Zlepšený proces produkcie rekombinantného ľudského rastového hormónu

Číslo patentu: E 20684

Dátum: 20.09.2011

Autori: Kanner Dov, Schmell Eli

Je ešte 3 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Zlepšený proces produkcie rekombinantného ľudského rastového hormónu Opis Oblasť vynálezu0001 Predmet vynálezu sa vzťahuje na oblasť produkcie rekombinantného ľudského rastového hormónu (hGH).0002 Ľudský rastový hormón (hGH), tiež známy ako somatropín (INN) alebo somatotropín, je proteínový hormón produkovaný a vylučovaný somatotropnými bunkami prednej hypofýzy. Ľudský rastový hormón hrá kľúčovú úlohu pri somatickom raste v detstve a pri metabolizme v dospelosti vďaka svojim účinkom na metabolizmus bielkovín,sacharidov a Iipidov. Ľudský rastový hormón je jednoduchý polypeptidový reťazec 191 aminokyselín s dvoma disulñdovými väzbami jednou medzi Cys-53 a Cys-165, tvoriacou veľkú slučku vmolekule, adruhou medzi Cys-182 a Cys-189, tvoriacou malú slučku v blízkosti terminusu C.0003 Technológia rekombinácie DNA umožnila produkciu neobmedzeného množstva hGH v množstve rôznych sústav. Jednou ztakýchto sústav sú baktérie, napríklad E. coIi. Hoci takýto proces je dobre zavedený a široko využívaný, tak, ako každý technologický proces v ktorejkoľvek dobe, aj tento je možné stále vylepšovať.0004 Ked je rekombinantný hGH vyjadrený v bunkách E. coli ako bunkové inklúzie, tak tieto inklúzie sú obvykle rozpúšťané za prítomnosti redukčných a/alebo chaotropných činidiel, čím sa úplne renaturuje hGH, umožní správne zvinutie hGH do jeho bioaktívnej formy a zmierni tvorba zhlukov.0005 Predmet vynálezu smeruje kvýznamnej redukcii tvorby zhlukov počas produkcie hGH bez nutnosti využitia redukčných a/alebo chaotropných činidiel.0006 Z tohto hľadiska predmet vynálezu poskytuje proces produkcie ľudského rastového hormónu zahŕňajúci(i) fermentáciu ľudský rastový hormón (hGH) produkujúcich buniek E. colí(ii) regeneráciu bunkových inklúzií z buniek E. coli a rozpustenia regenerovaných bunkových inklúzií pri zásaditom pH za účelom získania rozpusteného hGH(iii) možnosť Iyofilizácie rozpusteného hGHvyznačujúci sa tým, že fermentácia prebieha v kultivačnom médiu obsahujúcom mangán,zinok, kobalt, molybdén, Vápnik, med a bór ako stopové prvky.0007 Ďalej predmet vynálezu poskytuje spôsob znižovania množstva polymérnych foriem ľudského rastového hormónu vznikajúcich počas procesu výroby ľudského rastového hormónu zahŕňajúci(i) fermentáciu ľudský rastový hormón (hGH) produkujúcich buniek E. coli(ii) regeneráciu bunkových inklúzií z buniek E. coli a rozpustenla regenerovaných bunkových inklúzií pri zásaditom pH za účelom získania rozpusteného hGH(iii) možnosť lyofilizácie rozpusteného hGHvyznačujúci sa tým, že fermentácía prebieha v kultivačnom médiu obsahujúcom mangán,zinok, kobalt, molybdén, vápnik, med a bór ako stopové prvky.0008 Proces produkcie ľudského rastového hormónu podľa tohto vynálezu zahŕňa nasledujúce kroky(i) fermentáciu ľudský rastový hormón (hGH) produkujúcich buniek E. coli(ii) regeneráciu bunkových inklúzií z buniek E. coli a rozpustenie regenerovaných bunkových inklúzií pri zásaditom pH za účelom získania rozpusteného hGH(iii) možnosť lyofilizácie rozpusteného hGHvyznačujúci sa tým, že fermentácia prebieha v kultivačnom médiu obsahujúcom mangán,zinok, kobalt, molybdén, vápnik, meď a bór ako stopové prvky. 0009 Spôsob zredukovania množstva polymérnych foriem ľudského rastového hormónu, ktoré vznikli počas procesu produkcie ľudského rastového hormónu podľa tohto vynálezu zahŕňa nasledujúce kroky(i) fermentáciu ľudský rastový hormón (hGH) produkujúcich buniek E. coli(ii) regeneráciu bunkových inklúzií z buniek E. co/i a rozpustenie regenerovaných bunkových inklúzií pri zásaditom pH za účelom získania rozpusteného hGH(iii) možnosť lyofilizácie rozpusteného hGHvyznačujúci sa tým, že fermentácia prebieha v kultivačnom médiu obsahujúcom mangán,zinok, kobalt, molybdén, vápnik, meď a bór ako stopové prvky.0010 Ľudský rastový hormón a hGH sú v tomto dokumente zameniteľné pojmy mali by byť vnímané ako zahŕňajúce rekombinantný ľudský rastový hormón so 191 aminokyselinami alebo Met-hGH so 192 aminokyselinami (napr. hGH sjedným metionínom pridaným na terminuse N).0011 Ako polymérna fonna hGH sa vtomto dokumente rozumie zahrnutie akejkoľvek formy hGH okrem hGH so 191 aminokyselinami alebo 192 aminokyselinami (hGH s jedným dodatočným metionínom na terminuse N) ako napríklad, ale nielen, diméry a oligoméry hGH.0012 Kultivačné médium vzmysle tohto .dokumentu by malo byť chápané ako obsahujúce médium fermentora a/alebo produkčné médium.0013 Stopové prvky v kultivačnom médiu môžu byť zabezpečené klasickým spôsobom,napríklad použitím obchodne dostupných solí stopových prvkov, vrátane kyselín a zásad a ich hydrátov. Môžu byť zavedené do kultivačného média vo forme tuhých solí alebo vodných roztokov obsahujúcich jednu alebo viac z týchto solí. Pri jednom uskutočnení sapridávajú vo forme roztoku stopových prvkov obsahujúceho každý stopový prvok vo vopred určenej koncentrácii. Roztok stopových prvkov môže obsahovať aj kyselinu alebo zásadu upravujúcu pH a napríklad aj na udržanie stopových prvkov v roztoku.0014 Mangán ako stopový prvok môže byť pridávaný napríklad vo forme monohydrátu síranu manganatého (MnSO 4-H 2 O). Zinok ako stopový prvok môže byť pridávaný napríklad vo forme heptahydrátu síranu zinočnatého (ZnSO 4-7 H 2 O). Kobalt ako stopový prvok môže byť pridávaný napríklad vo forme hexahydrátu chloridu kobaltnatého (CoCI 2-6 H 2 O). Molybdén ako stopový prvok môže byť pridávaný napríklad vo forme dihydrátu molybdenanu sodného (Na 2 MoO 4-2 H 2 O). Vápnik ako stopový prvok môže byť pridávaný napríklad vo forme dihydrátu chloridu vápenatého (CaCl 2-2 H 2 O). Med ako stopový prvok môže byť pridávaná napríklad vo forme pentahydrátu síranu meďnatého (CuSO 4-5 H 2 O). Bór ako stopový prvok môže byť pridávaný napríklad vo forme kyseliny boritej (H 3 BO 3). Môže sa pridávať ako stopový prvok aj železo.0015 Stopové prvky sú prítomné v kultivačnom médiu v nasledujúcich intervaloch koncentrácie (vztiahnutej na celkový objem kultivačného média) (interval) avjednom uskutočnení sú prítomné v uvedených konkrétnych koncentráciách (uskutočnenie)stopový prvok interval (M) uskutočnenie (M) mangán 4,4-5,4 4,90016 Vjednom uskutočnení sú stopové prvky aplikované v roztoku pridávanom do kultivačného média. V tomto uskutočnení je roztok stopových prvkov výhodne koncentrovaným vodným roztokom obsahujúcim stopové prvky v koncentrácii, v ktorej pri použití s kultivačným médiom sa dosahujú vyššie uvedené intervaly koncentrácie.0017 Vjednom uskutočnení je roztok stopových prvkov pridávaný do kultivačného média v pomeroch od 0,1 do 10 mI/l, vychádzajúc z celkového objemu kultivačného média, alebo od 0,2 do 5 mI/l, alebo od 0,5 do 1 mI/l, alebo približne pri 0,8 ml/I.0018 Ked sa pridá roztok stopových prvkov do kultivačného média v pomere približne 0,8 mI/I, tak môže obsahovať 1 g/I monohydrátu síranu manganatého. Tiež môže obsahovať 2,8 g/I heptahydrátu síranu zinočnatého. Tiež môže obsahovať 2 g/l hexahydrátu chloridu kobaltnatého. Tiež môže obsahovať 2 g/l dihydrátu molybdenanu sodného. Tiež môže obsahovať 3 g/l dihydrátu chloridu vápenatého. Fež môže obsahovať 1,85 g/l pentahydrátu síranu meďnatého. Tiež môže obsahovať 0,5 g/l kyseliny boritej. Pri jednom uskutočnení roztok stopových prvkov obsahuje každý z vyššie uvedených stopových prvkov vo vyššie uvedených koncentráciách.0019 Ked prebieha fáza fermentácie vo viac než jednom kroku, napr. ked sa pripravuje očkovacia kultúra v očkovacom fermentore a potom sa posúva do produkčného fermentora,stopové prvky podľa tohto vynálezu sa aplikujú aspoň pri jednom z krokov, alebo pri viacnež jednom kroku, alebo pri každom kroku fermentácie.0020 Zásadíté pH vzmysle tohto dokumentu zahŕňa hodnoty pH v intervale od 10 do 12,5. Zjedného zretela je alkalické pH približne rovné 12.0021 Ďalej sa predpokladá, že krok (ii), teda regenerácia bunkových inklúzii a ich rozpúšťanie pri zásaditom pH sa dejú bez použitia redukčných alebo chaotropných činidiel. 0022 Redukčné činidlo vzmysle tohto dokumentu sa chápe ako zahŕňajúce činidlo schopné redukovať bielkovinové väzby Cys-Cys. Nie vyčerpávajúcimi prikladmi redukčných činidiel sú ditiotreitol (DTT), B-merkaptoetanol, cysteín a glutatión.0023 Chaotropné činidlo vzmysle tohto dokumentu sa chápe ako zahŕňajúce také činidlo, ktoré narúša trojrozmernú štruktúru takých makromolekúl ako bielkoviny, a ktoré ich denaturuje. Nie vyčerpávajúcimi prikladmi chaotropných činidiel sú močovina, guanidín,tiomočovina a chloristan lítny.0024 Krok (iii) procesu podľa vynálezu je voliteľný je možné ho vykonať, ak sa vyžaduje produkcia hGH vtuhej forme. Vjednom uskutočnení zahŕňa krok (iii) podkrok čistenia rozpusteného hGH pred Iyoñlizáciou. Obdobne je možné podkrok čistenia zaradiť do kroku(ii) v prípade, že sa neuskutočňuje lyoñlizácia.0025 Ďalej je vynález opisovaný vnasledujúcich príkladoch, ktoré nie sú žiadnym spôsobom koncipované ako obmedzujúce predmet vynálezu tak, ako je tento nárokovaný.0026 Produkcia hGH pozostáva z postupov v odbore dobre známych, vrátane fermentácie azberu hGH produkujúcich buniek E. colí, regenerácie a rozpúšťania bunkových inklúzii a čistenia a lyotilizácie hGH.0027 Proces fermentácie hGH pozostáva ztroch krokov vykonaných postupne v pretrepávacej banke, očkovacieho fermentora a produkčného fermentora. Parametre fermentácie, teplota, miešanie, prevzdušňovanie, tlak, pH a kyslík sú regulované v plnom rozsahu systémom, ktorý tiež reguluje spotrebu glukózy a amoniaku.0028 ~ 1 ml E. coli vyjadrujúcich hGH (číslo ATCC 39384) bolo naočkovaných do banky obsahujúcej 200 ml rastového média (20 g/l hydrolyzátu kazeínu, 10 g/l kvasnicového extraktu, 5 g/l NaCl a 100 mg/I sodnej soli ampicilínu). Banka bola vložená na ~ 6 hodín do rotačnej trepačky pri ~ 30 °C pri -250 ot/min. Po uplynutí tejto doby mala kultúra optickú hustotu pri 660 nm (OD) približne ~ 4. Vypočítané množstvo očkovacej kultúry bolo naočkované do očkovacieho fermentora.

MPK / Značky

MPK: C12N 1/20, C07K 14/61, C12N 1/38

Značky: rekombinantného, proces, ľudského, rastového, zlepšený, produkcie, hormonu

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/11-e20684-zlepseny-proces-produkcie-rekombinantneho-ludskeho-rastoveho-hormonu.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Zlepšený proces produkcie rekombinantného ľudského rastového hormónu</a>

Podobne patenty