Pyruvátkarboxylázový gén, génová štruktúra, vektor a transformovaná bunka s jeho obsahom, spôsob mikrobiálnej prípravy aminokyselín aspartátovej a glutamátovej skupiny a jeho použitie

Číslo patentu: 284235

Dátum: 02.11.2004

Autori: Peters-wendisch Petra, Sahm Hermann, Eikmanns Bernd

Je ešte 3 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Je opísaný spôsob mikrobiálnej prípravy aminokyselín aspartátovej a/alebo glutamátovej skupiny, pri ktorom je zvýšená aktivita pyruvátkarboxylázy genetickou modifikáciou enzýmu a/alebo zvýšená expresia pyruvátkarboxylázového génu v produkčnom mikroorganizme. Ďalej sú opísané pyruvátkarboxylázový gén, génová štruktúra, vektor a transformovaná bunka s jeho obsahom.

Text

Pozerať všetko

Vynález sa týka pyruvátkarboxylázového génu, génových štruktúr, vektorov a transforrnovaných buniek s jeho obsahom, spôsobu mikrobiálnej prípravy aminokyselín aspartátovej a/alebo glutamátovej skupiny a jeho použitia.Aminokyseliny sú hospodársky veľmi zaujímavé, pričom použitie aminokyselín je mnohostranné. Tak napríklad L-lyzín, ako aj L-treonín, L-metionín a L-tryptofán sa používajú ako prísady do krmiva, L-glutamát ako prísada do korenín, L-izoleucín a L-tyrozín vo farmaceutickom priemysle, L-arginín a L-izoleucín ako liečivo, alebo L-glutamát, L-aspartát a L-fenylalanín ako východisková látka pri syntéze špeciálnych chemikálií.Výhodným spôsobom prípravy týchto nąirozličnejších aminokyselín je biotechnologická príprava prostredníctvom mikroorganizmov pretože týmto spôsobom sa získa priamo biologicky účinná a opticky aktívna forma príslušnej aminokyseliny a dajú sa použiť jednoduché a lacné suroviny. Ako mikroorganizmy sa používajú napríklad Corynebacterium glutamícum a jeho príbuzné poddruhyjlavum a actufermentum (Liebl a kol., Int. J. System. Bacteriol. 4, 255 až 260, 1991), ako aj Escherichia colz a príbuzné baktérie.Tieto baktérie produkujú aminokyseliny normálne, ale len v množstve, ktoré je potrebné k rastu, takže sa nevytvárajú a nevylučujú žiadne nadbytočné aminokyseliny. To je spôsobené tým, že V bunke je biosyntéza aminokyselín kontrolovaná mnohými spôsobmi. V dôsledku toho sú už známe najrozličnejšie postupy, ako zvýšiť tvorbu produktov vyradením kontrolných mechanizmov. Pri týchto procesoch sa napríklad používajú analógy aminokyselín, aby sa vyradila účinná regulácia biosyntězy. Tak je napríklad opisaný spôsob, pri ktorom sa používajú Corynebacterium kmene, ktoré sú rezistentné proti analógom L-tyrozínu a L-fenylalanínu (JP 19037/1976 a 39517/1978). Taktiež sú opísané spôsoby, pri ktorých sa používajú baktérie, rezistentné proti analógom L-lyzínu alebo tiež L-treonínu, aby sa prekonali kontrolné mechanizmy (EP 0 205 849, GB 2 152 509).Ďalej sú známe mikroorganizmy, skonštruované technikami rekombinantnej DNA, pri ktorých sa taktiež zruší regulácia biosyntézy tým, že gény, ktoré kódujú kľúčové enzýmy, ktoré už nie sú inhibované spätnou väzbou, sa klonujú a exprimujú. Tak je napríklad známa rekombinantná baktéria, produkujúca L-lyzín, s plazmidom kódovanou,proti spätnej väzbe rezistentnou aspartátkinázou (EP 0 381 527). Taktiež je opísaná rekombinantná baktéria, produkuj úca L-fenylalanín, s proti spätnej väzbe rezistentnou prefenátdehydrogenázou (JP 123475/1986, EP 0 488 424).Okrem toho sa aj nadexpresiou génov, ktoré nekódujú na spätnú väzbu citlivé enzýmy syntézy aminokyselinygdosiahli zvýšené výťažky aminokyselín. Tak sa napríklad tvorba lwinu zlepší zvýšenou syntézou dihydrodipikolinátsyntázy (EP 0 197 335). Taktiež sa zvýšenou syntézou treonindehydratázy dosiahne zlepšená tvorba izoleucínu (EP 0 436 886).Ďalšie pokusy o zvýšenie produkcie aminokyselín sa zameríavajú na zlepšenú pripravenosť bunkových primárnych metabolitov centrálnej látkovej výmeny. Tak je známe, že rekombinantnými technikami dosiahnutá nadexpresia transketolázy umožňuje zlepšenú produkciu L-tryptofánu, L-tyrozínu alebo L-fenylalanínu (EP 0 600 463). Ďalej, zníženie aktivity fosfoenolpyruvátkarboxylázy v Corynebaclerium vedie k zlepšenej tvorbe aromatických amino kyselín (EP 0 331 145), naproti čomu zvýšenie aktivity fosfoenolpyruvátkarboxylázy v Corynebacterium viedlo k zvýšenému vylučovaniu aminokyselín aspartátovej skupinyPočas rastu a špeciálne pri podmienkach tvorby aminokyselín sa cyklus trikarboxylových kyselín (citrátový cyklus) musí kontinuálne a účinne doplnit C 4-zlúčeninami,napríklad oxalacetátom, aby sa nahradili medziprodukty, odobraté na biosyntézu aminokyselín. Až donedávna sa predpokladalo, že za tieto takzvané anapleroticke funkcie v Corynebacterium je zodpovedná fosfoenolpyruvátkarboxyláza (Kinoshita, Biology of industrial microorganisms(Biológia priemyselných mikroorganizmov), str. 115 - 142,Benjamin/Cummings Publishing Company, Londýn 1985 Liebl, The prokaryotes II (Prokaryoty Il), str. 1157 - 1171,Springer Verlag N. Y. 1991 Vallíno a Stephanopoulos,Biotechnol. Bioeng. 41, 633 - 646, 1993). Zistílo sa však,že fosfoenolpyruvátkarboxyláza-negatívne mutanty v porovnaní s príslušnými východískovými kmeňmí rástli rovnako na všetkých testovaných médiách (Peters-Wendisch a kol., FEMS Microbiology Letters ými kmeňmí rástli rovnako na všetkých testovaných médiách (Peters-Wendisch a kol., FEMS Microbiology Letters 112, 269 - 274, 1993 Gubler a kol., Appl. Microbiol. Biotechnol. 40, 857 - 863,1994). Tento výsledok ukázal, že fosfoenolpyruvátkarboxyláza nie je podstatná pre rast a pre anaplerotické reakcie nehrá žiadnu alebo len podradnú úlohu. Okrem toho uvedený výsledok poukázal na to, že v Carynebacterium musí byt prinajmenšom jeden ďalší enzým, ktorý je zodpovedný za syntézu oxalacetátu, ktorý je potrebný k rastu. Prednedávnom sa aj skutočne zistila pyruvátkarboxylázová aktivita v permeabilizovaných bunkách Corynebacterium glutamicum (Peters-Wendisch a kol., Microbiology 143,1095 - 1103, 1997). Tento enzým sa účinne inhibuje AMP,ADP a acetylkoenzýmom A a v prítomnosti laktátu sa ako zdroj uhlíka tvorí vo zvýšenom množstve. Existenciu pyruvátkarboxylázy v Corynebacterium glutamicum dokázala,resp. potvrdila aj ďalšia pracovná skupina pomocou 13 CNMR spektroskopie a GS-MS (Park a kol., Appl. Microbiol. Biotechnol. 47, 430 - 440, 1997). Pretože sa muselo vychádzať z toho, že tento enzým je v prvom rade zodpovedný za doplnenie cyklu trikarboxylových kyselín pri raste, dalo sa očakávať, že zvýšenie génovej expresie, resp. enzýmovej aktivity bud nepovedie k žiadnemu, alebo len k malému zvýšeniu tvorby aminokyselín, patriacich k aspartátovej skupine. Okrem toho sa očakávalo, že zvýšenie génovej expresie, resp. enzýmovej aktivity pyruvátkarboxylázy taktiež nebude mat žiadny vplyv na produkciu aminokyselín iných skupín.Podstatou vynálezu je spôsob mikrobiálnej prípravy aminokyselín asparátovej a/alebo glutamátovej skupiny, V ktorom sa zvýši pyruvátkarboxylázová aktivita genetickým pozmenením tohto enzýmu a/alebo sa zvýši pyruvátkarboxylázová génová expresia mikroorganizmu, ktorý produkuje zodpovedajúcu aminokyselinu. Ukázalo sa, že najmä kmene so zvýšeným počtom kópií pyruvátkarboxylázového génu vylučujú do kultivačného média asi o 50 viac lyzínu, 40 viac treonínu a 150 viac homoserínu. Ďalej sa ukázalo, že prekvapujúco sa významne zvýšila aj produkcia glutamátu (porovnaj najmä príklad uskutočnenia pod 6 a tabuľku 4).Genetické pozrnenenie pyruvátkarboxylázy na zvýšenie enzýmovej aktivity sa výhodne uskutočňuje mutáciou en SK 284235 B 6dogénneho génu. Takéto mutácie sa môžu vytvoriť buď podľa klasických metód necielene, ako napríklad UV-ožarovanim alebo mutácie vyvolávajúcimi chemikálianu, alebo cielene pomocou metód génových technológií, ako je delécia, inzercia aJalebo výmena nukleotidov.Pyruvátkarboxylázová génová expresia sa zvýši zvýšenim počtu génových kópií a/alebo zosilnením regulačných faktorov, ktoré pozitívne ovplyvňujú expresiu génu. Tak sa zosilnenie regulačných prvkov môže výhodne uskutočniť na úrovni transkripcie tým, že sa zvýšia najmä transkripčné signály. To sa môže uskutočniť napríklad tým, že sa zmenou promótorovej sekvencie, predradenej pred štruktúmy gén, zvýši účinnost promótora, alebo tým, že sa promótor kompletne zamení účínnejšími promótormi. Zosilnenie transkripcie sa tiež môže uskutočniť zodpovedajúcim ovplyvnením regulačného génu, priradeného pyruvátkarboxylázovému génu. Okrem toho sa pripadne môže účinnost viazania regulačného proteínu na DNA pyruvátkarboxylázověho génu, ktorý sa má regulovať, ovplyvniť mutácíou regulačnej génovej sekvencie tak, že sa tým transkripcia zosilni a tým sa génová expresia zvýši. Okrem toho ale môžu byt pyruvátkarboxylazovému génu ako regulačné sekvencie priradené aj takzvané zosilňovače transkripcie,ktore prostrednictvom zlepšenej interakcie medzi RNA-polymerázou a DNA taktiež spôsobia zvýšenú pyruvátkarboxylázovú génovú expresiu. Popritom je ale tiež možné zosilnenie translácie tým, že sa napriklad zlepší stabilita m-RNA.Na zvýšenie počtu génových kópií sa pyruvátkarboxylázový gén zabuduje do génového konštruktu, resp. vektora. Génový konštrukt obsahuje najmä regulačná sekvencie,priradené pyruvátkarboxylázovému génu, výhodne také,ktoré zosilňujú génoiní expresiu. Na zabudovanie pyruvátkarboxylázového génu do génovćho konštruktu sa gén ízoluje výhodne z kmeňa mikroorganizmu rodu Corynebacterium a transformuje sa do kmeňa mikroorganizmu,ktorý produkuje aminokyseliny, najmä Carynebacterium alebo Escherichia call, alebo Serratia marcescens. Pre spôsob podľa tohto vynálezu sú vhodné najmä gény z C. glutamicum alebo C. glutamicum ssp. flavum, alebo C. glutamicum ssp. lactofermentum. Po izolovani génu a in vitrorekombinácii so známymi vektormi (pozri napríklad B. Simon a kol., Bio/Technology l, 784 - 791, 1983 Eikmanns a kol., Gene 102, 93 - 98, 1991) sa uskutoční transformácia do kmeňov, ktoré produkujú aminokyseliny, elektroporáciou (Liebl a kol., FEMS Microbiology Letters 65, 299 až 304, 1991) alebo konjugáciou (Schäfer a kol., J. Bacteriol. 172, 1663 - 1666, 1990). Ako materské kmene sa výhodne použijú taki producenti aminokyselín, ktorí sú v syntéze zodpovedajúcej aminokyseliny deregulovaní a/alebo ktorí majú zvýšenú aktivitu exportných nosičov pre zodpovedajúcu aminokyselinu. Ďalej sa uprednostňujú také kmene,ktoré obsahujú zvýšený podiel takých metabolitov centrálnej látkovej výmeny, ktoré sa podieľajú na syntéze zodpovedajúcej aminokyseliny, a/alebo kmene, ktoré obsahujú znížený podiel takých metabolitov centrálnej látkovej výmeny, ktoré sa nepodieľajú na syntéze zodpovedajúcej aminokyseliny, najmä metabolítov, ktoré zodpovedajú za konkurenčné reakcie t. j. uprednostňujú sa take kmene, pri ktorých cesta biosyntézy, konkurujúca ceste biosyntézy prislušnej aminokyseliny, prebieha so zníženou aktivitou. Tak je najmä vhodný kmeň mikroorganizmu druhu Corynebacteríum so zníženou citrátsyntázovou aktivitou, rezistentný proti B-metylesteru kyseliny L-asparágovej (AME) (EP o 551 614).Po izolovani sa dajú ziskat pyruvátkarboxylázové gény s nukleotidovými sekvenciami, ktoré kódujú aminokyseli novú sekvenciu, uvedenú pod SEQ ID No. 2 alebo jej alelové variácie, resp. ktoré majú nukleotidovú sekvenciu od nukleotidu 165 po 3587 podľa SEQ 1 D No. 1 alebo v podstate rovnako účinkujúcu DNA-sekvencíu. Okrem toho sa dajú získat gény s predradeným promótorom nukleotidovej sekvencie od nukleotidu 20 po 109 podľa SEQ ID No. 1 alebo v podstate rovnako účinkujúcou DNA-sekvenciou. Alelové variácie, resp. rovnako účinkujúce DNA-sekvencie zahmujú najmä funkčné deriváty, ktoré sa dajú ziskat deléciou(ami), inzerciou(ami) a/alebo substitúciou(ami) nukleotidov, pričom enzýmová aktivita, resp. funkcia zostáva zachovaná, alebo sa dokonca zvýši. Tieto pyruvátkarboxylázové gény sa výhodne použijú V spôsobe podľa tohto vynálezu.1( pyruvátkarboxylázovému génu s predradeným promótorom alebo bez neho, resp. s priradeným regulačným génom alebo bez neho sa môže predradit a/alebo na konci zaradit jedna alebo viaceré DNA-sekvencie tak, že tento gén bude obsiahnutý v génovej štruktúre.K pyruvátkarboxylázovému génu je výhodne predradený tac-promótor (tacIQ-gén), pričom tomuto sú priradené najmä regulačné sekvencie.Klonovanim pyruvátkarboxylázového génu sa dajú ziskat plazmidy, ktoré tento gén obsahujú a sú vhodné na transformáciu producenta aminokyseliny. Transformáciou získateľné bunky, pri ktorých ide výhodne o transformovane bunky Caiynebacterium, obsahujú tento gén v replikovateľnej forme, t. j. v dodatočných kópíách na Chromozóme, pričom tieto kópie génu sa rekombináciou integrujú na ľubovoľných miestach genómu a/alebo na plazmide, alebo vektore.Prehľad obrázkov na výkresochNa obr. 1 je znázomené fyzikálne mapovanie fragmentu. Na obr. 2 je znázomená fyzikálna mapa plazmidu.1. Klonovanie pyruvátkarboxylázovćho génu z Corynebacterium glutamicumVychádzajúc z konzervovaných oblastí všetkých doteraz známych pymvátkarboxylázových (pyc-)génov zo Saccharomyces cerevisiae ( J. Biol. Chem. 263, 11493 - 11497,1988 Mol. Gen Genet. 229, 307 - 315, 1991), človeka(Biochim. Biophys. Acta 1227, 46 - 52, 1994), myši (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 1766 - 1770, 1993), Aedes aegypti (EMBL-GenBank Accession Nr. L 36530), ako aj z Mycabacteríum tuberculosís (EMBL-GenBank Accession Nr. U 00024) sa syntetízovali PCR-priméry (MWG Biotech). Tieto priméry zodpovedali bázam 810 až 831 a 1015 až 1037 pyc-génu z M. tuberculosis. S týmito prímérmi sa prostredníctvom PCR podľa štandardnej metódy lnnisa a kol. (PCR protocols. A guide to methods and applications(PCR protokoly. Návod k metódam a aplikáciám), Academic Press 1990) pre nedegenerované, homologické priméry dal amplitikovat fragment asi 200 bp z chromozomálnej DNA z C. glutamícum ATCC 13032, ktorá sa izolovala, ako opisali Eikmanns a kol. (Microbiology 140, 1817 až 1828, 1994). Veľkost 200 bp zodpovedala očakávaniu pre pyc-gén. PCR-produkt sa sekvenoval, ako opisali Sanger a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 - S 467, 1977). Sekvenovanie sa uskutočnilo s fluorescenčne označenýmiddNTP automatickou aparatúrou na sekvenovanie DNAvychádzajúc z tohto DNA-fragmentu z C. glutamicum sa pripravili nasledujúce homologické oligonukleotidyOligonukleotidy sa použili ako PCR-priméry na izolovaníe sondy pre gén pyruvátkarboxylazy (pyc) z C. glutamicum. Tieto priméry sa použili v PCR-reakcii s chromezomálnou DNA z C. glutamicum a digitoxigeninom značkovanými nukleotidmi. Táto reakcia sa uskutočnila podľa predpisu PCR DIG Labeling Kits (PCR DIG značkovacie súpravy) firmy Boehringer Mannheim. S týmto zložením sa dal ampliñkovať digitoxigenínom značkovaný DNA-fragment, ktorý zodpovedal očakávanej veľkosti 200 bp. Takto pripravená pyc-sonda sa potom použila, aby sa cez hybrídizáciu Southernovým prenosom identifikoval DNA-fragment v chromozomálnej DNA z C. glutamicum, na ktorom je lokalizovaný pyc-gén. Na to sa vždy 2 až 5 g chromozomálnej DNA z C. glutamicum WT rozštiepílo reštrikčnými enzýmami Hindlll, Sphl, Sall, Dral, EcoRl a BamHl, získané DNA-fragmenty sa 16 h pri 20 V gélelektroforeticky rozdelili v 0,8 agarózovom gélí zodpovedajúce svojej veľkosti. DNA-fragmenty, ktoré sa nachádzali v agarózovom géli, sa metódou Southema (J. Mol. Biol. 98, 503- 517, 1975) denaturovali a pomocou vákua preníesli VacuGene Blot aparatúrou od firmy Phannacia LKB (Uppsala, Švédsko) z gélovej matrice na nylonovú membránu(Nytran N 13 od firmy Schleicher a Schüll, Dasscl, Švajčiarsko), imobilizovali a digitoxigeninove značenie sa dokázalo alkalíckou fosfatázou prostredníctvom NBT/X-fosfátovej reakcie. Týmto spôsobom sa podarilo dokázať nasledujúce, s pyc-DNA-sondou hybridizujúce chromozomálne fragmenty 17 kb HindIII-fragment, 6,5 kb SalI-fragment a 1,35 kb ECoRI-fragment.17 kb HindIII-fragment sa izoloval a subklonoval. Na to sa V kozmide pHC 79 použila kozmídová génová banka z chromozomálnej DNA z C. glutamícum, ktorá reprezentovala genóm C. glutamicum na 99 (Mol. Mícrobiol. 6,317 - 326, 1992). E. colí kmeň DHSa sa s touto génovou bankou transformoval prostredníctvom CaClz-metódy od Sambrooka a kol. (Molecular Cloning, A laboratory manual(Molekulové klonovanie, Laboratóme návody), Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989) a naniesol sa na platne po asi 300 kolónií na LB-agarovú platňu s 50 g/I kanamycínu (spolu 5000 kolónií). Potom sa získané transforrnandy preníesli na Nytran Nl 3-ñ 1 ter a tieto sa na alkalickú lýzu buniek a denaturáciu DNA inkubovali 5 minút na Whatmannovom papieri, nasiaknutom 0,5 M NaOH a 1,5 M NaCl. Potom nasledujúca neutralizácia sa uskutočnila s l M Tris/HCl, pH 7,5, a 1,5 M NaCl. Po inkubácii filtrov vo 2 x SSC sa uvoľnená DNA fixovala na filtri UV-ožiarenim pri 366 nm, Potom sa ostatné zvyšky buniek odstránili trepaním v 3 x SSC, 0,1 SDS pri 50 °C. Filtre sa použili v tejto forme na hybridizáciu so špecifickou pyc-sondou, ako opísal Southem (J. Mol. Biol. 98, 503 - 517,1975). ldentífikovalí sa 3 transformandy, ktoré hybridizovali proti pyc-sonde. Z týchto transformandov sa izolovala kozmidová DNA pomocou prípravy plazmidu metódou alkalíckej lýzy podľa Bimboima (Meth. Enzymol. 100, 243 až 255, 1983) a potom sa cez reštrikciu a analýzu Southernovým prenosom testovala na prítomnost HindIII-fragmentu. Kozmid pHC 79-10, ktorý obsahoval 40 kb inzert,niesol úplne 17 kb HindIII-fragment a ďalej sa analyzoval. Ukázalo sa, že aj po reštrikcii s endonukleázami Sall a EcoRl sa získali rovnaké hybridizujúce fragmenty ako v chromozomàlnej DNA, t. j. 6,5 kb Sall- a 1,35 kb EcRl-fragment 17 kb Hindlll-fragment sa reštríkciou s Híndlll izoloval z kozmidu a naviazal sa do E. colí vektora pUC 18,ktorý sa taktiež rozštiepil pomocou Hindlll. Vypracovala sa reštrikčná analýza fragmentu vo výslednom vektore pUC pyc. Fyzikálne mapovanie fragmentu je znázomenć na obr. 1.V ďalších krokoch subklonovania sa izolovali 0,85 kb Sall-EcoRl-fragment, 1,35 kb EcoRI-fragment, 1,6 kb Ecokl-EcoRl-Stul-fragment, ako aj 1,6 kb Clal-fragment,ktorý sa čiastočne prekrýval s uvedeným 0,85 kb SallEcoRI-fragmentom, reštrikciou so zodpovedajúcimi reštrikčnými enzýmami z plazmidu pUCpyc. Naviazaním sa tieto fragmenty klonovali do príslušne reštringovaného vektora pUC 18 a následne sa sekvenovali podľa Sangera a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 - 5467, 1977), ako je opísané. Získané nukleotidové sekvencie sa analyzovali programovým balíkom HUSAR (Release 3.0) od Deutsche Krebsforschungszentrum (Nemecké centrum pre výskum rakoviny) (Heidelberg). Sekvenčná analýza fragmentov poskytla priebežný otvorený čítací raster 3576 bp,ktorý kóduje proteínovú sekvenciu 1140 aminokyselín. Porovnanie odvodenej proteínovej sekvencie s EMBL génovou databankou (Heidelberg) ukázalo podobnosti so všetkými známymi pyruvátkarboxylázami. Najvyššia identita(62 ) sa zistila k zdanlivej pyruvatkarboxyláze z Mycobacterium tuberculosis (EMBL-GenBank Accession Nr. U 00024). Táto podobnosť bola pri zohľadnení konzervovaných výmen aminokyselín 76 . Porovnanie s pyruvátkarboxylázami iných organizmov dalo 46 až 47 identických a 64 až 65 podobných aminokyselín (Gene 191, 47 - 50,1997 J. Bacteríol. 178, 5960 - 5970, 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1766 - 1770, 1993 Biochem. J. 316, 631 až 637, 1996 EMBL-GenBank Accession Nr. L 36530 J. Biol. Chem. 263, 11493 - 11497, 1988 Mol. Gen Genet. 229, 307 - 315, 1991). Z týchto výsledkov sme prišli k záveru, že klonovaný fragment nesie gén pre pyruvátkarboxylázu z C. glutamícum. Nukleotidová sekvencia tohto génu je uvedená pod SEQ ID No. l a zodpovedajúca aminokyselínová sekvencia pod SEQ ID No. 2.S cieľom nadexpresie gćnu pre pyruvátkarboxylázu z C glutamicum sa gén z plazmidu pUCpyc klonoval ako 6,2 kb Sspl-Scal-fragment do E. colí-C. glutamicum-pendelvektora pEKO (Gene 102, 93 - 98, 1991), ktorý sa rozštiepil reštrikčnými endonukleázami EcoRI a Pstl. Pomocou pôsobenia Klenowovej polymerázy sa vyčnievajúce konce doplnili (EcoRI), resp. natrávili (Pstl) na hladké konce a linearizovaný vektor sa naviazal na 6,2 kb Sspl-Seal-fragment. Získaný konštrukt pEKOpyc sa potom transfomioval do kmeňa E. colí DHSa, plazmidová DNA na získaných transfonnandoch sa izolovala a skontrolovala sa na správnosť inzertu reštrikciou. Táto DNA sa potom vniesla do kmeňa SP 733 elektroporáciou (FEMS Microbiol, Lett. 65,299 - 304, 1989). Pri tomto kmeni ide o mutant reštrikčne negatívneho C. glutamícum kmeňa R 127 (Dechema Biotechnology Conference 4, 323 - 327, Verlag Chemie 1990),ktorý sa získal chemickou mutagenézou a vyznačuje sa tým, že nemôže na minimálnom médiu s pyruvátom a laktátom rásť ako jediný zdroj uhlíka (Microbiology 143, 1095 až 1103, 1997). Tento fenotyp sa vyvolá defektom v pyruvátkarboxyláze a vnesením pyruvátkarboxylázového génu z C. glutamicum sa dal komplementovať, t. j. kmeň, ktorý nesie plazmid pEKOpyc, bol na rozdiel od východiskového kmeňa opäť schopný na minimálnom médiu s laktátom rásťako jediný zdroj uhlíka. Tým sa aj priniesol dôkaz, že tento gén kóduje funkčnú pyruvátkarboxylázu.Okrem toho sa plazmid pEKOpyc elektroporáciou transformoval do C. glutamicum štandardného typu ATCC 13032. Výsledný kmeň WT (pEKOpyc) sa skúmal v porovnaní so štandardným typom ATCC 13032, čo sa týka jeho pyruvátkarboxylázovej aktivity. Kmene sa kultivovali v komplexnom médiu (Luría-Bertani, Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989) s 0,5 laktátu a na minimálnom médiu s 2 laktátu, resp. 4 glukózy, a uskutočnil sa pyruvátkarboxylázový test podľa metódy, ktorú opísali Peters-Wendisch a kol.(tabuľka 1) ukazuje, že pyruvátkarboxylázová aktivita v kmeni, ktorý nesie pEKOpyc, je asi 4-krát vyššia než vo východiskovom kmeni.4. Zvýšená akumulacia lyzinu nadexpresiou pyruvátkarboxylázového génu v kmeni C. glutamicum DG 52-5Na skúmanie účinku nadexpresie génu pre pyruvátkarboxylázu v kmeni DG 52-5, produkujúcom lyzín (J. Gen. Microbíol. 134, 3221 - 3229, 1988) sa použil Vektor expresie pVWEX 1, ktorý umožňuje IPTG-indukovateľnú expresiu. Do tohto vektora sa bez promótora vklonoval pyc-gén. Na to sa najprv syntetizovali PCR-priméry (priměr 1 polohy 112 až 133 primér 2 polohy 373 až 355 v nukleotidovej sekvencii podľa SEQ ID No. l) a 261 bp bezpromótorovej začiatočnej oblasti pyruvátkarboxylázového génu sa ampliiikovalo pomocou PCR. Priméry sa zvolili tak, aby primćr 1 vytvoril PstI miesto štiepenia a primér 2 BamHl miesto štíepenía. Po PCR sa získaný 274 bp PCR-produkt izoloval, naviazal na konkateméry a následne sa rozštiepil reštrikčnými enzýmami Pstl a BamHI. Rcštrikčná zostava sa skoncentrovala etanolovým zrážanim a následne naviazala na Vektor pVWEX , rozštiepený Pstl-BamHl. Získaný konštrukt pVWEX 1-PCR sa testoval reštrikciou. Koncová oblasť pyc-génu sa RcaI-Klenow-Sall pôsobením izolovala z vektora pEKOpyc a naviazala sa na Vektor pVWEX 1-PCR, spracovaný BamHl-Klenow-Sall pôsobením. Získaný konštrukt pVWEX 1 pyc sa analyzoval reštrikčným mapovaním. Fyzikálna mapa tohto plazmidu je znázomená na obr. 2.Plazmid sa elektroporáciou vniesol do C. glutamicum kmeňa DG 52-5. Ako kontrola sa kmeň DG 52-5 s vektorom pVWEX transformoval bez inzertu a vylučovanie L-lyzínu sa porovnávalo vždy pre tri rozličné transformandy. Na to sa DG 52-5(pVWEXl) l, 2 a 3, ako aj DG 52-5(pVWEXlpyc) 4, 5 a 6 pestovali v komplexnom médiu(2 xTY Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989 s 50 g/l kanamycínu) a fermentačné médium CGXII (J. Bacteríol. 175,5595 - 5603, 1993) sa naočkovalo vždy oddelene predchádzajúcimi kultúrami. Médium obsahovalo dodatočný kanamycin, aby sa plazmidy udržali stabilnými. Vždy sa uskutočnili dve paralelne vsádzky, pričom sa do jednej laboratómej banky pridalo 200 g IPTG/ml, zatiaľ čo druhá laboratóma banka neobsahovala žiadny IPTG. Po kultivácii počas 48 hodín pri 30 °C na rotačnej trepačke pri 120 ot/min. sa určilo množstvo lyzínu, akumulovane v médiu. Určenie koncentrácie aminokyseliny sa uskutočnilo pomocou vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie (J. Chromat. 266,471 - 482, 1983). Výsledok fermentácie je uvedený v tabuľke 2, pričom udané hodnoty predstavujú stredné hodnoty vždy z troch pokusov s rôznymi klonmi. Ukázalo sa,že nadexpresia pyruvátkarboxylazového génu vedie k o 50 vyššej akumulácii lyzinu v médiu, Takto využitie objaveného a opísaného gěnu predstavuje pre anaplerotickýenzým pyruvátkarboxylázu spôsob, ako podstatne zvýšiť tvorbu L-lyzínu.5. Zvýšená akumulácia treonínu a homoserínu nadexpresiou pyruvátkarboxylázového génu v kmeni C. glutamicum DM 368-3Analogicky k pokusom na tvorbu L-lyzínu sa skúmala aj akumulácia treonínu v nadbytku kultúry nadexpresiou génu pre pyruvátkarboxylázu. Na to sa, ako je opísané v bode 4, treonín produkujúci kmeň C. glutamicum DM 368-3(Degussa AG) transformoval plazmidom pVWEX 1 pyc, ako aj na kontrolu plazmidom pVWEX 1 a skúmalo sa vylučovanie treonínu vždy troch rôznych transformandov. Na to sa pestovali DM 368-3(pVWEXl) l, 2 a 3, ako aj DM 368-3(pVWEX 1 pyc) l, 2 a 3 v komplexnom médiu (2 xTY s 50 g/l kanamycínu) a fermentačné médium CGXII (J. Bacteriol. 175, 5595 - 5603, 1993) sa naočkovalo vždy oddelene predchádzajúcimi kultúrami. Médium obsahovalo dodatočný kanamycin, aby sa plazmidy udržali stabilnými. Uskutočnili sa dve paralelné vsádzky, pričom sa do jednej laboratómej banky pridalo 200 g IPTG/ml, zatiaľ čo druhá laboratóma banka neobsahovala žiadny IPTG. Po kultivácii počas 48 hodín pri 30 °C na rotačnej trepačke pri 120 ot./min. sa určilo množstvo treonínu, akumulované v médiu. Určenie koncentrácie aminokyseliny sa uskutočnilo taktiež pomocou vysokotlakovej kvapalinovej chromatografre (J. Chromat. 266, 471 - 482, 1983). Výsledok fermentácie je uvedený v tabuľke 3, pričom udanć hodnoty predstavujú stredné hodnoty vždy z troch pokusov s rôznymí klonmi. Ukázalo sa, že nadexpresia pyruvátkarboxylázového génu vedie k asi 40 zvýšeniu koncentrácie treonínu v médiu. Takto využitie objaveného a opísaného génu predstavuje pre anaplerotický enzým pyruvátkarboxylázu spôsob, ako podstatne zvýšiť tvorbu L-treonínu.Okrem toho určovanie koncentrácie aminokyseliny ukázalo, že kmeň s nadexprimovaným pyruvátkarboxylázovým génom okrem toho prekvapujúco vylúčil do média asi 150 viac homoserínu než kmeň bez nadexprimovaného génu. Zodpovedajúce výsledky sú taktiež uvedené V tabuľke 3. Jasne z nich vyplýva, že spôsobom podľa tohto vynálezu sa dá podstatne zlepšit tak tvorba treonínu, ako aj tvorba homoserínu.6. Zvýšená akumulácia glutamátu nadexpresiou génu pre pymvátkarboxylázu v štandardnom type C. glutamicum Analogicky k pokusom na tvorbu L-lyzínu, L-treonínu a L-homoserinu (pozri pod 4. a 5.) sa skúmala aj akumulácia glutamátu v nadbytku kultúry nadexpresiou génu pre pyruvátkarboxylázu. Na to sa, ako je opísané v bode 4, C. glutarnicum ATCC 13032 štandardného typu transformoval plazmidom pVWEX 1 pyc, ako aj na kontrolu plazmidom pVWEX a skúmalo sa vylučovanie glutamátu vždy dvoch rôznych transformandov. Na to sa pestovali C. glutamicum ATCC 13032 (pVWEX 1 pyc) Dl a D 2, ako aj C. glutamícum ATCC 13032 (pVWEX 1 pyc) l a 2 v komplexnom médiu (2 xTY s 50 g/l kanamycínu) a femtentačné medium CGXII (J. Bacteriol. 175, 5595 - 5603, 1993) sa naočkovalo vždy oddelene predchádzajúcimi kultúrami. Médium obsahovalo dodatočný kanarnycín, aby sa plazmidy udržali stabilnými. Na indukovanie vylučovania glutamátu sa k médiu asi 6 hodin po naočkovaní pridalo 25 mg Tween 60 na ml. Uskutočnili sa dve paralelné vsádzky, pričom sa do jednej laboratórnej banky pridalo 200 g IPTG/ml, zatial čo druhá laboratóma banka neobsahovala žiadny IPTG. Po kultivácii počas 48 hodín pri 30 C na rotačnej trepačke pri 120 ot/mín. sa určilo množstvo glutamátu, ktore sa akurnulovalo v médiu. Určenie koncentrácie aminokyseliny

MPK / Značky

MPK: C12P 13/04

Značky: přípravy, aminokyselin, obsahom, transformovaná, aspartátovej, génová, mikrobiálnej, spôsob, skupiny, glutamátovej, pyruvátkarboxylázový, použitie, gén, buňka, struktura, vektor

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/11-284235-pyruvatkarboxylazovy-gen-genova-struktura-vektor-a-transformovana-bunka-s-jeho-obsahom-sposob-mikrobialnej-pripravy-aminokyselin-aspartatovej-a-glutamatovej-skupiny-a-jeho-pouzitie.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Pyruvátkarboxylázový gén, génová štruktúra, vektor a transformovaná bunka s jeho obsahom, spôsob mikrobiálnej prípravy aminokyselín aspartátovej a glutamátovej skupiny a jeho použitie</a>

Podobne patenty