Spôsoby a prostriedky na účinné preskakovanie exónu 45 v pre-mRNA pacienta s Duchennovou svalovou dystrofiou

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 Tento vynález sa týka oblasti genetiky, špecifickejšíe ľudskej genetiky. Tento vynález sa predovšetkým týka modulovania zostrihu pre-mRNA ľudského génu súvisiaceho s Duchenno vou svalovou dystrofiou. Doterajší stav techniky0002 Myopatie sú poruchy, ktoré majú za následok funkčné poškodenie svalov. Svalová dystrofia (muscular dystrophy, MD) sa vzťahuje na genetické ochorenia, ktoré sú charakterizované progresívnou slabosťou a degeneráciou kostrového svalstva. Duchennova svalová dystrofia(Duchenne muscular dystrophy, DMD) a Beckerova svalová dystroña (Becker muscular dystrophy, BMD) sú najobvyklejšími detskými formami svalovej dystroñe. Sú to recesívne ochorenia, a pretože gén zodpovedný za DMD a BMD je umiestnený na chromozóme X, mutácie vňom ovplyvňujú najmä mužov s výskytom približne u 1 z 3500 chlapcov.0003 DMD a BMD sú spôsobené genetickými defektmi V DMD géne kódujúcom dystrofin,čo je svalový proteín, ktorý sa vyžaduje na interakcie medzi cytoskeletom a extracelulárnou matricou, aby sa zachovala stabilita svalového vlákna V priebehu kontrakcie. DMD je závažné, smrteľné nervovo-svalové ochorenie, ktoré má za následok závislosť na podpore invalidným vozíkom pred dosiahnutim veku 12 rokov a DMD pacienti často Lunierajú pred dosiahnutim veku tridsiatich rokov kvôli zlyhaniu pľúc alebo srdca. Na rozdiel od toho BMD pacienti často zostávajú ambulantnými až do neskoršieho obdobia v živote a majú takmer normálnu očakávanú dĺžku života. DMD mutácie V DMD géne sú charakterizované posunutím inzercií alebo delécií v čítacom rámci alebo nezmyselnými bodovými mutáciami, čo má za následok absenciu funkčného dystrofínu. BMD mutácie vo všeobecnosti zachovávajú čítací rámec intaktný, čo umožňuje syn tézu čiastočne funkčného dystrofínu.0004 V priebehu posledného desaťročia bola Objavená špecifická modiñkácia zostrihu na obnovenie porušeného čítacieho rámca DMD transkriptu ako sľubná terapia pre Duchennovu svalovú dystrofiu (DMD) (van Ommen, van Deutekom, Aartsma-Rus, Curr. Opin. Mol. Ther. 2008 10 (2) 140-9, Yokota, Duddy, Partidge, Acta Myol. 2007 26 (3) 179-84, van Deutekom et al.,N. Engl. J. Med. 2007 357 (26) 2677-86).0005 Použitím antisense oligonukleotidov (antisense oligonucleotides, AON) interferujúcich so zostrihovými signálmi môže byť indukovane preskakovanie (skipping) špecifických exónov v DMD pre-mRNA, čím dochádza k obnoveniu otvoreného čítacieho rámca a k premene závažného DMD fenotypu na miernejší BMD fenotyp (van Deutekom et al., Hum. M 01. Genet. 2001 10 1547-54 Aartsma-Rus et al., Hum. Mol. Genet. 2003 12 (8) 907-14.). Preskakovanie exónov prostredníctvom interferencie s miestami exónového zostrihového zosilňovača (ex 0 nic splicer enhancer ESE) DMD génu sa opísalo vo W 0 2007/ 135105 A 1. Sekvencia zostrihového zosilňovača pre exón 45 DMD génu sa identifikovala V EP 1 191 098, pričom sa zdá, že cielenie na toto miesto má za následok preskakovanie exónu 45 V malom génovom konštrukte. Nedávno sa vo W 0 2010/048586 opísalo niekoľko antisense oligonukleotidov cieliacich na exón 45. In vivo overenie konceptu sa najskôr dosiahlo na mdx myšom modeli, ktorý je závislý od dystrofínu kvôli nezmyselnej mutácii V exóne 23. Intramuskuláme a intravenózne injekcie AON cieliacich na mutovaný exón 23 obnovili expresiu dystrofínu počas aspoň troch mesiacov (Lu et al., Nat. Med. 2003 8 1009-14 Lu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005 102 (l) 198-203). Toto bolo sprevádzané obnovením proteínov spojených s dystrofínom (dystrophin-associated proteins,DAP) v membráne svalového vlákna, rovnako ako funkčným zlepšením ošetreného svalu. In vivo preskakovanie ľudských exónov sa dosiahlo aj na hDMD myšom modeli, ktorý obsahuje úpl nú kópiu ľudského DMD génu integrovaného do chromozómu 5 tejto myši (Bremmer-Bout et al., Molecular Therapy 2004 10 232-40 °t Hoen et al., J. Biol. Chem. 2008 283 5899-907).0006 Pretože väčšina DMD pacientov má delécie, ktoré sa hromadia V horúcich oblastiach(hotspot regions), preskakovanie malého počtu exónov je použiteľné pre relatívne veľký počet pacientov. Skutočná použiteľnosť preskakovania exónov sa môže stanoviť pre delécie, duplikácie a bodové mutácie publikované v databázach DMD mutácie, ako je Leiden DMD mutation database dostupná na adrese www.dmd.n 1. Terapeutické preskakovanie exónu 45 V DMD pre-mRNA obnoví otvorený čítací rámec DMD pacientov, ktori majú delécie zahŕňajúce, ale bez toho, aby na ne boli obmedzené, exóny 12-44, 18-44, 44, 46, 46-47, 46-48, 46-49, 46-51, 46-53,46-55, 46-59, 46-60 v DMD pre-mRNA, vyskytujúce sa celkove u 16 všetkých DMD pacientov s deléciami (Aartsma-Rus and van Deutekom, 2007, Antisense Elements (Genetics) Research Focus, 2007 Nova Science Publishers, Inc.). Okrem toho sa pre niektorých DMD pacientov na obnovenie správneho čítacieho rámca vyžaduje simultánne preskakovanie jedného alebo viacerých exónov okrem exónu 45, ako sú exóny 51 alebo S 3. Neobmedzujúce príklady zahŕňajú pacientov s deléciou exónov 46-50 vyžadujúcich spoločné preskakovanie (co-skipping) exónov45 a 51 alebo pacientov s deléciou exónov 46-52 vyžadujúcich spoločné preskakovanie exónov 45 a 53.0007 Nedávno sa úspešne ukončila prvá štúdia na človeku, pri ktorej sa AON indukujúci preskakovanie exónu 51 injikoval do malej oblasti predného holenného svalu štyroch DMD pacientov. U všetkých štyroch liečených pacientov sa pozorovala nová expresia dystrofínu vo väčšinesvalových vlákien a AON bol bezpečný a dobre tolerovaný (van Deutekom et al., N. Engl. J. Med. 2007 357 2677-86).0008 Väčšina študovaných AON obsahuje do 20 nukleotidov, čo sa odôvodňuje tým, že tento relatívne malý rozmer zlepšuje tkanívovú distribúciu a/alebo bunkovú penetráciu týchto AON. Takéto krátke AON však budú mať za následok obmedzenú špeciñckosť kvôli zvyšujúcemu sa riziku prítomnosti identických sekvencií inde v genóme a obmedzenú väzbu na cieľ alebo afinitu voči cieľu kvôli nízkej voľnej energií komplexu AON-cieľ. Z tohto dôvodu sa tvorcovia tohto vynálezu rozhodli navrhnúť nové a prípadne zdokonalené oligonukleotidy, ktoré by sanevyznačovali všetkými týmito nedostatkami. Opis tohto vynálezu S ôsob0009 Podľa prvého aspektu tento vynález poskytuje spôsob indukovania a/alebo podporovania preskakovania exónu 45 v DMD pre-mRNA u pacienta, výhodne v izolovanej bunke uvedeného pacienta, pričom tento spôsob zahŕňa poskytnutie uvedenej bunke a/alebo uvedenému pacientovi molekuly, ktorá sa viaže na nepretržitý úsek aspoň 21 nukleotidov v rámci uvedenéhoexónu, pričom uvedený úsek a uvedená molekula sú rovnaké, ako sa definuje V patentovom ná roku l.0010 V súlade s tým sa poskytuje spôsob indukovania a/alebo podporovania preskakovania exónu 45 v DMD pre-mRNA, výhodne v izolovanej bunke uvedeného pacienta, pričom tento spôsob zahŕňa poskytnutie uvedenej bunke a/alebo uvedenému pacientovi molekuly, ktorá sa viaže na nepretržítý úsek aspoň 21 nukleotidov v rámci uvedeného exónu, pričom uvedený úseka uvedená molekula sú rovnaké, ako sa definuje V patentovom nároku l. 0011 Je pochopiteľne, že uvedený spôsob zahŕňa spôsob in vitro, in vivo alebo ex vivo.0012 Ako sa definuje v tomto dokumente, DMD pre-mRNA výhodne znamená pre-mRNA V DMD géne od DMD alebo BMD pacienta. DMD gén alebo proteín zodpovedá dystrofínovému0013 Výraz pacient je výhodne určený na označenie pacienta, ktorý má DMD alebo BMD,ako sa V tomto dokumente defmujú neskôr, alebo pacienta náchylnćho na rozvoj DMD aleboBMD kvôli jeho genetickej predispozícíe.0014 Preskakovanie exónov sa vzťahuje na indukovanie zrelej mRNA V bunke, ktorá neobsahuje konkrétny exón, ktorý je v nej normálne prítomný. Preskakovanie exónov sa dosiahne poskytnutím bunke exprimujúcej pre-mRNA uvedenej mRNA molekuly, ktorá je schopná interferovať so sekvenciami, ako je napríklad zostrihová donorová alebo zostrihová akceptorová sekvencia, ktore obe sa vyžadujú na umožnenie enzymatického procesu zostrihu, alebo molekuly,ktorá je schopná interferovať so signálom začlenenía exónu vyžadovaným na rozpoznanie úseku nukleotidov ako exónu, ktorý má byť začlenený do mRNA. Výraz pre-mRNA sa vzťahuje na nespracovanú alebo na čiastočne spracovanú prekurzorovú mRNA, ktorá je syntetizovaná z0015 V kontexte tohto vynálezu indukovanie a/alebo podporovanie preskakovania nejakého exónu, ako sa uvádza V tomto dokumente, znamená, že aspoň l , 10 , 20 , 30 , 40 ,50 , 60 , 70 , 80 , 90 alebo viac z DMD mRNA V jednej alebo V 0 viacerých (svalových) bunkách liečeného pacienta bude obsahovať uvedený exón. Toto sa výhodne posudzujeprostredníctvom PCR, ako sa opisuje V príkladoch.0016 In vitro spôsob podľa tohto vynálezu prostredníctvom indukovania alebo podporovania preskakovania exónu 45 v DMD pre-mRNA vjednej alebo vo viacerých bunkách pacienta výhodne poskytuje funkčný dystrofínový proteín a/alebo znižuje produkciu odchylného dystrofínověho proteínu u uvedeného pacienta. Z tohto dôvodu je preferovaným spôsobom spôsob, pri ktorom sa bunke uvedeného pacienta poskytuje funkčný dystrofínový proteín a/alebo pri ktoromsa produkcia odchylného dystrofínového proteínu V bunke uvedeného pacienta znižuje.0017 Zníženie produkcie odchylného dystrofínu sa môže posudzovať na úrovni mRNA a výhodne znamená, že 99 , 90 , 80 , 70 , 60 , 50 , 40 , 30 , 20 , 10, 5 alebo menej z počiatočného množstva mRNA pre odchylný dystrofín je ešte detegovateľných prostredníctvom RT-PCR. Odchylná dystrofínová mRNA alebo odchylný dystrofínový proteín sa V tomto dokumente označujú aj ako nefunkčná dystrofínová mRNA alebo nefunkčný dystrofínový proteín. Nefunkčným dystrofínovým proteínom je výhodne dystrofínový proteín, ktorý nie je schopný viazať aktín a/alebo členy DGC proteínového komplexu. Nefunkčný dystrofínový proteín alebo neñąnkčná dystrofínová mRNA typicky nemá dystrofínový proteín s intaktným C-kon com proteínu, alebo ho nekóduje.

MPK / Značky

MPK: A61K 31/7105, C12N 15/113

Značky: duchennovou, účinné, prostriedky, exónu, pacienta, spôsoby, svalovou, preskakovanie, pre-mrna, dystrofiou

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/124-e20672-sposoby-a-prostriedky-na-ucinne-preskakovanie-exonu-45-v-pre-mrna-pacienta-s-duchennovou-svalovou-dystrofiou.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsoby a prostriedky na účinné preskakovanie exónu 45 v pre-mRNA pacienta s Duchennovou svalovou dystrofiou</a>

Podobne patenty