Spôsob detekcie včasnej sérokonverzie s vírusom hepatitis C a kit na použitie pri tomto spôsobe

Číslo patentu: 284556

Dátum: 25.05.2005

Autor: Chien David

Je ešte 4 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Je opísaný spôsob detekcie včasnej sérokonverzie in vitro v telesnej zložke cicavčieho hostiteľa s vírusom hepatitis C, HCV, ktorý zahŕňa tieto kroky: (a) telesná zložka, pri ktorej je podozrenie, že obsahuje protilátky na HCV, sa uvádza do styku s (1) HCV antigénom vybraným z antigénu zakódovaného v E1 doméne HCV genómu, E2 doméne HCV genómu a ich agregátov, kde uvedený HCV antigén sa čistí za podmienok, pri ktorých nedochádza k denaturácii, alebo s (2) so štandardnou kontrolou za podmienok umožňujúcich imunologickú reakciu a (b) stanoví sa prítomnosť imunitných komplexov týchto protilátok a tohto antigénu, pričom neprítomnosť týchto imunitných komplexov obsahujúcich štandardnú kontrolu a prítomnosť imunitných komplexov obsahujúcich HCV antigén indikuje sérokonverziu na HCV. Je opísaný tiež kit na použitie pri uvedenom spôsobe, ktorý obsahuje HCV antigén a kontrolné štandardy, balené vo vhodných ampulkách, a inštrukciu na použitie zložiek kitu.

Text

Pozerať všetko

Vynález sa týka spôsobu detekcie včasnej sérokonverzie in vitro v telesnej zložke cicavčieho hostiteľa s vírusom hepatitis C, HCV a kitu na použitie pri tomto spôsobe.Prvýkrát identiñkoval a charakterizoval HCV ako prvotnú príčinu posttransfúznej nie-A a nie-B hepatitídy(NANBH) Houghton a kol. Okrem toho, že poskytol podstatné informácie týkajúce sa HCV, objavil Houghton a jeho spolupracovníci rad všeobecných a špecifických imunologických reagencií a metód, pozri napríklad Houghton a kol., zverejnené prihlášky vynálezu EP číslo 318216 a číslo 388232 publikácie Chao a kol., Science (1989), 244, str. 359 až 362 Kuo a kol., Science (1989), 244, str. 362 až 364 Takeuchia kol., J. Gen, Virol. (1990), 71, str. 3027 až 3033, Takeuchi a kol., Gene (1990), 91, str. 287 až 291,Takeuchi a kol., Nucl. Acíds Res. (1990), 18, str. 4626 Miyamura a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990), 87,str. 983 až 987 Saíto a kol., Proc. Nail. Acad. Sci. USA(1990), 87, str, 6547 až 6549 Chao a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990), 88. str. 2451 až 2455 Han a kol.,Proc. Nail. Acad. Sci USA (1990), 88, str. 1711 až 1715,Houghton a kol., Hepatology (1991), 14, str. 381 až 388 Weiner a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990), 89, str. 3468 až 3472. Tieto publikácie vytvárajú rozsiahly základ stavu techniky o HCV všeobecne, rovnako ako informujú o výrobe a použití HCV peptídových imunologických reagencií. Kvôli stručnosti sa tu údaje z týchto publikácií uvádzajú iba ako odkaz.Prácu Houghtona a kol. pohotovo aplíkovali a rozšírili ďalší bádatelia. Pozri napriklad Highfield a kol., britská zverejnená prihláška vynálezu číslo 2 239245 (The Welcome Foundation Ltd.) Wang publikovaná prihláška vynálezu EPO číslo 442394 (United Biomedical Inc.) Leung a kol. publikovaná prihláška vynálezu EPO číslo 445423(Abbott Laboratories) Habit a kol., publikovaná prihláška vynálezu EPO číslo 451891 (Akzo N.V.) Reyes a kol.,PCT publ. číslo W 0 91/ 15516 (Genelabs lnc.) Maki a kol.,publikovaná prihláška vynálezu EPO číslo 468657 (T onen Corp.) a Kamada a kol., publikovaná prihláška vynálezu EPO číslo 469348 (Shionogi Seiyaku K.K.). Pozri tiež Matsuura a kol. (1992), J. Virology 66, str. 1425 Kato a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990), 87, str. 9524 až 9528 Takarnizawa a kol., J. Virol. (1991), 65, str. 1105 až 1113 Chiba a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991), 88,str. 4641 až 4645 Harada a kol., J. Virol. (1991), 65, str. 3015 až 3021 Hijikata a kol., Proc. Natl, Acad. Sci. USACitlivé, špecifické metódy skríningu a identifikovanie nosičov HCV a HCV kontaminovanej krvi alebo krvných derivátov sú významným pokrokom v lekárstve. Posttransfúzna žltačka (posttransfusion hepatitis PTH) sa vyskytuje u 10 pacientov po transfúzii a na HCV z toho pripadá 90 týchto prípadov. Hlavným problémom pri tomto ochorení j e častý výskyt chronického poškodenia pečene (25 až 55 ) oproti iným žltačkárn, napriklad typu B.Starostlivosť o pacientov rovnako ako prevencia prenosu HCV krvou a krvnými derivátmi alebo tesnýrn osobným stykom vyžaduje spoľahlivú diagnostiku a prognostické nástroje, ako sú HCV polypeptidy, na detekciu protilátok tý kajúcich sa HCV. Takéto polypeptidy sú užitočné tiež ako vakcíny a imunoterapeutické činidlá na prevenciu a/alebo na liečenie chorôb. Pretože HCV je pomeme novým činidlom, existuje trvalá potreba definovat ďalšie imunologické činidlá, ktoré umožnia študovať ďalej klinický priebeh ochorenia a epidemiológiu HCV u populácie.Predmetom vynálezu je spôsob detekcie včasnej sérokonverie in vitro v telesnej zložke cicavčieho hostiteľa s vírusom hepatitis C, HCV, ktorého podstata spočíva v tom,že zahŕňa tieto krokya) telesná zložka pri ktorej je podozrenie že obsahuje protilátky na HCV sa uvádza do styku s (l) HCV antigénom vybraným z antigénu zakódovaného v El doméne HCV genómu, E 2 doméne HCV genómu a ich agregátov, kde uvedený HCV antigén sa čistí za podmienok, pri ktorých nedochádza k denaturácii, alebo s (2) so štandardnou kontrolou za podmienok umožňujúcich imunologickú reakciu ab) stanoví sa prítomnosť imunitných komplexov týchto protilátok a tohto antigénu, pričom neprítomnost týchto imunitných komplexov obsahujúcich štandardnú kontrolu a prítomnost imunimých komplexov obsahujúcich HCV antigén indikuje sérokonverziu na HCV.Predmetom tohto vynálezu je tiež kit alebo súprava na detekciu na použitie pri spôsobe uvedenom skôr, ktorý obsahuje HCV antigén a kontrolné štandardy, balené vo vhodných ampulkách a inštrukciu na použitie zložiek kítu.Pri zvláštnom uskutočnení tohto vynálezu sú antigény kódované v doménach E 1 a/alebo E 2 alebo sú antigény El a/alebo E 2. V niektorých uskutočneniach sú antigény exprimované z Vaccinia vektorov alebo exprimované v CHO bunkách. Okrem toho podľa niektorých uskutočnení vynálezu sú začlenené agregáty týchto antigénov.Vynález bližšie objasňujú nasledujúci opis a pripojené obrázkyNa obr. 1 sú schematicky naznačené predpokladané domény HCV polyproteínu.Na obr. 2 je schéma ukazujúca niektoré význaky vektoru pSC 59.Obr. 3 A, 3 B a 3 C ukazujú percento pacientov skupiny I, II a III reaktívnych v skúškach ELISA na individuálne antigény HCV.HCV antigćn je polypeptid alebo polypeptidový analóg (napríklad mirnitopy) obsahujúci arninokyselinovú sekvenciu (a/alebo aminokyselinový analóg) deñnujúci najmenej jeden epitop HCV. spravidla zodpovedajú sekvencie deñnujúce epitop arninokyselinovej sekvencii proteínu HCV (buď identický alebo substitúciou analógov natívneho arninokyselinového zvyšku, ktorý nerozrušuje epitop). Všeobecne bude mat sekvencia, defmujúca epitop,dĺžku 5 alebo viac aminokyselín, spravidla 8 a výhodne 10 alebo viac aminokyselín. Vzhľadom na konfomiačné epitopy môže byt dlžka sekvencie deñnujúca epitop podrobená širokým obmenám, lebo sa predpokladá, že tieto epitopy sú tvorené antigénom trojrozmemého tvaru (napríklad záhyby folding). Tiež aminokyselín defmujúcich epitop môže byť čo do počtu málo, ale môžu byt široko rozptýlené pozdĺž dĺžky molekuly (alebo dokonca na rôznych molekulách v prípade dimćrov, atď.) uvádzané do správnej epitopovej konfomiácie cestou záhybovania (folding). Časti antigénu medzi zvyškami, definujúcimi epitop, nemusia byť rozhodujúce pre konforrnačnú štruktúru epitopu. Napríklad vypustenie alebo substitúcia týchto intervenujúcich sekvencií nemusí ovplyvniť konformačný epitop za predpokladu, SK 284556 B 6že sa uchovajú sekvencie rozhodujúce pre epitopovú konformáciu (napr. cysteiny zahmute V disulñdovej väzbe,glykozylačné miesta, atď.).Antigény HCV podľa tohto Vynálezu tvoria konformačné epitopy z domén (obalových) El a/alebo E 2 HCV. Doména E 1, o ktorej sa predpokladá, že zodpovedá Virálnemu obalu proteínu, je bežne pokladaná za spájajúcu aminokyseliny 192 - 383 polyproteínu HCV (zverejnená prihláška vynálezu PCT číslo W 0 El 91/15771, obr. l). Podľa expresie V systéme CHO (glykozilovanom) sa predpokladá,že má približnú molekulovú hmotnosť 35 Kd zisťovanú spôsobom SDS-PAGE. O proteine E 2, prv nazývanom NSI, sa predpokladá, že spája aminokyseliny 384-800 polyproteínu a že je tiež obalovým proteinom. Podľa expresie V systéme CHO (glykozilovanom) sa očakáva, že má zdanlivú gélovú molekulovú hmotnosť približne 72 Kd. Je jasné, že tieto proteinové koncové body sú aproximatívne (napriklad karboxy zakončenie E 2 by mohlo ležať asi V oblasti aminokyselín 750-820). Je tiež zrejmé, že prototypová sekvencia izolátu HCVl V zrnienenej zverejnenej prihláške vynálezu PCT je citovaná iba na ilustráciu a že akýkoľvek izolát HCV (pozri napriklad odkazy citované V doterajšom stave techniky) je Vhodný zdroj sekvencie El a/alebo E 2 na vykonávanie spôsobu podľa Vynálezu.Antigény El a E 2 použité podľa vynálezu môžu byť virálne proteíny s plnou dĺžkou, V podstate ich verzia s plnou dĺžkou alebo ich funkčne fragmenty (napriklad fragmenty nepostrádajúce sekvencie nevyhnutné na formovanie alebo uchovanie konformačného epitopu). Okrem toho môžu antigény HCV podľa vjmálezu zahŕňať tiež iné sekvencie,ktoré neblokujú alebo nebránia vytvoreniu sledovaného konformačného epitopu. Prítomnosť alebo neprítomnosť konfoirnačného epitopu možno ľahko zistiť skríningom sledovaného antigěnu s protilátkou (polyklonálne sérum alebo monoklonálne proti konformačnému epitopu) a porovnaním reaktivity s reaktivitou denaturovanej Verzie antigénu, ktorý zadržiava len prípadné lineárne epitopy. Pri takomto skríningu s použitím polyklonálnych protilátok môže byt výhodné absorbovať polyklonálne sérum vopred s denaturovanýrn antigénom a zistiť, či zachytáva protilátky pre sledovaný antigén.Antigény HCV podľa vynálezu možno pripraviť bežným spôsobom, ktorý poskytne sledovaný konfomiačný epitop. Napríklad výhodným spôsobom na zaistenie seldétovaných glykozilovaných antigénov El a/alebo E 2 V natívnej konformácii je rekombinantná expresia cicavčích alebo hmyzich buniek. Môže však byť možné, ako je to známe pri proteinoch, podrobiť expresii antigény V inom rekombinantnom hostiteľovi a renaturovat protein po jeho získaní. Je tiež zrejmé, že chemická syntéza môže tiež poskytnúť konformačné antigénové mimitopy, ktoré proreagujú s natívnym konforrnačným epitopom antigénu.Výhodnýrmi antigénmi sú tiež komplexy E 1 a/alebo E 2(nazývané tiež agregáty) obsahujúce viac ako jeden monomér El alebo E 2. Dirnéry El E 1, diméry E 2 E 2 a heterodiméry E 1 E 2 sú všetky antigény V rozsahu tohto vynálezu. Agregáty môžu tiež zahrňovať väčšie útvary a môžu mat molekulové hmotnosti presahujúce 800 kD.Pojem spojený polypeptid (fusion polypeptide) určuje polypeptid, V ktorom je aspoň jeden antigén HCV Slíčasťou jediného súvislého reťazca aminokyselín, pričom sa takýto reťazec V prirode nevyskytuje. Antigény HCV môžu byť navzájom spojené priamo peptidovýrni väzbami alebo môžu byť oddelené intervenciou sekvencií aminokyselín. Spojené polypeptidy môžu obsahovať tiež sekvencie aminokyselín exogénne proti HCV.Pojem spoločná pevná matrica (common solid matrix) určuje pevnú látku, ku ktorej sú viazané individuálne antigény HCV alebo spojené polypeptidy kovalentnými alebo nekovalentnýrni Väzbami, ako je hydrofóbna adsorpcia.Pojem telesná zložka (body component) určuje kvapalinu alebo tkanivo cicavčieho jedinca (napríklad antropoidnéhc, ľudského), ktorá zvyčajne obsahuje protilátky jedincom vytvorené. Takéto telesné zložky sú V odbore známe a zahrnujú napríklad krv, plazmu, sérum, miechový mok, lymfatické šťavy, sekréty dýchacíeho traktu alebo urogenitálneho traktu, slzy, sliny, mlieko, biele lcrvinky a kostnú dreň. Telesné zložky zahrnujú biologické tekutiny. Pojem biological liquid (biologická tekutina) sa týka tekutiny získanej z organizmu. Niektoré biologické tekutiny sa používajú ako zdroj iných produktov, ako sú napríklad faktory zrážanlivosti (napriklad faktor VIII C), sérový alburnin a rastový hormón. V takýchto prípadoch je dôležité,aby zdroj biologickej tekutiny bol zbavený znečistenia vírusom, ako je HCV.Pojem imunologicky reaktivny (immunologically reactive) znamená, že sledovaný antigén bude reagovať špecificky s anti-HCV protilátkarni prítomnými V telesnej zložke jedinca ínñkovaného HCV.Pojem imunitný komplex (immune complex) určuje kombináciu vytvorenú, keď protilátka sa viaže na epitop na antigéne.Tu používaný pojem E 1 znamená protein alebo polypeptid podrobený expresii medzi prvými 400 arninokyselinami polyproteínu HCV, o ktorom sa niekedy hovori ako o E-proteine alebo S-proteine. V jeho prírodnom tvare je to 35 kD glykoproteín, ktorý sa nachádza V silnej súvislosti s membránou. Vo väčšine kmeňov HCV je protein E 1 zakódovaný vo virálnom polyproteine následne za C (jadrovým) proteínom. Protein El zasahuje od približne aminokyseliny(aa) 192 do približne aa 383 plnej dĺžky polyproteínu. Tu používaný pojem El zahrnuje tiež analógy a skomolené tvary, ktoré sú imunologicky lcrížovo realdívne s prírodným El.Tu používaný pojem E 2 znamená protein alebo polypeptid podrobený expresii medzi prvými 900 aminokyselinarni polyproteínu HCV, o ktorom sa niekedy hovorí ako o NSl-proteíne. V jeho prírodnom tvare je to 72 kD glykoprotein, ktorý sa nachádza V silnej súvislosti s membránou. Vo väčšine kmeňov HCV je protein E 2 zakódovaný vo virálnom polyproteine následne za proteínom El. Protein E 2 zasahuje od približne aminokyseliny aa 384 do približne aa 820. Tu používaný pojem E 2 zahmuje tiež analógy a skomolené tvary, ktoré sú imunologicky križovo reaktívne s prírodným E 2.Tu používaný pojem agregát (agregate) znamená komplex El a/alebo E 2 obsahujúci viac ako jeden monomér El alebo E 2. Diméry E 1 E 1, diméry E 2 E 2 a heterodiméry E 1 E 2 sú Všetky agregáty V rozsahu tejto definície. Agregát môžu tiež zahrňovať väčšie útvary a môžu mať molekulové hmotnosti väčšie ako 800 kD.Pojem vyčistený (puriñed) V súvislosti s proteinmi sa týka kompozicíe, kde žiadaný protein tvori najmenej 35 celkovej proteínovej zložky V kompozícii. Žiadaný proteín je výhodne najmenej 40 , výhodnejšie najmenej približne 50 , ešte výhodnejšie najmenej približne 60 , ešte výhodnejšie najmenej približne 70 , ešte výhodnejšie najmenej približne 80 , ešte výhodnejšie najmenej približne 90 a najvýhodnejšie približne 95 hmotnosti celkovej proteínovej zložky. Kompozícia môže obsahovať iné zložky, ako sú napriklad uhľohydráty soli, lipidy a rozpúšťadlá bez toho, aby to ovplyvnilo tu použité stanovenie čistoty.Pojem izolovaný proteín znamená kompoziciu HCV, ktorá má čistotu najmenej 35 .Pojem izolovaný polypeptid znamená polypeptid,ktorý bol V podstate zbavený iných virálnych zložiek HCV,najmä genomíckého polynukleotidu HCV. Polypeptidová kompozícia je V podstate zbavená inej zložky, ak hmotnosť polypeptidu V kompozícii je najmenej hmotnostne 70 polypeptidu a iných kombinovaných zložiek, výhodnejšie najmenej približne 89 , ešte výhodnejšie približne 90 a najvýhodnejšie 95 alebo viac percent.Spôsoby imunologických testov podľa Vynálezu používajú antigény HCV z domén E 1 a E 2 a tie, ktoré obsahujú konforrnačné epitopy rozpoznané protilátkarni V sére jedincov infikovaných HCV. Každý z antigénov má najmenej jeden konformačný epitop, ktorý existuje V prirodne sa vyskytujúcou časticou HCV, alebo V jej infekčnom produkte,ako je zrejmé z imunoreaktivíty antigénu s protilátkami V telesnej zložke jedinca iníikovaného HCV a zo straty imunoreaktivity epitopu po denaturácií antigénu. Dĺžka antigénu je dostatočná na udržanie imunoreaktívneho konformačného epitopu spojeného s týmto epítopom. V rozsahu vynálezu je mať viac ako jeden konfonnačný epítop na antigéne. Často môžu mať nativne obalové antigény, použité V imunologických testoch, plnú dĺžku, môžu však byt skomolené, napríklad kvôli zvýšeniu rozpustnosti alebo kvôli zlepšeniu sekrěcie (napríklad vypustenim domén spájajúcich membrány). Do rozsahu vynálezu tiež patrí použitie bud jednotlivých antigénov alebo ich kombinácií či agregátov. lmunologické testy môžu tiež použit epitopy E 1, epitopy E 2, agregáty alebo kombinácie natívnych E 1 a E 2,Podľa zámeru patn tiež do rozsahu vynálezu používanie antigénov s lineárnymi epitopmi V kombinácii s obalovýrni konfonnačnými epitoprni HCV.Spôsoby detekcie prítomnosti konforrnačných epitopov sú v odbore známe a niektoré z nich sú ďalej ilustrované V príkladoch.Na základe predpokladaných aminokyselín, zakódovaných V nukleotidovej sekvencii HCVI a na základe iných poznatkov sú možnými proteínovými doménami zakódovaného proteínu HCV, rovnako ako približne rozhrania,tietoPribližná rozhrania Predpokladaná doména (čísla aminokyselín) c (nukleckapsidový protein) 1- 191 B 1 (virový obalový protein) 192- 383 B 2/N 51 ĺ 0 ba 1) 354- aoo Nsz ano-lose N 53 (proteázaíř) 1050-1650 M 54 1651-2100Tieto domény sú však pokusné. Napríklad rozhranie E 1-NS 2 je pravdepodobne V oblastí 750-810 a rozhranie NS 3-NS 4 je približne 1640-1650. Existuje tiež poznatok,že verzia 191 aa C je prekurzor, ktorý je ďalej vedený (napríldad do dĺžky približne 170 aa), a že proteíny NS 2, NS 4 a NS 5 sú každý ďalej vedené do dvoch dokonalých proteínov. Vzájomná poloha domén je znázornená na obr. l.Spôsoby prípravy antigénov El a E 2 včítane antigénov s natívnymi konformáciami sú opísané V článku Spaete R. a kol., Virology (1992), 188, str. 819 - 830 a V prihlášlce vynálezu W 0 92/08734. Všeobecne sa volia hostiteľské bunky, ktoré umožnia vytváranie natívnych konformačných epitopov V expresovaných obalových proteínoch týmito hostiteľskýrni bunkami môžu byt napríklad Zvieracie bunky, hmyzie bunky a kvasnicové bunky.Medzi eukaryotických hostiteľov patria kultúry kvasnicových a cicavčích buniek. Najbežnejšie používanými kvasnicovými hostiteľmi sú Saccharomyces cerevisiae aSaccharornyces carlsbergensis a sú vhodnými plesňovými hostiteľmi. S kvasnicarni kompatibilné Vektory nesú značky, ktoré umožňujú výber úspešných transforrnantov udeľujúcich prototropiu auxotropickým mutantom alebo odolnosť proti ťažkým kovom pri kmeňoch divokého typu. S kvasnicami kompatibilné Vektory môžu používať Z-milcrónový počiatok replikácie (Broach a kol. (1983), Meth. Enz.,101, str. 307), kombinácie CEN 3 a ARS 1 alebo iné prostriedky na zaistenie replikácie, ako sú sekvencie, ktore vedú k začleneniu príslušného fragmentu do genómu hostiteľskej bunky. Riadiace sekvencie pre kvasnicové Vektory sú V odbore známe a zahrnujú promótory na syntézu glykolitických enzýmov (Hess a kol. (1968), J. Adv. Enzyrne Reg. 7,str. 149 Holland akol. (1978), Biochemistry 17, str. 4900),včítane promótora pre 3 fosfoglycerátovú kinázu (Hitzeman(180), J. Biol. Chem 255, str. 2073). Začlenené môžu byt i terminátory, ako napríklad terminátory odvodené od enolazového génu U-Iolland (1981), J. Biol. Chem, 256, str. 1385). Obzvlášť vhodné riadiace systémy sú systémy, ktoré obsahujú promótor glyceraldehyd-S fosfàtovej dehydrogenázy (GAPDH) alebo riadíteľný promótor alkoholovej dehydrogenázy (ADH), terrninátory tiež odvodené od GAPDH a ak je požadovaná sekrécia, vedúce sekvencie z kvasnicového ot-faktora. Okrem toho oblast riadiaca transkripciu a oblasť iniciujúca translcripciu, ktoré sú funkčne spojené, môžu byt také, že prirodzene nesúvisia s organizmom divokého typu. Tieto systémy sú podrobne opísané V prihláškach vynálezov EPO 120551, zverejnenej 3. októbra 1984, EPO 116201, zverejnenej 22. augusta 1984 a EPO 164556, zverejnenej 18. decembra 1985.Rady cicavčích buniek vhodných ako hostitelia na expresiu sú V odbore známe a zahrnujú veľa zvečnených bunkových radov dostupných od American Type Culture Collection (ATCC), včítane Hela buniek, buniek z vaječníkov čínskych škrečkov (CHO), buniek z ľadvín mladých škrečkov (BHK) a Veľa ďalších radov cicavčích buniek. Vhodné promótory pre cicavčie bunky sú tiež v odbore známe a zahmujú Vírusové promótory, ako od Simian Virus 40 (SV 40)(RSV), adenovirus (ADV) a hovädzí nádorový vírus (BoVina papilloma virus - BVP). Cicavčie bunky môžu tiež Vyžadovat terminátorové sekvencie a sekvencie poly A môžu tiež byť zahrnuté uľahčujúce sekvencie zvyšujúce expresiu a môžu byť tiež žiaduce sekvencie, ktoré spôsobujú zosilnenie génu. Tieto sekvencie sú V odbore máme.Vektory vhodné na replikáciu cicavčích buniek sú V odbore známe a môžu zahrňovat virálne replikony alebo sekvencie zaručujúce integráciu príslušných sekvencií kódujúcich epitopy NANEV do hostiteľského genómu.Vektor, ktorý sa používa na expresiu cudzích DNA a ktorý môže byť použitý na prípravu vakcíny, je Vaccinia vírus. V tomto prípade je heterológna DNA začlenená do Vaccinia genómu. Technika začleňovania cudzej DNA do genómu Vaccinia vírusu je V odbore známa a používa napríklad homológové rekombinácie. Heterológia DNA sa všeobecne začleňuje do génu, ktorý je svojou povahou zvyšný, napríklad tymidín kinázový gén (tk), ktorý tiež zaisťuje selektovateľnú značku. Plazmidové Vektory, ktoré podstatnou mierou uľahčujú konštrukciu rekornbinanmých vírusov, sú opísané v literatúre (pozri naprüdad Mackett a kol. (1984), J. Virol. 49, str. 857 Chakrabarti a kol. (1985),Mol. Cell. Biol., 5, str. 3403 Moss (1987 v knihe Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (nakladatelia Miller a Calos, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.), str. 10). K expresii HCV polypeptidu potom dochádza V bunkách alebo V jedincoch, ktorí boli imunizovarn živým rekombinantným vírusom vakcíny.segment HCV CDNA kódujúci požadovanú sekvenciu sa začlení do Vaccinia vektora. Sekvencia, kódujúca polypeptid, môže byť pripojená k vedúcej sekvencii. Vedúcou sekvenciou môže byť sekvencia pre aktivátor tkanivového plazrninogénu (TPA) alebo z iného zdroja, napríklad sekvencia pre B-globín. Heterológový polynukleotid môže byť začlenený do Vaccinia vektora, ktorý je verziou pSCl 1,vďaka prísade sekvencie spojovníka (polylinkér), ktorá obsahuje klonovacie miesto.Aby sa zistilo, či je vykonaná expresia HCV polypeptidu z Vaccinía vektora, môžu byť bunky BSC 1 infektované s rekombinantným vektorom a pestované na sklíčku mikroskopu za podmienok dovoľujúcich expresiu. Bunky možno potom ñxovat acetónom a vykonajú sa skúšky imunotluorescencie pomocou séra, o ktorom je známe, že obsahuje anti-HCV protilátky proti polypeptidom zakódovaným v oblastí genómu HCV, z ktorého bol segment HCV V rekombinantnom expresnom vektore odvodený.Medzi iné systémy eukaryotických alebo vírusových genómov patria hmyzie bunky a vektory vhodné na použitie v týchto bunkách. Tieto systémy sú v odbore známe a zahmujú napríklad hmyzie expresné transferové vektory,odvodené od baculovírusu Autography califomica nukleárneho polyhérového vírusu (AcNPV), ktorým je od pomocníka závislý vírusový expresný Vektor. Expresné vektory,odvodené od tohto systému, používajú zvyčajne silný génový promótor vírusového polyhedrínu na riadenie expresie heterologových génov. Bežne najčastejšie používaný transferový Vektor na začleňovanie cudzích génov do AcNPV je pAc 373. Nlnohě iné, odbomíkom známe vektory, boli tiež určené na zlepšenie expresie. Patrí medzi ne napríklad pVL 985 (ktorý mení počiatočný polyhedrínový kodón z ATG na ATT a ktorý zavádza pár báz BamHI klonovacieho miesta 32 po prúde od ATT (pozri Luckow a Summers(1989), Virology, 17, str. 31). Dobrá expresia nespojených cudzích proteínov vyžaduje zvyčajne cudzie gény, ktoré majú ideálne krátku vedúcu sekvenciu obsahujúcu vhodné signály na iniciáciu translácie predchádzajúcej počiatočný signál ATG. Plazrnid obsahuje tiež polyhedrín polyadenylový signál a ampicilinu rezistentný (amp) gén a počiatok replikácíe na selekciu a šírenie v E. coli.Spôsoby zavádzania heterológneho DNA do požadovaného miesta v baculovíruse sú v odbore známe. (Pozri Summer a Smith, Texas Agricular Experiment Station Bulletin číslo 1555 Ju a kol. (l 987) Smith a kol. (1983),Mol. and Cell Biol., 3, str. 2156 až 2165 a Luckow a Summers (1989), Virology 17, str. 31). Napnklad môže byť začlenenie do génu takého, ako je polyhedrínový gén, homológovou rekombináciou začlenenie môže byť tiež do reštrikčného enzýmového miesta zameraného do požadovaného baculovírusového génu. Začlenenými sekvenciami môžu byt sekvencie, ktore kódujú všetky alebo odlišné segmenty polyproteínu alebo iných orfs, ktoré kódujú vírusové polypeptidy.Signály na posttranslačnú modiñkáciu, ako je signál peptidového štiepenia, proteolytického štíepenia a fosforylácie, sa javí ako rozpoznateľné hmyzirni bunkamí. Signály potrebne na selcréciu a nukleárnu akumuláciu sa javia tiež ako konzervovanie medzi bunkami bezstavovcov a stavovcov. Príklady signálnych sekvencii buniek stavovcov, ktoré sú účinné v bunkách bezstavovcov, sú v odbore známe, napríklad u ľudského interleukín-Z signálu (IL-2), čo je signál pre transport z bunky, je rozpoznaný a čisto odstránený v hmyzích bunkách.HCV antigény E 1 a E 2 podľa tohto vynálezu môžu byť uplatnené vo všeobecne akejkoľvek štruktúre, ktorá používa známe antigériy na detekciu protilátok. Ale štruktúry,ktoré defomiujú sledovaný konformačný epitop HCV, je potrebné vylúčiť alebo modifikovať. spoločným znakom všetkých týchto testov je, že sa uvádza do styku antigén s telesnou zložkou, pri ktorej je podozrenie, že obsahuje protilátky HCV za podmienok, ktoré umožnia väzbu antigénu na ktorúkoľvek takúto protilátku prítomná v zložke. Takýrnito podmienkami sú typicky fyziologická teplota, hodnota pH a iónová pevnosť, používajúca nadbytok antigénu. Inkubáciu antigénu so vzorkou nasleduje detekcia irnunitných komplexov daných antigénom.Plánovanie imunologických testov podlieha do veľkej miery zmenám a v odbore sú známe mnohe štruktúry. Protokoly môžu napríklad zahrňovat pevné nosiče alebo imunoprecipitáciu. Väčšina testov používa značkované protilátky alebo polypeptidy značenie môže byť napriklad pomocou molekúl enzymatických, tluorescenčných, cherniluminiscenčných, rádioaktívnych alebo farebných. Testy,ktoré zosilňujú signály z imunitného komplexu, sú tiež márne, ich príkladom sú testy používajúce biotin a avidin a enzýmy značené a enzýmy sproslredkované imunologickými testami, ako sú testy ELISA.Imunologické testy môžu mať bez obmedzenia heterogénnu alebo homogénnu štruktúru a môžu byť štandardného alebo konkurenčného typu. Pri heterogénnych štruktúrach je polypeptid typicky viazaný na pevnú matricu alebo nosič kvôli uľahčeniu separácie od polypeptidu po inkubáciu. Príkladrni pevných nosičov, ktoré možno použiť, je nitrocelulóza (napriklad v podobe membránových alebo rnikrotitračných jarniek), polyvinylchlorid (napríklad pri listoch alebo milcrotitračných jamkách), polystyrénový latex (napriklad pri perlových alebo rnikrotitračných doštičkách polyvinylidinfluorid - známy ako Immunlonm), diazotizovaný papier, nylónové membrány, aktivovane perly a perly Proteínu A. V prípade heterogénnych štruktúr môže byť napríklad použitý Dynatech lmmunlonTM alebo ImmunlonTM 2, nnlcrotitračné doštičky alebo polystyrénové perly s priemerom 6,35 mm (Precision Plastic Ball). Pevný nosič obsahujúci antigćnové polypeptidy sa typicky umýva po oddelení od skúšobnej vzorky a pred detekciou viazaných protilátok. Tak štandardné, ako konkurenčné štruktúry sú V odbore známe.Pri homogénnych štruktúrach je skúšobná vzorka inkubovaná s kombináciou antigénov V roztoku. Môže to byť napríklad za podmienok, ktoré vylúčia všetky komplexy antigén - protilátka, ktoré sa vytvoria. Tak štandardné, ako konkurenčné štruktúry týchto testov sú v odbore známe.Pri štandardnej štruktúre sa priamo zaznamenáva rrmožstvo protilátok HCV v komplexe antigén - protilátka. Môže sa to vykonávať tak, že sa zisťuje, či sa značené antixenotické (napríklad antiľudské) protilátky, ktoré rozpoznajú epitop na protilátkach HCV, budú viazať vplyvom tvorenia komplexu. Pri konkurenčnej štruktúre sa na množstvo protilátok HCV usudzuje zo sledovania konkurenčného účinku na väzbu známeho množstva značenej protilátky (alebo iného konkurujúceho ligandu) v komplexe.Vytvárane komplexy obsahujúce anti-HCV protilátky(alebo v pripade konkurenčných testov množstvo konkurujúcej protilátky) sa zisťujú radom známych techník, závisiacich od štruktúry. Napriklad detekciu neznačených protilátok HCV v komplexe možno vykonávať pomocou konjunkcie antixenotických lg v komplexe so značkou (napriklad s enzýmovým značením).

MPK / Značky

MPK: G01N 33/576

Značky: hepatitis, detekcie, použitie, spôsob, spôsobe, sérokonverzie, včasnej, vírusom, tomto

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/12-284556-sposob-detekcie-vcasnej-serokonverzie-s-virusom-hepatitis-c-a-kit-na-pouzitie-pri-tomto-sposobe.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob detekcie včasnej sérokonverzie s vírusom hepatitis C a kit na použitie pri tomto spôsobe</a>

Podobne patenty