Použitie nukleovej kyseliny, kompozícia a spôsob jej výroby

Je ešte 4 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Použitie nukleovej kyseliny na výrobu liečiva na transfekovanie aspoň niektorých buniek reprodukčného traktu cicavčích samičích jedincov zavedením nukleovej kyseliny do uvedených buniek.

Text

Pozerať všetko

Vynález sa týka použitia nukleovej kyseliny na výrobu liečiva na transfekovanie aspoň niektorých buniek reprodukčného traktu cicavčích samičich jedincov zavedením nukleovej kyseliny do uvedených buniekNa prichytenie embrya v matemici cicavca sú vyžadované dve hlavné okolnosti po prvé, príprava endometria na prijatie blastocysty, ktorá môže byť potom implantovaná a môže byť vyživovaná z vytvorenej placenty po druhé, modiñkácia aktivity myometria, ktorá musí byť V stave pokoja a tým umožňuje blastocyste, aby sa uhniezdila v dutine matemice bez nebezpečia vypudenia. Obidve tieto podmienky sú regulované účinkom horrnónov počas gravidity,pričom estrogény a progesterón sú z tohto hľadiska zvlášť významné. Tieto hormóny účinkujú na endometrium a myometrium prostredníctvom svojich receptorov, ktore sú uložené v jadre cieľových buniek. Aktivovaný komplex steroid-receptor v jadre je v interakcii so špeciñckými oblasťami DNA, aby stimuloval, reprimoval alebo dereprimoval gény, ktoré kódujú bilekoviny a polypeptidy, ako sú enzýmy alebo rastove faktory.lniciácia implantácie je vyvolaná kaskádou biochemických a biofyzikálnych zmien. Adhezívnc molekuly (napriklad CAM 105) sa implikujú vo včasných štádiách prichytenia sa blastocysty na stenu matemice. Potom sa blastocysta a endometrium prispôsobia tak, aby sa zosilnil úzky vzťah medzi fetálnym tkanivom a tkanivom matky. U kopytníkov bunky trofoblastu, ktoré vytvárajú vonkajšiu vrstvu blastocysty, migrujú do epitelu matemice, pričom dôjde k postupnej fúzii. Migrácia buniek prebieha u žien na inej úrovni, pretože nie je iba izolovaná a nie je uskutočňované iba špecifickými bunkami, ktore migrujú, ale veľkými plochami trofoblastu, ktoré prenikajú medzi epiteliálne bunky matemice. Aby k tomuto došlo, dochádza k fúzii niektorých buniek trofoblastu, aby sa vytvorilo syncítium. Proces je veľmi rýchly a embryo sa prichytí v tkanive maternice bez toho, aby došlo k významnejšej degenerácii epitelu matemice. Pri niektorých druhoch je proces implantácie oneskorený, podriadený pokynom prírody, ktoré zabezpečia, že mláďatá sa narodia vo vhodnom ročnom období, alebo fyziologickým faktorom, ako je laktácia, takže matka ukončí pridájanie predchádzajúceho vrhu skôr než dôjde k ďalšej gravidite.Príprava matemice na implantáciu je regulované sekréciou ovariálnych honnónov. Transport oplodnenćho vajíčka cez vajíčkovod musí byť presne načasovaný, takže sa dostane do maternice v správnom čase jej vývoja, v období,ked má maternica vhodné podmienky na jeho prijatie. Vo väčšine prípadov matemica odmieta embryo, v skutočnosti viac ako iné oblasti tela. Epiteliálna vrstva matemice je, za väčšiny podmienok, rezistentná na prijatie a ínvázíu trofoblastu a táto rezistencia poľavuje iba za veľmi presných hormonálnych štádii.Pri myšiach a potkanoch nespárené zvieratá nemajú úplný estrálny cyklus, netvoria normálne sekrečné žlte teliesko, ktoré produkuje zvýšené množstvá progesterónu. Ak dôjde k spáreníu v estrálnom období, V obdobi, keď sa ovariálnym folikulom vylučujú vysoké hladiny estrogénov pri uvoľnení vajíčka, na mieste prasknutia folikulu sa vytvorí žlté teliesko, vylučujú sa zvýšené koncentrácie progesterónu, dôjde k ímplantácii a gravidita progreduje (dlžka 21dní). Ak po spárení nedôjde k oplodneniu, priebeh je podobný, až na to, že žlté teliesko pretrváva iba asi ll dní a pseudogravidita sa ukončí.Celuláme a biochemické zmeny, ktoré sa odohrávajú v endometriu, sú najviac zatiaľ preštudované u myší a potkanov, hoci informácie o týchto aspektoch u žien sa za posledné roky prehlbujú. Endometrium pri všetkých druhoch pozostáva z troch hlavných tkanív - luminálny epitel, glandulámy epitel a stroma. Proliferácia buniek sa v troch spomenutých tkanivách vyskytuje v rôznom čase. Luminálne bunky proliferujú tesne pred estrom (proestrus) pod vplyvom zvyšujúcich sa hladín estrogénov produkovaných vo folikuloch vaječnika. Po l dni gravidity (deň kopulačnej zátky u hlodavcov) delenie prestáva, ale potom dochádza k druhému, síce menšiemu prepuknutiu aktivity na 3. deň. Žľazové bunky majú najväčšiu aktivitu na 4. deň a potom sa aktivita znižuje. Strornálne bunky do 4. dňa neproliferujú, ale potom, pod vplyvom progesterónu, dosahujú vysoke hladiny proliferácie okolo 5 dňa. U žien sa o týchto zmenách, ktoré ohlasujú proces implantácie, vie menej, ale zdá sa, že vrchol proliferácie je v epiteliálnych bunkách počas folíkulámej fázy cyklu a v stromálnych bunkách počas luteálnej alebo sekrečnej fázy, podobne ako u myší a potkanov.Príčina endometriálnej bunkovej proliferácie nie je celkom objasnená. Uvažuje sa o príprave endometria na implantáciu zvýšením počtu buniek, ktore budú mat nutritívnu a sekrečnú funkciu (žľazový epitel) a ktoré sa zúčastnía na veľmi včasných fázach tvorby placenty (decidualizácia). Ako nevyhnutná podmienka úspešnej implantácie, môže bunková mitóza postupovať smerom k diferenciácii buniek,a preto zohráva kľúčovú úlohu v skorých štádiách vzniku gravidity. skutočnosťou, ktorá podporuje túto úlohu, je endometriálna produkcia rastových faktorov (mitogénov),cytokínov a jadrových onkogénov. Mnoho z týchto látok sa produkuje vo zvýšených koncentráciách pri odpovedi voči ovariálnym homiónom pôsobiacim prostredníctvom ich receptorov.Z hľadiska rastových faktorov sa v súčasnosti venuje veľa pozornosti epidemiálnemu rastovému faktoru (EGF),epidermálnemu rastovému faktoru víažucemu heparín(HBEGF), amfiregulínu a rastovým faktorom viažucim inzulín (IGF-I a IGF-II). V súčasnosti sa v experimentoch na myšiach zaznamenala dôležitosť lokálneho (parakrinného) účinku aspoň pri jednom z týchto rastových faktorov, pri amfiregulíne. Pomocou antiprogestínu, RU 486 sa dosiahla inhibicia implantačno-špecifického a progesterónom regulovaného génu pre amñregulín a toto malo za následok zabránenie implantácie (Das et al., Molecular Endocrinology,9, 691-705, 1995).Z hľadiska cytokinov sa vylučovacimi sledovaniami zistilo, že leukemický inhibičný faktor (LIF) a kolónie stimulujúci faktor (CSF), ktoré sú produkované aj matemicou myši v čase implantácie, sú nevyhnutné, demonštrujúc, že ich odstránenie je nekompatibílné s implantáciou a nomiálnou placentáciou (Stewart et al., Nature, 359, 76-79, 1992 Pollard et al. Developmental Biology, 148, 273 - 283,1991).(ktoré sú skorými indikátonni transkripcie génu), sa zvyšujú v matemici po podávaní estrogénu a sú inhibované progesterónom.V rozsahu invázie trofoplastu v čase implantácie existujú medzi rôznymi druhmi významné rozdiely. U žien je skorý trofoblast vysoko invazívny, zatial čo u prasiat, u ktorých je forma implantácie neinvazivna, počas troch mesiacov gestácie nedochádza k porušeniu epitelu maternice.Zlyhanie implantácie je pri obidvoch týchto druhoch vysoké, dosahujúce asi 60, prípadne 30 . Dôvody tohto zlyhania sú zložité a nedostatočne objasnené. U žien možno asi polovicu strát pripísať genetickým abnormalitám, ale u prasiat, rovnako ako u iných kopytmkov, kde je strata tiež velká, predstavujú genetické defekty iba malé percento vzhľadom na celkový počet. Po zlyhaní implantácie u žien zníženie sekrécie progesterónu spôsobuje krvácanie, ako na konci normálneho menštruačného cyklu toto sa u väčšiny iných živočišnych druhov nevyskytuje. Poruchy menštruácie, ako aj implantácie sú známe. Okrem toho, menštruačné krvacanie, či už ako dôsledok sekvenčnej hormonálnej terapie, alebo v súvislosti s kontinuálnou substitučnou hormonálnou terapiou, alebo po podávaní čisto progesterónových kontraceptív, sú významnou príčinou u chorých i zdravých žien. Objasnenie takéhoto krvácania je cieľom mnohých štúdií zameraných na biochemické mechanizmy(napríklad prostaglandiny, enzýmy, polypeptidy a proteiny,vazoaktivne látky, ako je doštičky aktivujúci faktor PAF a vaskulámy endoteliálny rastový faktor (VEGF) a bunkové mechanizmy (napriklad migrácia buniek udomácnených v maternici, ktoré produkujú imunosupresívne látky).Súčasné poznatky reprodukčných procesov sú široko zamerané na reguláciu produkcie steroidných hormónov a na účinky týchto horrnónov na ich cieľove tkanivá. Napriek všetkému sa zdá, že parakrinné a autokrinně faktory sú kľúčovými mediátormí reprodukčnej funkcie, hoci v interakcii so steroidmi (Benton, 1991, Current Opinion in Cell Biology, 3, 171-175 Rozengurt 1992, Current Opinion in Cell Biology, 4, 161-165 Tartakovski et al., 1991, Developmental Biology, 146, 345-352 Robertson et al., 1992 Current Opinion in Biology, 4, 585-590 Smith, 1994, Human reproduction, 9, 936-946, a Tabibzadeh, 1994, Human reproduction, 9, 947-967). Najviac objasnený príklad týchto poznatkov sa pozoruje u ovarektomizovanej myši. Na tomto modeli sa matemica prejaví významným rastom ako odpoveďou na jednotlivú dávku estradiolu. Tento účinok môže byt blokovaný anti-TGF protilátkou (TGF je transformujúci rastový faktor), čo naznačuje, že mitogénne účinky estrogénu v tomto tkanive sú sprostredkovane TGFoi (Nelson et al., 1992, Endocrinology, 131, 1657 až 1664).Následne je medikamentózna liečba v gynekológii založená na steroidno/antisteroidnej regulácii matemice (Yen a Jaffe, 1991, Reproductive Endocrinology, ed. Jaffe a Benton, Pub. WB Saunders, Philadelphia Baird, 1993,British Medical Bulletin, 49, 78-87). Napriek nevyvrátiteľněmu úspechu tohto prístupu sa žiadny podstatný pokrok v technológii kontraceptív nedosiahol počas 20 rokov, neidentifikovali sa spôsoby zlepšujúce implantáciu, nedosiahol sa žiadny pokrok pri podpore rastu placenty a jej vývinu a nenašiel sa žiadny nový spôsob liečenia benígnych gynekologických ochorení (menštruačná dysfunkcia a fibroidy).Existuje rrmožstvo publikovaných prác v súvislosti s použitím génového prenosu u cicavcov, aby došlo k zmene genotypu aspoň niektorých buniek v určitom tkanive alebo tkanivách. Je známa najmä snaha gěnovej terapie u ľudí zavedením sekvencií nukleových kyselín do recipientov, s cieľom prekonať genetickú deficienciu recipíenta expresiou polypeptidov kódovaných zavedenými sekvenciami nukleových kyselín. Skúšania génovej terapie boli napriklad uskutočnené v prípadoch, kde DNA sekvencie (inkorporovane pomocou vektorov vírusov) boli zavedené do dýchacích ciest pacientov s cystickou ñbrózou, aby sa zmenil fenotyp prinajmenšom pri niektorých epiteliálnych bankách výstelky dýchacích ciest pacientov. Dosiaľ neboli publiko vané žiadne snahy zaviesť DNA do endometría cicavcov,napriek tomu, že dostupne techniky existujú.Jeden predmet vynálezu sa týka použitia nukleovej kyseliny na výrobu liečiva na transfekovanie aspoň niektorých buniek reprodukčného traktu ľudských samičích jedincov zavedením nukleovej kyseliny do uvedených buniek.Ďalší predmet vynálezu sa týka použitia nukleovej kyseliny na výrobu liečiva na transfekovanie aspoň niektorých buniek reprodukčného traktu cicavčích samičích jedincov zavedením nukleovej kyseliny do uvedených buniek, kde liečivo sa jedincovi podáva v čase po ovulácii až do okamihu, vrátane, v rovnakom menštruačnom cykle, v ktorom je najvyššia hladina progesterónu v krvi.V predkladanom vynáleze nemožno v žiadnom prípade uvažovať o rozširovaní existujúcich techník génovej terapie, ktoré sú už známe ako aspoň čiastočne úspešne pri aplikácii do pľúc pacientov s cystickou fibrózou. Vrodené genetické poruchy nemožno považovať za zodpovedné v súvislosti so známymi ochoreniami endometría, takže nie sú podnetom pre odbomikov v oblasti aplikácie techník génovej terapie do endometría. Ďalej, epitel endometría je rôznorodý (kuboidný, odvodený od epitelu célomu) v porovnaní s epitelom pľúc (ktorý je vrstevnatý), a preto nemožno predpokladať, že sa budú správať analogicky. Navyše, aspoň pri primàtoch v endometriu jestvuje cyklické uvoľňovanie epitelu endometría, čo by mohlo zapríčiniť stratu akýchkoľvek treansfektovaných buniek. Konečne, vynálezcovia zistili, že neexistoval žiadny prenos zavedenej DNA do orgánov matky, ani do placenty embrya, kde by sa mohli vyskytnúť alebo spôsobiť praktické ťažkosti.Typicky sa nukleová kyselina zavádza do samice cicavca (výhodne ženy), najmä do jej endometriálnych buniek. Je snaha zaviesť nukleovú kyselinu do žľazového epitelu endometría. Nukleová kyselina môže kódovať polypetid, ktorý už je prirodzene zosyntetizovaný bunkami, do ktorých bola nukleová kyselina zavedená, takže hladina expresie takéhoto polypeptidu je zvýšená prostredníctvom účinku dávky génu. Altematívne možno tento spôsob použit na indukovanie buniek exprimovat polypeptid, ktorý v týchto bunkách predtým syntetizovaný nebol. Polypeptidom by mohol byť napríklad umelý rekombinanmý polypeptid, ktorý v prírode neexistuje, ako napríklad chimémy polypeptid obsahujúci úplne alebo čiastočne funkčné domény z dvoch alebo viacerých rozdielnych proteínov.Nukleovou kyselinou je výhodne DNA, ale možno sa snažiť aj o zavedenie RNA (sense alebo non-sense vlákien). Antisense molekula by mohla byť použitá na inhibíciu alebo interferenciu s expresiou polypeptidu v bunkách, do ktorých je nukleová kyselina zavedená. Sekvencíou zavedenej nukleovej kyseliny môže byt antisense RNA, alebo DNA sekvencia určujúca intracelulàrnu syntézu antisense RNA,Iným spôsobom dosiahnutia takejto inhibície je zavedenie takej sekvencie do buniek, ktorá určuje syntézu ribozýmu,ktorý potom špecificky štiepi mRNA potrebnú na syntézu polypeptidu, ktorého expresia má byt inhíbovaná.Zistilo sa, že čas podávania nukleovej kyseliny (vo vzťahu k štádiu reprodukčného cyklu) veľmi ovplyvňuje účinnost absorpcie nukleovej kyseliny. Ďalej sa zistílo, že vo všeobecnosti, aby sa získal optimálny stupeň absorpcie podanej nukleovej kyseliny, je nevyhnutné, aby k podaniu došlo v období po ovulácii až do dňa, vrátane dňa, ked je hladina progesterónu v krvi najvyššia. Za normálnych o SK 288119 B 6kolností je hladina progesterónu najvyššia v období podobnom s tým obdobím, ked v prípade prítomnosti embrya v matemici môže dôjsť k implantácii.Ďalej bolo napríklad zistené, že maximálna absorpcia podanej DNA u myšieho endometria sa vyskytuje na 2. až 3. deň cyklu (za l. deň sa považuje deň, ked sa po prvý raz detegovala vaginálna zátka). U ľudí sa ovulácia bežne vyskytuje na 14. deň cyklu a k implantácii obvykle dochádza v strede luteálnej fázy (hoci presné časové vyjadrenie u ľudí je iba nedostatočne určené).Nukleová kyselina sa môže podávať v nahej forme, alebo môže byt naviazaná alebo asociovaná s inými látkami,napríklad lipozómami. Bez problémov je nukleová kyselina zavedená do buniek cicavčieho recipienta jednoduchou transfekciou (s alebo bez lipozómov), pri ktorej sa zistilo,že je prekvapujúco účinná bez toho, aby bolo potrebné zavedenie prostredníctvom vírusového vektora. Napriek tomu, virusové vektory môžu byť žiaduce, najmä tie, ktoré môžu byt namierená do určitých typov buniek (napriklad,ako je to publikované vo W 0 93120221).Nukleová kyselina bude jednoducho zavedená ako časť konštruktu, napríklad plazmidu, kozmidu a podobne, pričom konštmkt výhodne obsahuje promotór, použiteľný u cicavca, aby sa spôsobila transkripcia pri najmenšom V častí zavedenej nukleovej kyseliny. Promotór môže byt konštitutívny, alebo výhodnejšie indukovateľný, takže umožňuje väčšiu kontrolu expresie zavedenej sekvencíe.V jednom zvláštnom postupe uskutočnenom podľa tohto vynálezu, zavedenie molekuly nukleovej kyseliny do endometriálnych buniek samičieho cicavčieho jedinca umožňuje zvýšenie a zníženie fertility jedinca. Vynález možno použit zvlášť pri poskytnutí spôsobu kontracepcie u domácich zvierat (napríklad u mačiek a psov), na zabránenie neželaných vrhov. Za iných podmienok vynález poskytuje spôsob zvýšenia fertility u úžitkových zvierat, u prasiat, teliat, ovcí, a podobne.Výhodne je nukleová kyselina zavedená do reprodukčného traktu cez vagínu, čím sa predíde potrebe invazívnych chirurgických techník. Ale v prípade, že je to nutné, je možnost priameho zavedenia nukleovej kyseliny do repodukčného traktu pomocou chirurgických techník napríklad do matemice. Vynález poskytuje možnosť zmeniť jednu alebo viac charakteristík zavedením jednej, viacerých alebo veľkého množstva sekvencii rôznych nukleových kyselín.Z jedného hľadiska sekvencia zavedená do buniek reprodukčného traktu riadi expresiu, výhodne vo vysokých hladínách, účinného množstva cytokínu alebo rastovćho faktora, pričom účinne množstvo predstavuje čast molekuly, ktorá si ponecháva biologickú účinnost ako celok,napríklad väzbu na špecifický ligand, a podobne. Príkladmi takýchto polypeptidov, ktoré by mohli byť exprimovane zavedením sekvencie sú, ale bez ohraničenia, nasledovné polypeptidy interleukíny, leukémiu inhibujúci faktor (LIF),vaskulámy endoteliálny rastový faktor (VEGF), epidennálny rastový faktor (EGF), heparín viažuci epidermálny rastový faktor, amfiregulín, kolónie stimulujúci faktor (CSF) a faktor tumoróznej nekrózy (TNF).Z ďalšieho pohľadu môže zavedená sekvencia riadiť expresiu účinnej časti antagonistu cytokinu alebo rastového faktora, ako je IL-l receptorový antagonista. Výhodne môže byt antagonistom solubilný receptor pre cytokin alebo rastový faktor. Vhodne príklady zahrnujú solubilné receptory pre transformujúci rastový faktor (TGF)oL, fibroblastový rastový faktor (FGF), rastový faktor odvodený od doštičiek (PDGF), interleukín-6 (IL-6) a VEGF.Z ďalšieho aspektu môže zavedená sekvencia riadiť expresiu účinnej dávky polypeptidu, ktorý má imunologickýúčinok. Polypeptid môže hlavne mať imunogénny účinok,čím slúži na stimuláciu miestnej imunitnej odpovede, preto vynález možno použit ako nový spôsob imunizácie. Výhodne bude imunogénny polypeptíd antigénom z mukózneho patogénu. Pôsobením bežného mukózneho imunitného systému stimulácia tvorby protilátok v reprodukčnom systéme môže vyústit do tvorby zodpovedajúcich protilátok v distálnych mukóznych oblastiach, ako je gastrointestínálny trakt, respiračný trakt, slzne žľazy, a podobne. Výhodne však bude antigén jedným z patogénov, ktoré sú invazívne a/alebo kolonizujú reprodukčný trakt, typicky patogěnom,ktorý spôsobuje ochorenia prenášane pohlavným stykom. Príklady zahmujú take vírusy, ako sú HIV, papilloma vírusy, tj. HPV rôznych typov, chlamýdie a baktérie, napriklad N. gonarrhoea. Altematívne môže byť polypeptíd, ktorý má imunologický účinok, imunoglobulínom, alebo jeho účinnou časťou (ako napríklad Fab, Fv, alebo scFv fragment alebo protilátka s jednoduchým reťazcom). Imunoglobulín alebo jeho účinná čast môže byt namierená proti niektorým ďalším patogénom (ako je už spomenuté skôr), alebo môže byt namierená proti niektorému ďalšiemu antigénu, ako sú steroidné alebo iné hormóny. Preto imunoglobulíny alebo ich fragmenty by mohli byť exprimované lokálne, aby poskytovali ochranu pred ochorením, alebo aby regulovali fertilitu.Z ďalšieho aspektu môže zavedená sekvencia riadiť expresiu polypeptidu alebo jeho účinnej časti, ktorá má vplyv na mcnštruáciu.Okrem toho môže zavedená nukleová kyselina riadiť expresiu účinnej časti receptorovej molekuly na povrchu buniek reprodukčněho traktu. Receptorom by mohol byť receptor pre cytokin, steroidný hormón alebo rastový faktor(ako EGF receptor, TGFa receptor, alebo VEGF receptor). Mnoho receptorov je známych, ktoré sú opísané ako sirotské receptory, v ktorých nie je známy ligand, ktorý sa naväzuje na receptor. Takéto sirotské receptory sú zvláštnym predmetom záujmu farmaceutického priemyslu, keďže môžu poskytovať ciele pre nové terapeutické alebo profylaktické zlúčeniny.Na základe toho V ďalšom aspekte vynález poskytuje spôsob, ktorý charakterizuje biologické vlastnosti polypeptidu, vrátane zavedenia sekvencie kódujúcej polypeptíd,ktorý má byt charakterizovaný v bunkách reprodukčného traktu cicavca a stanovenie účinkov exprimovaného polypeptidu. Výhodne je cicavcom laboratóme zviera, ako myš a potkan. Výhodne bude polypeptidom, ktorý má byt charakterizovaný sirotský receptor a typicky najmenej čast jeho charakterizácie bude zahrňovať identifikáciu jeho ligandu. Vo všeobecnosti bude spôsob zahrňovať analýzu histologických rezov z laboratómeho zvieraťa a ich spracovanie jednou zo štandardných techník, napríklad histochemické farbenie, hybridizácia in situ, imunologicke farbenie,atď.Predkladaný vynález teda poskytuje novú altematívnu reguláciu steroidov endometriálnej funkcie, a teda reprodukčnej schopnosti alebo fertility, priamym prenosom génu in vivo. Toto možno dosiahnuť množstvom spôsobov. Napr. bunky, ktoré produkujú vylučovaný cytokin by mohli byť chránené pred syntetizovaním faktora blokovanim transkripcie a translácie s použitím promótora s antisense konštruktami alebo ribozýmami. Alternatívne možno účinok selqečného faktora blokovať receptorovými antagonistmi. Prirodzene sa vyskytujúce rozpustné receptory môžu vychytávat a neutralizovat bioaktívny ligand, čím pôsobia ako kompetitívne receptorove antagonisty. Altematívne existujú prirodzene receptorove antagonisty, napríklad ILlRa - antagonista receptoru interleukínu-l. Intraperitoneálne podávanie tohto proteínu zabraňuje implantácii blastocysty u myší (Simon et al., 1994 citované inde).Existujú významné zistenia, ktoré nasvedčujú tomu, že solubilne rastové faktory vylučované vąiíčkovodom a epitelom matemice môžu regulovať preimplantačný vývoj v embryu cicavca, priamym účinkom prostredníctvom receptorov exprimovaných v embryu (Pampfer et al., 1990,In vitro Cellular and Developmental Biology, 26, 944-948). Naopak, vyvíjajúce sa embryá produkujú rastové faktory,ktoré môžu pôsobiť autokrinným spôsobom, alebo na endometrium tak, že ovplywiujú jeho receptivitu. Napr. u myší je LIF expresia (z materských tkanív) výrazne nadregulovaná v glandulámom epiteli na 4. deň, tesne pred implantáciou. LIF má schopnosť účinkovat na preimplantačné blastocysty, ktoré exprimujú LIF receptor (LIF-R). Táto materská expresia LIF je vitálna na implantáciu, keďže u myší bez LIF nedôjde k implantácii embryi, hoci k tomu dochádza transferom na pseudogravidné jedince. (Stewart et al., 1992 citované inde).Vynálezcovia rozširujú teraz toto sledovanie na ľudí a pomocou RT-PCR ukázali, že ľudské embryá exprimujú mRNA kódujúcu LIF -R, ale samy LIF neexprimujú. LIF účinkuje naviazaním sa na nízkoañnitný receptor LIF-R. Vysokoafmitná väzba sa zvyšuje, keď LlF/LlF-R komplex interaguje so signálnym transdukčným doplnkovým proteinom gpl 30. Ľudské embryá tiež obsahujú mRNA kódujúcu tento protein (Sharkey et al., 1995, Biology of Reproductíon, 53, 955-962). Vynálezcovia tiež dokázali, že LIF sekrécia v ľudskom glandulámom epiteli je regulované steroidmi, s maximom v luteálnej fáze (okolo očakávaného času implantácíe-Chamock-Jones et al., 1994, citované inde). Okrem toho sa ukázalo, že podávanie LIF ľudským preimplantačným embryám in vitro zlepšuje vývin. Všetky tieto poznatky podporujú názor, že LlF by mohol byť pri implantácii u ľudí rovnako dôležitý ako u myši. Je jasné, že cytokíny môžu sprostredkovať dôležitú komunikáciu medzi embryom v matemici a endometríu v oboch smeroch. Predkladaný vynález dovoľuje použiť génový prenos na prerušenie alebo zvýšenie tejto komunikácie, čo vedie k novým spôsobom kontracepcie, alebo naopak k zlepšenej implantácii. Najnovšie štúdie parakiinnej a autokrínnej regulácie reprodukčnej funkcie sú limitované na opisnú analýzu s nedostatkom účinných metód modulujúcich lokálne hladiny cytokin/receptor. Poznatok prezentovaný v tejto žiadosti naznačuje, že transfekcia epitelu matemice in vitro je uskutočníteľná. Toto umožňuje experimentálnu manipuláciu s endometriom a poskytuje nove terapeutické stratégie. Práca predložená opisuje použitie reporterového génu na demonštráciu uskutočnenia uterinámeho génového prenosu in vivo. V praxi by bolo možné použit gén alebo iný DNA konštrukt, ktorý je schopný meniť funkciu matemice. Takéto príklady zahŕňajú receptorových antagonistov, napríklad IL-1 Ra, rozpustne VEGF receptory, atď., prirodzene alebo modifikované cytokíny a rastové faktory, inhibítory proteázy alebo steroidných receptorov a rôzne ribozýmové a antisense konštrukty. Táto práca ukazuje, že gény môžu byť transfekované do endometria in vivo a toto nájde uplatnenie pri rrmohých endometriálnych a placentálnych stavoch napríklad pri zlepšení implantácie u zvierat a ľudí,zabránení implantácie, t. j. kontracepcia, pri endometrióze a menorágii, hyperplázii a pri adenokarcinóme.S použitím vytvorených postupov sú získané výsledky uvedené neskôr. Demonštrujú, že génové konštrukty možno prenášať do endometria tak in vivo, u myši, ako aj in vitro a tieto konštrukty sú transkripčne a translačne aktívne.Prehľad obrázkov na výkresochVynález bude ďalej opísaný pomocou príkladov na ilustráciu a s odkazom na sprievodné obrázky, kdeobr. IA a IB predstavujú fotomilcrograiie histologických rezov myšieho endometria transfekovaného plazmidovým konštruktom (A), ktorý riadi expresiu reporterového génu B-galalctozidázy, alebo (B) podobného plazmidu bez reporterového génu. Transfekované bunky možno jasne definovať intenzívnym tmavým (modrým) sfarbením cytoplazmy, ktoré v reze B chýbaobr. 2 je fotomikrograña ľudských endometriálnych buniek in vitro, ktoré sú transformované tým istým plazmidom ako na obr. lA - tmavé (modré) sfarbenie spôsobené expresiou reporterového génu súvisí hlavne s pretrvávajúcou glandulámou štruktúrou, kým okolité bunky sa sfarbujú slabšieobr. 3 je stlpcový graf znázorňujúci výsledky CAT testu (v počtoch na skúmavku) pre endometriálne bunky úspešne transfekované génom kódujúcim chloramfenikol acetyltransferázu (pcDNA 3 CAľ) v porovnani s bunkami transfekovanými kontrolným plazmidom (pcDNA 3) aobr. 4 je stlpcový graf ukazujúci výsledky luciferázového testu (v relatívnych jednotkách svetla) pre endometriálne bunky úspešne transfekované génom kódujúcim luciferázu (pcDNA 3 LUC) v porovnaní s bunkami transfekovanými kontrolným plazmidom (pcDNA 3).Nulipary dospelé BALB/cJ myši boli umiestnené do svetlého 14 hod. svetla 10 hod. tma vypínaníe svetla o 20.00 hod. malého zverinca s kontrolovanou teplotou 22 °C a dostávali stravu pre myši a potkany (Labsure Christopher Hill Group, Poole, Dorset, UK). Boli umiestnené spolu s vazektomizovanými samcami rovnakého druhu a nasledujúce ráno boli hodnotené na prítomnost vaginálnej zátky. Predpokladanou dobou párenia bol čas o 02.00 hod., čas 0 a za l. deň sa považoval deň, ked bola zátka po prvý raz zistené. Spárené samice boli pred hodnotením umiestnené jednotlivo.Laparotómia sa uskutočnila za aseptíckých podmienok pri anestézii Metafanom (metoxyfluoran, C-Vet Ltd., Bury St. Edmunds). Rohy matemice boli exponované alebo stredne ventrálnej alebo bilaterálnej incízii. Injekcie sa podali alebo do hrany rohu v tubo-uterinnom spojí alebo do spodnej časti rohu v uterocervikálnom spojí. Opakované štúdie ukázali, že posledne spomenuté technika predstavovala najlepší spôsob podávania, v niektorých prípadoch však bola výhodnejšie 1. technika, v prípade, že bolo potrebné minimalizovať poškodenie reprodukčného traktu.injekcie lipozóm/DNA (pcDNA 3 konštrukt, reporterový gén /- B-galaktozidázy) holej DNA a kontrolných roztokov (25-100 l) boli uskutočnené inzerciou plochého hrotu Stratatipu do spodnej časti rohu. Roztoky boli predtým natiahnuté do hrotu pomocou Travesty aplikátora, ktorý sa tiež použil na kontrolu pomalého injikovania do rohu. Po injektovaní bola incízia skončené s použitím prerušovaných matracových stehov a myši sa nechali zotaviť v klietkach a dostávali stravu a vodu ad libitum.Konštrukty plazmidov Plazmidy tu opisané pomocou príkladov sú založené na báze komerčne dostupného vektora pcDNA 3 (Katalógové

MPK / Značky

MPK: A61K 48/00, A61P 15/02

Značky: kompozícia, kyseliny, výroby, nukleovej, spôsob, použitie

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/12-284119-pouzitie-nukleovej-kyseliny-kompozicia-a-sposob-jej-vyroby.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Použitie nukleovej kyseliny, kompozícia a spôsob jej výroby</a>

Podobne patenty