Adenovirálne vektory exprimujúce jednoreťazcový interleukín-12 a 4-1BB ligand

Číslo patentu: E 15765

Dátum: 10.10.2003

Autori: Wähler Reinhard, Schnieders Frank

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 Súčasný vynález sa týka adenovírusových vektorov, ktoré obsahujú nukleotidové sekvencie, ktoré kódujú jednoreťazcový interleukín (IL)-l 2 (jednoreťazcový lL-l 2, single chain IL-l 2 alebo sc 1 L-12) a kostimulačný proteín 4-lBB, rovnako ako použitie týchto vektorov pre génovú terapiu, najmä na terapiu nádorov.0002 Rakovinové ochorenia stále predstavujú jednu znajčastejších príčin úmrtia ľudí v priemyselných krajinách. Hepatocelulárny karcinóm (HCC) je napríklad rakovinové ochorenie so strednou dobou prežitia 6 mesiacov pri diagnóze jedného alebo viacerých väčších nádorov (Llovet J.M. et al., Hepoatology, 1999, 2962-67). V súčasnosti používané terapeutické zásahy, ktoré zahmujú rádiofrekvenčnú abláciu, chemoterapiu a perkutánne injekcie etanolu (PEI), vykazujú síce u malých nádorov určite úspechy, ale pri použití proti veľkým nádorom sa ukazujú ako nedostatočné.0003 Na základe súčasného stavu poznania bolo preto navrhnuté liečiť HCC pomocou génovej terapie. Génovo terapeutické postupy liečenia sú založené na podávaní nukleovej kyseliny, ktorá je obvykle prijímaná nádorovými bunkami a vykazuje sekvenciu, ktorá bunku nádoru zničí. Pritom bolo vyvinutých mnoho alternatívnych stratégii, ktorými môžu prenášané nukleotidové sekvencie ovplyvniť zničenie nádorových buniek. Prehľad zodpovedajúcich stratégii na liečenie HCC uvádzajú Ruiz et al., (Dig. Dis. 2001, 19 324332). Vtomto patente sú nukleové kyseliny, ktoré sú v súčasnosti v klinických testoch naošetrenie HCC u človeka, podľa stratégie liečenia priradené kjednej z nasledujúcich 4 skupín(l) Prenos supresorového génu nádoruTato stratégia spočíva v tom, že nukleová kyselina použitá na génovú terapiu obsahuje gén, ktorého génový produkt inhibuje rast nádoru alebo v rakovinovej bunke indukujeapoptózu. Väčšina klinických testov spočíva v prenose génu p 53.(2) Imunitná génová terapia Táto stratégia spočíva vtom, že nukleová kyselina použitá na génovú terapiu obsahujesekvencie, ktorých génový produkt aktivuje imunitný systém pacienta a vyvoláimunitnú reakciu namierenú proti rakovinovým bunkám. Imunitná reakcia sama potomvedie k zničeniu nádoru. Početné cytokíny, kostimulačné molekuly a nádorovošpeciñcké molekuly boli navrhnuté pre imunoterapiu.Pri tomto postupe kóduje nukleová kyselina použitá pre génovú terapiu génový produkt, napr. nejaký enzým, ktorý nejakú netoxickú účinnú látku premení na látkucytotoxickú pre nádorové bunky.Pre túto formu génovej terapie sa používajú Vektory nukleových kyselín, založené na vírusových sekvenciách. Vektory s onkolytickými vírusovými sekvenciami majú nádorovo špecifický promótor, ktorý ovláda replikáciu vírusu tak, že je možnédosiahnuť selektívny rast vírusu v nádorových bunkách.0004 U imunogénnej terapie zodpovedajúcej predloženému vynálezu (tiež označovanej akoimunoterapia) sú podávané nukleové kyseliny, ktoré zahmujú sekvencie aktivujúce imunitnýu systém a nasmerujú ho proti nádoru. V zásade rozpoznáva imunitný systém vedľa antigénu ajnádorovo špecifické štruktúry na nádorových bunkách. Aktivácia imunitného systému môže teda viesť k zničeniu nádoru súčasťou imunitného systému.0005 W 0 00/41508 opisuje kombinovanú terapiu rakoviny aktiváciou kostimulačných molekúl imunitných buniek pomocou dvoch adenovírusových vektorov, ktoré kódujú bud dve rôzne podjednotky L-12 alebo ligand pre 4-1 BB.0006 Podľa súčasného stavu poznania sú známe početné molekuly, najmä cytokíny, ktoré stimulujú imunitný systém, alebo modulujú imunitnú reakciu. Už od začiatku sa zistilo, že cytokíny vykazujú aj protinádorové aktivity. Napríklad bolo opísané, že lL-l 2 je stimulátor bunkovej imunity a vykazuje silnú protinádorovú aktivitu (Brunda et al, J. Exp. Med. 1993,178112234230). Podávanie samotného rekombínantného lL-l 2 proteínu ako protinádorového prostriedku stroskotalo ale na tom, že cytokín v terapeutickom dávkovaní vykazuje toxické vedľajšie účinky (Lotze et al., Ann.N.Y.Acad.Sci., 1997, 795440-454 a Cohen J. Science, 1995, 2702908).0007 Bolo preto navrhnuté, vniesť do nádoru cytokín kódujúcí nukleovú kyselinu a tým umožniť lokálnu aktiváciu imunitného systému. Hock et al. (Proc. Natl. Acad.Sci. USA,1993, 902774-2778) opísali napríklad transfer interleukínu-2 (IL-2), interleukínu-4 (IL-4),interleukínu-7 (lL-7), TNF alebo FN-y génov do nádorových línii a použitie nádorových línií na indukciu nádorov u zvierat. Všetky transgénne nádorové línie vytvorili obrannú reakciu proti nádorovým bunkám, pričom v závislosti na použitom cytokíne sa na obrannej reakcii podieľali rôzne bunky imunitného systému pokusných zvierat (CD 4, CD 8, CD 3).0008 Tiež vektory kódujúce 1 L-l 2 boli testované na vhodnosť pre imunoterapiu. IL-12 označovaný ak ako CMLF (cytotoxic lymphocyte maturation factor cytotoxícký maturačný faktor lymfocytov) alebo NKSF (natural killer cell stimulatory factor prirodzený stimulačný faktor NK buniek) je heterodimémym cytokínom, ktorý je prirodzene vytváraný periférnymi B-lymfocytmi po aktivácii. Protein sa skladá z dvoch podjednotiek s relatívnou molekulovou hmotnosťou 40 a 35 kDa, ktoré sú navzájom spojené disulñdovými mostikmi. Disulfidove mostíky sú pre biologickú funkciu nevyhnutné. Ako už rôzne názvy naznačujú, stimuluje proteín proliferáciu aktivovaných ľudských lymfoblastov a aktivuje NK bunky.0009 V Pützer et al. bol interleukín-12 a B 7-l exprimovaný v nádorových bunkách pomocou adenovírusového vektora. V Carrol et al. boli pre expresiu B 7-l a interleukínu-l 2 použité vaccinia vírusy.0010 Vektory, kódujúce rôzne podjednotky tohto proteínu, boli použité na liečenie nádorov(Barajas et al., Hepatology, 2001, 3352-61 Mazzolini et al., Cancer Gene Therapy, 1999,65 l 4-522). Ďalej boli tieto vektory použité na liečenie nádoru v kombinácii s inými sekvenciami pre imunoterapeutiká, najmä vkombinácii so sekvenciami pre kostimulačný proteín, ktoré boli v tomto alebo inom vektore prítomné (Gyorffy et al., J .Immunology, 2001,16626212-6217 Martinet et al., Gene Therapy, 2002, 91786-792 Martinet et al., Joumal of National Cancer Institute, 2000, 922931-936 Guinn et al., J. Immunology, 1999, 162250035010 a Emtage et al., J. lmmunology, 1998, l 60253 l-2538).0011 Anderson et al. používajú adeno-asociované vírusy, ktoré v bunkách exprimujú špecifický fúzny interleukín-l 2 proteín.0012 1 L-12 bol ďalej už exprimovaný ako jednoreťazcový-lL-IZ s dobrou aktivitou, teda ako proteín, u ktorého boli jeho podjednotky spojené do jedného fúzneho proteínu (Líeschke et al., Nature Biotechnology, 1997, 1535-40). Vjednom ďalšom terapeutickom postupe bolo navrhnuté, odobrať pacientovi nádorové bunky a tieto in vitro liečiť plazmidom, ktorý kóduje jednoreťazcový-lL-IZ alebo lL-l 2 a kostimulátor (US 2002/00 l 8767). Po tomto in vitroliečení majú byť nádorové bunky reímplantované. Postup teda obsahuje viaceré zásahy na.4 pacientovi a reimplantáciu nádorových buniek do pacienta, čo by mohlo mnoho pacientov od zodpovedajúceho liečenia odradiť.0013 Žiadna doposial používaná nukleová kyselina sa dosiaľ nepresadila na liečenie cicavcov, výhodne na liečenie človeka. Hoci napríklad v patente Ruiz et al. (pozri vyššie) opísaný postup vychádza z veľmi vysokého dávkovania pre terapiu použitého vektora (3 × 1092,5 ×l 03 plaque forming units -jednotiek tvoriacich plaky, PFU, na dávku), bolo zistené zodpovedajúcimi klinickými testami, že neboli získané žiadne alebo len negatívne výsledky. Práve dávkovanie nukleových kyselín je ale pre génovú terapiu kritickým faktorom, pretože pri vysokých dávkach je možné očakávať vedľajšie účinky alebo uvolnenie vektora únikom vektora z nádoru.0014 Základom súčasného patentu teda bola úloha, pripraviť vektory, ktoré by mohli byť s väčšou účinnosťou použité v génovej terapii.0015 Táto úloha bola prekvapujúco vyriešená pomocou vírusových vektorov, ktoré obsahujú sekvencie nukleových kyselín, kódujúce jednotlivé reťazce IL-l 2 a kostimulačný proteín 4-lBB, pričom vektorom je adenovírusový vektor.0016 Podľa vynálezu bolo teda prekvapujúco zistené, že vektory kódujúce jednoreťazcovýlL-l 2 a kostimulačný proteín 4-lBB, sú zvlášť vhodné na liečenie nádorov v rámci imunoterapie. lmunoterapiou je eliminovaný nielen primámy nádor, ale tiež metastázy. Synergické pôsobenie proteínov kódovaných konštruktami podľa tohto vynálezu pri imunostimulácii umožňuje nasadenie nukleových kyselín v menších dávkach, než bolo navrhované podľa súčasných poznatkov. Znížené dávkovanie vykazuje menšie vedľajšie účinky, ako je menšie riziko autoimunitného ochorenia pacienta a zároveň zlepšenú bezpečnosť pri klinickom nasadení. Pravdepodobnosť rozšírenia vírusu je menšia než u známych vektorov. Znížené dávkovanie umožňuje ďalej súčasne liečiť väčšie množstvo nádorov alebo viac ložísk nádorov, bez vyvolania vedľajších účinkov.0017 Použitie génu pre jednoreťazcový-IL-12 šetrí v porovnaní s použitím génov kódujúcich obe podjednotky lL-12 priestor vo vektore na expresiu nukleových kyselín. Táto sekvencia teda umožňuje použitie relatívne malých vektorov, ako napríklad adenovírusových vektorov, v ktorých napriek tomu sú dva alebo viac cudzích génov, ktore imunoterapiu zosilňujú, vedľa génu prejednoreťazcový-lL-l 2.0018 Vektory podľa tohto vynálezu sú určené na liečenie cicavcov, najmä na liečenie človeka. Nasledujúce odkazy na určité sekvencie génov sa teda výhodne vzťahujú na ľudské sekvencie. Génové sekvencie môžu byť odvodené tiež od iných druhov, alebo vrámciudávaných oblastí homológií (ktoré pre predloženú prihlášku sú získané pomocou BLAST

MPK / Značky

MPK: C07K 14/705, A61K 38/20, C12N 15/861, A61K 38/17, A61K 48/00, C07K 14/54

Značky: 4-1bb, exprimujúce, adenovirálne, interleukín-12, jednoreťazcový, vektory, ligand

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/125-e15765-adenoviralne-vektory-exprimujuce-jednoretazcovy-interleukin-12-a-4-1bb-ligand.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Adenovirálne vektory exprimujúce jednoreťazcový interleukín-12 a 4-1BB ligand</a>

Podobne patenty