5 6,5 mmol/l chlorid horečnatý 8 mmol/l, B-merkaptoetanol 1 mmol/l, Klenowov íłagment DNA-polymerázy z E. coli 0,125 jednotiek/l vzorky a T 4-ligáza v množstve 0,1 jednotky/l vzorky. Syntéza sa uskutočňuje 4 hodiny pri teplote 16 °C. Potom sa zmes použije na transformáciu buniek E. cali (RM 82, DSM 3689) pri použití lac Il-plazmidu a potom sa transfomianty podrobia selekcii pridaním 25 g/ml kanamycínu k živnćmu prostrediu.Hybridizáciou kolónii pri použití opísanej mutagenézy s použitím oligonukleotidu ako sondy, bolo možne izolovať tie klony, ktoré obsahovali plazmid pA 27.3. Tento plazmid sa odlišuje od východiskového plazmidu pREM 7685 okrem iného tým, že chýbajú miesta pôsobenia enzýmu pstl a Sspl. Obe tieto miesta sa nachádzajú v oblasti F východiskového plazmidu. Konštrukcia plazmidu pA 27.3 je schematicky znázornená na obr. l.Príklad 2 Spôsob výroby účinného derivátu t-PA K 2 P z E. coli Rozrušenie buniek a príprava inkluzívnych teliesok (IB)1,6 kg vlhkej bunkovej hmoty E. roli DSM 3689,transformovaného plazmidom pA 27.3 sa uvedie do suspenzie v 10 litroch roztoku s obsahom 0,1 mol/l tris-HCl, 20 mmol/l EDTA pri pH 6,5 a teplote 4 °C. Potom sa pridá 2,5 g lyzozýmu a zmes sa inkubuje 30 minút pri teplote 4 °C. Potom sa dovŕši rozrušenie buniek pôsobením zvýšeného tlaku. K materiálu sa pridá ešte 5 litrov 0,1 mol/l tris-HCl,20 mmol/l EDTA, 6 Triton X 100 a 1,5 mol/l chloridu sodného pri pH 6,5, potom sa zmes inkubuje ešte 30 minút pri teplote 4 °C. Potom sa oddelí nerozpustný podiel tvorený ínkluzívnymi telieskami odstredením v Padbergovej odstredivke. Peleta sa uvedie do suspenzie V 10 litroch roztoku s obsahom 0,1 mol/l tris-HCl, 20 mmol/l EDTA s pH 6,5, inkubácia trvá 30 minút pri 4 °C, inkluzívne telieska sa potom izolujú odstredením.100 g inkluzívnych teliesok (Vlhká hmotnosť) sa uvedie do suspenzie v 450 ml roztoku s obsahom 0,1 mo/1 trisHCI, 6 mol/l guanidíniumhydrochloridu, 0,2 mol/l DTE, lmmol/l EDTA s pH 8,6 a potom sa zmes mieša dve a pol hodiny pri teplote 25 °C.Po nastavení pH na hodnotu 3 pridaním 25 kyseliny chlorovodíkovej sa uskutočňuje dialýza proti 10 mmol/l HCl, použije sa 3 x 50 litrov roztoku v čase 24 hodín pri teplote 4 °C.Ako predloha sa použije tuhý guanidiniumhydrochlorid, takže po konečnom zriedení uvedeného dialyzátu 10 mmol/l HCl je koncentrácia guanidíniumhydrochloridu 6 mol/l.Zmes sa vopred inkubuje 1,5 hodiny pri teplote 25 °C,potom sa pridá oxidovaný glutatión (GSSG) do koncentrácie 0,l mol/l a tris-HCl do 0,05 mol/l a pH sa upraví roztokom s obsahom 5 rnol/l hydroxidu sodného na hodnotu 9,3. Potom sa zmes mieša 3,5 hodiny pri teplote 25 °C.Po úprave pH na hodnotu 3 pridaním 25-nej kyseliny chlorovodíkovej sa uskutočňuje dialýza proti roztoku s obsahom 10 mmol/l kyseliny chlorovodíkovej, V priebehu 48 hodín sa použije 3 x 100 litrov roztoku pri teplote 4 °C. Po ukončení dialýzy sa materiál odstredí a číry supematant sa ďalej spracováva.Reakčná nádoba s objemom 10 litrov sa naplní roztokom s obsahom 0,1 mol/l tris-HCl, 0,8 mol/l L-arginínu, 2 mmol/l GSH, 1 mmol/l EDTA pri pH 8,5. Renaturácía sa uskutočňuje pri teplote 20 °C trojnásobným pridaním vždy 100 ml derívátu vo forme disulfidu v časovom odstupe 24 hodín. Po renaturácii sa získa materiál so špeciñckou účinnosťou 1500 až 10000 I.U. (medzinárodné jednotky)/mg, stanovenie bude uvedene v príklade 4 b. Jednotka b je jednotka účinnosti podľa definície WHO, National lnstítute of Biological Standards and Control.Koncentrácia renaturovanej zmesi Renaturačnú zmes je možné koncentrovať s použitím hemodialyzátora.1. Čistenie K 2 P z E coli afmitnou chromatografiou na stĺpci ETI-sacharózy po predchádzajúcej koncentráciiRenaturačná zmes bola zahustená pomocou hemodialyzátora (Asahí AM 300) v pomere 1 23 a zásobný roztok bol doplnený na 0,5 mol/l chloridu sodného. Tento materiál bol potom nanesený na stĺpec ETI-Sepharosy v rovnovážnom stave s 0,1 mal/l tris-HCl s pH 7,5 s 0,8 mol/l arginínu a 0,5 mol/l chloridu sodneho. Objem ekvilibračného roztoku bol 50 ml, objem vzorky bol 550 ml, t. j. IO-násobok objemu stĺpca/h, stĺpec bol premývaný ekvilibračným pufrom tak dlho, až absorpcia eluátu pri 280 nm bola tiež rovná hodnote pre pufer. Elúcia viazanćho materiálu bola potom uskutočnená pri použití 20 mmol/l kyseliny citrónovej s pH 3,2. Parametre postupu sú uvedené v nasledujúcej tabuľkeobjn účinnou CPNL sa m 1 ru/n 1 Ing/nl IU/mg koncantrút ssn 57 152 u 4 oaa Eľl-luút 90 330 ono 0.71 465 000i Špecifické účinnosť účinnosť pri chromogénnom teste(príklad 4 b) delená obsahom bielkoviny vo vzorke. Cpm koncentrácia bielkovínRenaturačná zmes bola zahustená podobným spôsobom ako v príklade 3.1.21). Na stĺpec s objemom 25 m 1 ET 1-Sepharose V rovnovážnom stave s roztokom s obsahom 0,1 mol/l tris-HCl s pH 7,5, 0,8 mol/l argininu a 0,5 mol/l chloridu sodného bolo nanesených 800 ml koncentrátu pri prietoku 12 objemov stĺpec/h a stĺpec bol potom premývaný ekvilibračným pufrom tak dlho, až sa extinkcia eluátu pri 280 nm rovnala hodnote pre pufer. Viazaný materiál bol potom vymývaný roztokom s obsahom 0,3 mol/l arginínu spH 4,5. Parametre postupu sú uvedené V nasledujúcej tabuľke objem úcinmst cha, SA m 1 IU/ul Ing/ul lU/mg komentar E 00 zo 000 11 , 3 1 170 ETI-luút 55 280 00 | 1 0.5 55 | 1 0002. Čistenie K 2 P z E. calí añnitnou chromatograñou na stĺpci ETI-sacharózy bez predchádzajúcej koncentrácieNa stĺpec ETl-Sepharosy, s objemom 10 ml, V rovnovážnom stave V 0,1 mol/l Iris-HC s pH 7,5, 0,8 mol/l arginínu a 0,5 mol/I chloridu sodneho sa nanesie 12 litrov zmesi a stĺpec sa tak dlho premýva ekvilibračným pufrom, až absorpcia eluátu má rovnakú hodnotu ako pufer. Elúcia Viazaneho materiálu sa potom uskutočňuje roztokom s obsahom 0,8 mol/l arginínu s pH 5. Parametre postupu sú uvedené v nasledujúcej tabuľkeobjem účinnosť Cprmł SAi) Stímulácia fibrínom účinnosť za prítomnosti fibrinu,delená účinnosťou bez fibrínu.Príklad 4 Charakterizácia čisteného KZP z E. cali- SDS-Page a vysokotlaková kvapalinová chromatografia v reverznej fázeHomogenita čisteného materiálu, získaného afmitnou chromatografiou na stĺpci ETI-Sepharose bola Sledovaná SDS-Page a vysokotlakovou kvapalinovou Chromatografiou v reverznej fáze (RP-HPLC). Z pomerne krátkej dráhy bolo možné vypočítať pre KZP z prokaryotických organizmov molekulovú hmotnosť 38 500 l 2 000 jednotiek. Denzitometricke Vyhodnotenie dokázalo čistotu vyššiu než 95RP-HPLC je založená na odlišnom pôsobení bielkovín a hydrofóbnej matrice. Postup sa využíva ako analytická metóda na dôkaz čistoty materiálu.Analýza čisteného KZP z E. coli bola uskutočnené s použitím stĺpca Nucleosil 300 (Knauer), s použitím gradientu kyseliny trifluóroctovej a acetonitrilu. Pufer A 1,2 ml kyseliny trifluóroctovej v 1000 ml vody. Pufer B 300 ml vody, 700 m 1 acetonitrilu, 1 ml kyseliny tritluóroctovej0 až 100 . Súhrnným výsledkom chromatografickej analýzy bola čistota produktu vyššia než 95 .N-terrninálny reťazec aminokyselín bol stanovený na analyzátore aminokyselín (ABI 470 Sequenator) so štandardným programom. Zistený reťazec Sl-Y 2-Q 3-G 4-N 5-S 6-D 7-C 8-Y 9 je celkom v súlade s očakavaným reťazcom,odvodeným od reťazca DNA.Stanovenie účinnosti K 2 P z E. cali in vitro bolo uskutočnené podľa návodu, uvedeného V publikácii Zeitschriñ für die gesamte innere Medizin (ZGIMAL) 42 (17) 478 až 486 (1987). Špecifické účinnosť bola 550 000 i 200 000 IU/mg. Stimulovateľnosť KZP z E. coli fragmentami BrCN fibrinogenu bola V tomto systéme vyššia než 25. Ide o účinnosť za prítomnosti fragmentu ñbrinogćnu, delenú účinnosťou V neprítomnosti týchto fragmentov.c) Väzba na fibrín in vitroVäzba KZP z E. coli na fibrín bola stanovená spôsobom podľa publikácie Higgíns D. L. a Vehar G. A, (1987), Biochem, 26, 7786 až 7791.Z obr. 2 je zrejmé, že KZP z E. colí na rozdiel od t-PA z CHO alebo t-PA z E. coli neviaže do väčšej miery ñbrín.Na zvýšenie výťažku extrakcie bol kódový reťazec pre KZP preklonovaný vo vyššom počte kópií. Na tento účel bol použitý plazmid pePa 126.|, opísaný v NSR patentovom spise č. 3 838 378. Tento plazmid je tvorený v podstate vektorom pKK 223-3 a kódovým reťazcom pre t-PA,ako boli opísané V európskom patentovom spise č. 242 835.Do tohto plazmidu bol najskôr integrovaný reťazec fd-terminátora. Na tento účel bol plazmid pePa 126.1 linearizovaný reštrikčným enzýmom Hind III. Takto rozštiepený plazmid bol podrobený na géli a získaný s preparatívnou čistotou. Plazmid pLBUl, opísaný V publikáciách Beck a ďalší, (1978), Nucl. Acids. Res., 5, 4495 až 4503, Gebtz a ďalší, (1981) PNAS 78 (8)4963, bol rozštiepený pôsobením enzýmu Hind III a elektroforézou na géli s následnou elúcíou bol s preparatívnou čistotou získaný fragment s veľkosťou 360 bp s obsahom fd-terminátora. Potom boli naviazanć plazmid pePa 126.1 a fragment z plazmidu pLBUl po štiepeni enzýmom Hind Ill s veľkosťou 360 bp. Zmes, v ktorej bola uskutočnené väzba bola kotransfonnovaná plazmidom pUBS 500 V E. colí DSM 2102. Plazmid bol opísaný v NSR patentovom spise č. 3 838 378. Zo získaných klonov boli izolované klony, obsahujúce požadoVaný plazmid pePa 126 fd, líšiaci sa od východiskovćho plazmidu pePa 126.1 druhým miestom pôsobenia reštrikčného enzýmu Hind III.Z plazmidu pePa 126 fd boli získané dva fragmenty. Jeden s veľkosťou 3,4 kb po štiepeni enzýmami BamHI/Pvul a druhý s veľkosťou 1,3 kb po štiepeni PvuI/Xmal. Oba tieto fragmenty boli viazané s fragmentom s veľkosťou 1,3 kb po štiepeni enzýmami BamHI/Xmal z plazmidu pA 27.3 a použité s plazmidom pUBS 500 na transformáciu E. coli. Výsledný plazmid bol označený pA 27 fd a od plazmidu pePa 126 fd sa líši tým, že obsahuje druhý najmenší fragment EcoRI z pePa fd s veľkosťou 610 hp, ktorý je v plazmide pA 27 fd skrátený o približne 515 bp.

MPK / Značky

MPK: A61K 38/49, C12N 9/64, C12N 15/58

Značky: výroby, aktivátor, t-pa, farmaceutický, spôsob, plazminogénu, tkanivový, prostriedok, obsahom

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/13-279029-tkanivovy-aktivator-plazminogenu-t-pa-sposob-jeho-vyroby-a-farmaceuticky-prostriedok-s-jeho-obsahom.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Tkanivový aktivátor plazminogénu t-PA, spôsob jeho výroby a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom</a>

Podobne patenty