Kombinovaný farmaceutický prostriedok na liečbu ľudských nádorových buniek, použitie O6-benzylguanínu a temozolomidu na jeho prípravu a farmaceutický kit

Je ešte 3 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Kombinovaný farmaceutický prostriedok na simultánne, oddelené alebo postupné použitie na liečbu ľudských nádorových buniek obsahuje účinné množstvo O6-benzylguanínu a účinné množstvo temozolomidu s jedným alebo viacerými farmaceuticky prijateľnými nosičmi. Je opísané aj použitie O6-benzylguanínu a temozolomidu na prípravu farmaceutického prostriedku na liečbu ľudských nádorových buniek a farmaceutický kit, ktorý obsahuje oddelene farmaceutický prostriedok temezolomid a oddelene farmaceutický prostriedok O6-benzylguanín.

Text

Pozerať všetko

Predkladaný vynález sa týka kombinovaného farmaceutického prostriedku na liečbu ľudských nádorových buniek, použitia inhibitora OG-henzylguanín DNK alkyltransferázy (Atázý) a temozolomidu na jeho pripravu a farmaceutického kitu.V temozolomide, t. j. v S-karbamoyl-o-metylímídazo 5,1-d-1,2,3,5-tetrazín-4-(3 H)-óne, (CCRG 81 045, NSC 362856 boli zistené cenné protinádorové vlastnosti, pozri Newlands a kol., Br. J. Cancer, 651287 (1992). V klinickej praxi mal temozolomid aktivitu proti astrocytómom, gliómom, zhubným melanónom a mycosis fungoides. Liek je najúčinnejši, ak sa podáva podľa rozvrhu opakovaných dávok.Metylovaný Oő-alkylguanín, napr. z reakcie MTIC (aktívny metylujúci druh temozolomidu), je upravovaný bielkovinou Oó-alkylguanín DNA alkyltransferázou (Atázou). Na predchádzajúce pôsobenie metylačným činidlom (napr. Zlotogoski a kol., Carcinogenesis, 583, 1984 Gibson a kol., Cancer Res., 4624995, 1986), Oľ-metylguanínom(napr. Dolan a kol., Bíophys. Res. Commun., 132178,1985) alebo Oĺbenzylguanimom (OS-BG, Dolan a kol.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 875368, 1990) na ATázu-exprimujúce bunky bolo tiež zistené, že zvyšuje cytotoxický účinok chlóretylačných činidiel, zatiaľ čo v bunkách,ktoré ATázu neexprimujú, bola pozorovaná len malá alebo žiadna citlivosť.Moschel, Dolan a Pegg v U.S. patente 5 091 430 uvádzajú, že prechodným poklesom v ATázovej aktivite je všetko, čo je potrebné na zvýšenie účinnosti chlóretylačných činidiel.Publikovaná PCT prihláška W 0 91/13898 uvádza napríklad 3,8-násobný pokles EDso pre Me CCNU, keď je kombinovaný s OG-benzylguaninom v bunkách SF 767. Takto Moshel a kol. uvádzajú všeobecne zvýšenie protinádorovej aktivity alkylačného činidla pri použití s depletorom alkyltransferázy.Vynález prihlasovateľov, prekvapujúcí a nie samozrejmý z hľadiska predchádzajúcich prác, spočíva v tom, že chemoterapeutické účinky temozolomidu môžu byť dramaticky potenciovanč (až BGG-krát pre bunkovú líniu MAWI) použitím určitého dávkovacieho režimu, ktorý obsahuje podávanie inhibítora ATázy. Takto môžu byť ľudské nádorové bunky, ktoré sú inak neprístupnć alebo len málo prístupné liečbe temozolomidom, liečené kombináciou temozolomidu s ínhibítorom ATázy.V súlade s tým je predmetom predkladaného vynálezu kombinovaný farmaceutický prostriedok na simultánne,oddelené alebo postupné použitie na liečbu ľudských nádorových buniek, ktorý obsahuje účinné množstvo 0 °-benzylguaninu a účinné množstvo temozolomidu s jedným alebo viacerými farmaceutický prijateľnými nosičmi.Ďalším predmetom predloženého vynálezu je použitie oó-benzylguanínu a temozolomidu na pripravu farmaceutického prostriedku na simultánne, oddelené alebo postupné použitie pri liečbe ľudských nádorových buniek.Predmetom vynálezu je aj farmaceutický kit na použitie pri liečbe ľudských nádorových buniek, ktorý obsahuje od delene farmaceutický prostriedok temozolomid a oddelene farmaceutický prostriedok Oĺbenzylguanín.Prehľad obrázkov na výkreseObrazok lje grafom cytotoxicity (lCso) temozolomidu(.) a CCNU (x) oproti hladinám bunkovej ATázy v bunkových líniách ľudských nádorov (v poradí stúpajúce hladiny ATázy) ZR-75-l, U 87 MG, U 373, LS 174 T, LOVO, MCF-7 a MAWI.Obrázok 2 je grafom cytotoxicity temozolomidu v pZipneoSV(X) l-transfekovaných (o, g) alebo phAT-transfekovaných (, ) XP-odvodených bunkových Iíniách v prítomnosti (.,) alebo v neprítomnosti (o, ) 10 M BG. Úsečky chýb ukazujú /- 1 s.d.Obrázok 3 je grafom pomeru cytotoxicity opakovaných denných dávok temozolomidu v ľudských nádorových bunkových líniách MAWI (x), MCF-7 () alebo U 373 () v samotnom lieku, IC 5 o (-BG), v porovnaní s preinkubáciou s BG, IC 50 (BG).Obrázok 4 je grafom účinku zvyšujúcich sa koncentrácií temozolomidu na hladiny ATázy v ľudských nádorových bunkových Iiniách LOVO (.), MAWI (x), MCF-7Obrázok 5 je gafom zachytenia rádioaktívnej mačky pri 4 ° C bunkami, na ktoré bolo pôsobené C-temozolomidon-L MAWI (), ZR-75-l (x).Toxicita temozolomidu, protinádorovćho činidla,vhodného na liečbu ľudských nádorov, môže byť veľmi zvýšená jeho použitím spoločne s potenciátorom, ktorým je inhibítor enzýmu Os-alkylguanín DNA alkyltransferázy(ATázy). Konkrétnejšie použitie inhibítorov ATázy, akým je Oó-benzylguanín (BG), môže zvýšiť toxicitu temozolomidu, napríklad V bunkovej línii MAWI, až na asi 300-násobok, ak sa používa v režime opakovaných dávok podľa predkladaného vynálezu, a umožňuje použitie temozolomidu v chemoterapii ľudských nádorov inak neprístupných alebo len málo prístupných takejto liečbe.Paralelná toxicita temozolomidu a lomistinu (CCNU)(po jednohodinovej expozícii na liek) môže byť ukázaná v rade ľudských nádorových bunkových línií, v korelácii s ich obsahom ATázy. Metylácia O pozície guanínu v DNA temozolomidom teda vedie k cytotoxickćmu poškodeniu. Hodnotením ľudských nádorových bunkových línii na ich relatívnu produkciu ATázy môže byt stanovená ich senzitivita na temozolomid. Bunka produkujúca vyššie množstvo ATázy bude teda na samotný temozolomid menej citlivá ako tá, ktorá produkuje minimálne hladiny ATázy.Predchádzajúcim pôsobením na bunky jednotlivou dávkou BG sa dosahuje mieme (4-násobnć) zvýšenie toxocity temozolomidu. Stupeň zvýšenia temozolomidu a lomustinu (CCNU) je rovnaký. Pri testovaní kolónií zostávali ľudské ñbroblasty transfekované cDNA ATázou, vopred opracované BG, rezistentnejšie na temozolomid ako kontrolné transfekované fibroblasty, hoci ATázová bielkovina bola eliminovaná. .le nepravdepodobné, že by to bolo kvôli rozdielu v transporle temozolomidu, môže to jednoducho odrážať resyntézu ATázy phAT fibroblastarni na zmenšenie efektu predchádzajúceho pôsobenia inhibítora.Najviac prekvapujúce však je, že bola zistená značná potencia toxicity temozolomidu (až na asi 300-násobok) BG V bunkovej línii MAWI po piatich dňoch pôsobeniaPodobný stupeň zvýšenia bol pozorovaný V bunkàch MCF-7, ktoré tiež obsahujú vysoké hladiny ATázy, ale len malý efekt v bankách U 373, ktore majú nizke hladiny. Výsledky testovania bunkových líníí MAWI a MCF-7 implikujú, že trvalá prítomnosť inhibítora ATázy umožňuje narastanie poškodenia DNA.Predkladaný vynález uvádza teda spôsob potenciácie toxicity temozolomidu na ľudské nádorové bunky pomocou podávania ATázu-inhibujúceho množstva inhibitora ATázy, a produkt obsahujúci temozolomid a inhibítor ATázy ako kombinovaný prostriedok na súčasné, oddelené alebo postupné podávanie pri liečbe ľudských nádorových buniek.Výhodne je toto podávanie inhibítora ATázy opakované v období niekoľkých alebo viacerých dní, a pred podávanírn dávok temozolomidu. Opakované dávky môžu byť podávané l, 2, 3, 4 alebo 5 dní, 4 alebo 5 dní sú výhodným obdobím liečby.Ďalej a najvýhodnejšie, temozolomid je podávaný pacientovi v opakovaných dávkach počas niekoľkých dní, a ATázu inhibujúce množstvo inhíbitora ATázy je podávané pred každou dávkou temozolomidu, čo vedie k značne zvýšenej toxicite temozolomidu na ľudské nádorové bunky,napr. asi SOO-násobné v bunkovej línii MAWI.Vo výhodnom uskutočnení je inhibítor ATázy podávaný v množstvách inhibujúcich ATázu, t. j. v množstve dostatočnom na citlivosť nádoru in vivo bez toho, že by spôsobilo nežiaduce precitlivenie normálneho tkaniva, ak sa inhibítor používa súbežne s temozolomidomMnobtvo inhibítora ATázy používané v predloženom vynáleze je rôzne, podľa stupňa účinného množstva potrebného na liečenie nádorovýeh buniek. Vhodné dávkovanieje také, ktorým sa dosiahne taká koncentrácia inhibítora ATázy v nádorových bankách, ktoré majú byť liečené, že spôsobí depleciu ATázovej aktivity, napr. l až 2000 mg/kg,výhodne 10 až 800 mg/kg, pred chemoterapiou.Neoplazie, pre ktoré je liečba temozolomidom zvlášť vhodná, zahŕňajú karcinómy, melanómy, sarkómy, lymfomy a leukěmie, so špecifickým využitím pre astrocytómy,gliomy, zhubné melanómy a myeosis fungoídes, Edvingove sarkómy, chronické lyrnfocytáme leukémie a nádory pľúc a prsníkov. Zvlášť dramatické zvýšenie aktivity temozolomidu inhibítorom ATázy bolo zistené v nádorových bunkách prsníkov, astrocytómov a kolorektálnych nádorov.Typickým rozsahom dávkovania temozolomidu je všeobecne od 0,1 do 200, výhodne od 1 do 20 mg/kg telesnej hmotnosti denne, alebo vyjadrené na plochu povrchu tela,asi od 40 do 400, výhodne asi od 150 do 300 mg/mz denne.Kvantita potenciácie inhibítorom ATázy je závislá od množstva ATázy normálne prítomnej v konkrétnom type nádorových buniek. Nádorové bunky, ktoré majú vyššie hladiny Atázy, budú potenciované predchádzajúcim podávanim inhibítora ATázy dramatickejšie.lnhibítormi ATázy využiteľnými v predkladanorn vynáleze sú tie, o ktorých je známe, že majú túto aktivitu, napríklad Oó-alkylguaníny, akým je Oő-metylguanín, alkenylgianíny, akým je Oĺalylguanín a OG-arylguaniny, akým je OG-benzylguanin a benzylované guanínové, guanozínovć a T-dezoxyguanozínové zlúčeniny, dopísané v medzinárodnej prihláške PCT W 0 91/13898 (publikovanej 19. septembra 199). Zvlášť vhodným na použitie v predkladanom vynáleze je Oĺbenzylguanín.Konkrétne dávkovanie inhibitora ATázy závisí od množstva ATázy normálne nájdenej v liečených nádorových bunkách, od veku a stavu pacienta a od konkrétne použitého inhibítora ATázy.O temozolomide bolo zistené, že najvýhodnejšie je jeho podávanie v opakovaných dávkach v po sebe nasledujúcich dňoch, a dramatické potenciačné účinky predkladaného vynálezu sa realizujú v tomto vysoko výhodnom režime, so zahmutím podávania dávky inhibítora ATázy pred alebo súbežne s podaním každej dávky podávaného temozolomidu. Výhodne je používaný ako inhibítor ATázy 0 °-benzylguanín spolu s temozolomidom podávaným v dennom dávkovaní 150 až 300 mg/mz v štyroch až v piatich rozdelených dávkach počas štyroch až piatich po sebe nasledujúcich dní (celková dávka 750 až 1500 mg/mz). Výhodne je každá dávka inhibitora ATázy podávaná 2 až 8 hodín pred každou dávkou temozolornidu. Toto umožňuje najväčšiu potenciáciu toxieity temozolomidu a vedie k najefektívnejšej liečbe konkrétnej pacientovej neoplazie. Najvýhodnejšie je tento režim opakovať po intervale asi štyroch týždňov.Altematívnym dávkovacím rozvrhom na podávanie temozolomidu s Oó-benzylguanínom je nepretržitý rozvrh,pri ktorom sa tieto dva lieky podávajú denne počas štyroch alebo viacerých dní. Táto kombinovaná liečba môže byť predlžená na základe potreby jej pokračovania, pokiaľ nenastane remisia.Navyše môže byť tvorba ATázy konkrćtnou ľudskou nádorovou bunkou použitá ako vyhľadávacía metóda na určenie potenciácie toxicity temozolomidu na spomínanú bunku. Vo výhodnom spôsobe sa testuje obsah ATázy tejto konkrétnej bunkovej linie, napr. metódou popísanou v Lee a kol., Cancer Res., 512619 (1991), a stanoví sa potenciálna senzitivita na temozolomid. Takéto stanovenie potom umožňuje patričnú kombináciu temozolomidu a inhibltor ATázy na podávanie v liečebnom režime.Inertné, farmaceutický prijateľné nosiče na pripravu farmaceutických prostriedkov zo zlúčenín opísaných predkladaným vynálezom, môžu byť pevné alebo tekuté. Prostriedkami v pevnej forme sú prášok, tabletky, disperzibilnć granuly, kapsuly, dražé a čapiky. Prášky a tabletky môžu obsahovať od 5 do 70 aktívnej zložky. Vhodné pevné nosiče sú v odbore známe, napr. uhličitan horečnatý, stearát horečnatý, talok, cukor, laktóza. Tabletky, prášky, dražé a kapsuly môžu byť použité ako pevné dávkovacie formy vhodné na orálne podávanie.Na prípravu čapíkov je najprv roztavený nizkotuhnúci vosk, akým je zmes glyceridov mastných kyselín alebo kakaové maslo, a aktívne zložky sú v ňom rovnomeme dispergované, napr. miešaním. Roztavená homogénna zmes je potom naliata do foriem vhodného tvam, nechá sa vychladnúť a tým stuhnúť, Prostriedkarni v tekutej forme sú roztoky, suspenzie a emulzie. Príkladom môže byť vodný roztok alebo roztoky v propylénglykole pre parenterálne injekcie.Zahmuté sú tiež prostriedky v pevnej forme, ktoré majú byť krátko pred použitím prevedené na prostriedky v tekutej forme buď na orálne alebo parenterálne podávanie. Takéto prostriedky v tekutej forme zahmujú roztoky, suspenzie a emulzie.Zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť tiež podávané transdermálnc. Transdermalne prípravky môžu byť vo forme krémov, tekutých prostriedkov, aerosólov a cmulzií, a môžu byť obsiahnuté v transdermálnej náplasti typu nosiča alebo rezervoáru tak, ako sa v odbore konvenčné používajú na tento účel.Farmaceutický prostriedok je výhodne v jednotkovej dávkovacej forme. V tejto forme je rozdelený do jednotkových dávok obsahujúcich príslušné množstvo aktívnej zložky, napr. množstvo účinné na dosiahnutie žiadaného účelu.Množstvo aktívnej zlúčeniny v jednotkovej dávke možno meniť alebo nastavovať od asi 0,1 mg do 1000 mg,výhodne od l mg do 500 mg, podľa konkrétnej aplikácie.Konkrétne použité dávkovanie sa môže meniť v závislosti od pacienta a vážnosti jeho stavu, ktorý má byť liečený. Stanovenie správneho dávkovanie. patrí do znalostí v odbore. Pre pohodlie môže byť denná dávka rozdelená a podávaná v priebehu dňa po častiach, pokiaľ je to žiaduce.Vynález tu uvedený je dokladovaný nasledujúcimi príkladmi uskutočnenia, ktoré sa však nesmú považovať za obmedzenie rozsahu tohto zverejnenia.Médium pre bunkové kultúry bolo zakúpené od íCN Biochemicals Ltd. (High Wycombe, Anglicko) a fetálne teľacie sérum od Gibco Ltd. (Paisley, Anglicko). 0 °-bcnzylguanín 036) bol láskavo dodaný Dr. R. C. Moschelom (NCI-Frederick Cancer Research Development Center, Frederick, Maryland, USA). Ternozolomid a jeho chlóretylový analóg, mítozolomid (8-karbamoyl-3-(2-chlóretylímidazo 5,l-d-1,2,3,5-tetrazin-4-(3 H)-ón), boli syntetizované v May and Baker Ltd. UJagenham, Anglicko) a udržiavaná ako roztoky v DMSO pri -70 °C. Všetky ostatné chemikálie boli kúpené v Sigma Chemical Co. Ltd.Bunkové línie boli mtinne rozrastané ako monovrstvy v DMEM s doplnkom 10 fetálneho teľacieho séra, 25 mM HEPES, glutamínu a penicilinu/streptomycínu. Štúdie cytotoxícity sa uskutočňovali v médiu bez HEPES v atrnosfére 5 C 02 . 750 až 1000 buniek/jamku bolo nanesených na 96-ja 1 nkové doštičky, na ktoré sa pôsobilo po predchádzajúcej inkubácii cez noc, po 2 hodiny s alebo bez 33 M BG. Temozolomid alebo CCNU potom boli pridané na l hodinu do toho istého média, pričom konečná koncentrácia DMSO neprevýšila 1 . Bunky sa rozrastali ďalších 7 dní v čerstvom médiu a potom bol stanovený obsah ich bielkovín pomocou NCI sulforodamínového stanovenia opísaného Shekanom a kol., J. Natl. Cancer Inst., 821107 0990) štúdie rastu ukázali, že bunky počas trvania testu boli v logaritmickej fáze rastu. Pre rozvrh opakovaného dávkovania temozolomidu sa na bunky pôsobilo opakovane v následných 24-hodinových intervaloch, s čerstvým médiom každý deň. Testy sa robili prinajmenšom duplicitne.Ľudské XP bunky, transfektované cDNA ATázou alebo kontrolné Fan a kol., Nucleic Acid Res., l 85723(l 990),boli rozrastané v NEM a nanášané v počte 1000 buniek/jamku. Po 3 hodinách inkubácie bol pridaný temozolomid, čerstvo zríedený do NEM, a doštičky boli inkubované 5 dni. Preživajúce bunky boli stanovované tak, ako je to opísané v Morten a kol., Carcinogenesis, 132483 (1992). V pokusoch s BG bolo nanášané po 300 bunkách v tríplíkátoch na 9 cm misky a ponechané na prichytenie 5 hodín. BG (10 MM v NEM) bol pridávaný 3 hodiny pred pôsobenim temozolomidu, ktorý bol čerstvo zriedený V NEM obsahujúcom lO M BG. Po 7 dňoch boli kolónie zafarbené pomocou Giemsa a spočítané.Stanovenie oô-alkylguanín DNA alkyltransferázy Toto stanovenie sa uskutočňovalo tak, ako to opisuje Lee a kol., Cancer Res., 511619 (1991). Takto sa inkubo valo rôzne množstvo bunkových extraktov s DNA, ktoré. obsahuje Oil-metylguanin označený JH v metylovej skupine, výhodne pri 37 °C 2 hodiny s celkovým objemom 300 l pufra l, obsahujúceho l mg/ml bovinného sérového albumínu. Po inkubácii sa pridá v rýchlom slede hovinný sérový albumín (100 l roztoku 10 mg/ml v pufri l) a kyselina chloristá (100 l 4 M roztoku). Pridajú sa ďalšie 2 ml lM kyseliny chloristej a zmes sa zahrieva pri 75 °C 40 minút na degradáciu DNA na materiál rozpustný v kyseline. Bielkovina, v ktorej jeobsiahnutá metylovaná ATáza, sa potom získa centrifugáciou a premyje sa 4 ml lM kyseliny chloristej pred resuspendovaním v 300 l 0,0 lM hydroxidu sodného, rozpustením v 3 ml vodnej scintilačnej kvapaliny(Ecoscint A. National Diagnostics) a meraním rádioaktívity. Obsah bielkoviny v bunkách bol stanovený použitím súpravy na stanovovanie bielkovín Biorad a bovinného sérového albumínu ako štandardu. Aktivita ATázy je vyjadrená ako fmol množstvo metylov prenesených do bielkoviny na 1 mg celkovej bielkoviny v extrakte.Bunkové udržanie C- označeného temozolomidu B-Karbamoyl-S-C-metylimidazo 5,1-d-1,2,3,5 tetra-zín-4-(3 H)-ón (špecifická aktivita 26,3 mCi/mmol) bol dodaný Dr. Johnom Slackom (Aston Molecules Ltd.,Birmingham, Anglicko). Bunkové suspenzíe (5 x 106/ml) boli dané do rovnováhy pri 4 °C a pôsobilo sa na nich 200 M označeným liečivom. 10 ° buniek sa pipetovalo do Eppendorfových skúmaviek a centrifugovalo sa cez 250 l olejovej zmesí (4 l Three-in-OneVDoW Coming silikónový olej). Vodná vrstva bola odtiahnutá a olejová vrstva bola opatme premytá ďalšími 300 l soľného roztoku. Po centrifugácii boli odtiahnuté obidve vrstvy, bunková paleta bola rozpustená V solubilizátore buniek, akým je Protosol(kvartémy hydroxid amónny v toluéne) a pridaná do scintilačných íľaštičiek obsahujúcich Optiphase (95 - 99 diizopropylnañalén).Výsledky štúdií cytotoxicity Údaje sú uvedené v nasledujúcej tabuľke l.IIIIIDVA EIIIIIOLOIID CCIIJ LÍIIAIcu lcn Pour lcu len PourDNI 112 HI 1. II I.I 1.3 B 373 HI II 1.7 II ll 1,Llľllł IH III 1.4 18 l 5.7 WVQ I 333 IJ I II hl IAII 1179 NI LI ll 10 1.( ILHIIABunky boli vystavené v bunkovej kultúre /- O 6-benzylguanínu (BG) pred jednotlivou dávkou temozolomidu alebo CCNU2. Výsledky získané MTT stanovenia Wassermana a kol., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., l 5699 (1988).3. Čísla v zátvorkách sa týkajú mitozolomiduÚdaje v tabuľke I, ktoré sú graficky znázornená v obr. l, majú koreláciu medzi citlivosťou (meraná je koncentráciou, kmrá uvádza 50 rastu alebo IC 5 O) nádorovej bunkovej línie na temozolomid (r korelačný koeficient 0,87) alebo CCNU (r korelačný koeficient 0,92) a ich obsahom ATázy. Sklony sú skoro rowiobežzné, až na to, že CCNU je na molámom základe približne päťkrát toxickejšie. Jednou výnimkou bola línia MCF-7, ktorá je rnieme citlivá na temozolomid a má relatívne vysokú aktivitu ATázy. Bunky, na ktoré sa vopred pôsobilo netoxickou dávkou BG, boli 3 až S-krát, resp. šesťkrát citlivejšie na temozolomid alebo CCNU.Kontrolné XP bunky (bunky xeroderma pigmentosa transfekovanć pZipneoSV(X Fan a kol., Nucleic Acid Ros., 1825723 (l 990), ktoré exprimujú ťažko merateľné hladiny ATázy, sú 4-5-krát citlivejšie na temozolomid alebo CCNU-podobnćmu činidlu mitozolomídu ako ľudské bunky transfekované cDNA ATázou (pozri tabuľku I). V testoch tvorby kolónií použitých v cytotoxicite temozolomidu ( pozri obr. 2) vykazuje predchádzajúce pôsobenie BG podobný stupeň potenciácie na ľudské ATázou transfekovanć XP bunky ako na nádorové bunky, ale nemá žiadny merateľný účinok na kontrolné XP bunky, ktore neexprimujú ATázu. Aj ked BG depletoval ATázou aktivitu ľudských ATázou transfekovaných XP buniek a nádorových buniek (pozri nižšie), tieto bunky ostali rezistentnejšie na temozolomid ako kontrolné pZip-transfekovanć fibroblasty.Údaje rozvrhu opakovaných dávok sú uvedené v nasledujúcej tabuľke II.Tabuľkall Cytotoxicita opakovaných dávok temozolomidu IC 50IA 319 lll NI II Sl Il lll 1. ZI 1.0Ici-T ll II Ill H I llBunky boli vystavené v bunkovej kultúre /- 0 °-benzylguaninu (BG) pred opakovanými dennými dávkami temozolomidu.Rozvrh opakovaných dávok mal dramatickú potenciácíu toxicity tenozolonidu OG-benzylguaninom (BG) v bunkach MAWI a MCF-7 (pozri tiež obr. 3).Po pôsobení piatich 24-hodinových dávok bola bunková línia MAWI 300-krát citlivejšia na temozolomid, ked bol prítonmý BG. Opakované dávky temozolonidu nie sú samy o sebe toxickejšie ako jednotlivú 24-hodinová dávka v hocíktorej bunkovej línii. V podobnom pokuse na bunkâch U 373, ktoré majú nízku hladinu ATázy, prítomnosť BG spôsobila len trojnásobnú potenciáciu po štyroch 24-hodinových dávkach.Použité koncentrácie BG rýchlo znižovali na nemerateľnú úroveň pôvodne vysoký obsah ATázy v bankách MAVII a v ľudských íibroblastoch transfekovaných cDNA ATázou. Analýza HPLC ukázala, že BG je v médiu pre pletivovć kultúry stabilné najmenej 24 hodín pri 37 °C.Bolo zistené, že temozolonid po trojhodinovej inkubácíi spôsobuje pokles obsahu ATázy v bunkových líniách U 373, MCF-7, LOVO a MAWI. Pri 50 - 100 M koncentrácii bolo zníženie približne 50 v každej línii (pozri obr. 4), aj napriek 3-4-násobnému rozdielu v cytotoxicite na jednotlivú dávku temozolomidu medzi MCF-7 a kolorektálnymi líniami (LOVO a MAWI). Podobné zníženie bolozistené v citlivejšej línii U 373, aj keď hladiny ATázy boli blízko detekčnej hranice testu.Na elimináciu možnosti rozdielov v transpone temozolomidu bolo študované bunkovć zadržanie coznačenej zlúčeniny v najcitlivejších a najrezistenmejšich bunkových líniách (ZR-75-l, resp. MAWI). Výsledky uvedenć na obr. 3 ukazujú, že zadržanie pri 4 °C bolo veľmi rýchle a úplné v priebehu 5 minút v obidvoch bunkových líniách. Podobné množstvá liečiva boli zistené v obidvoch bunkových llniách, s úpravou vzhľadom na koncentráciu bielkovín. Rýchle zadržanie pri 4 °C bolo konzistenmć s pasívnou difúziou temozolomidu preukázanou skôr v dvoch lymfoidných líniách Bellom a kol., Biochem. Pharmacol.,363215 (1987).Orálny prostriedok 51 g na kapsulu temozolomid 100 laktóza, USP 213 mikrokryštalická celulóza 30 laurylsulfát sodný 20 kukuričný škrob 25 stearát horečnatý 2Spolu sa zmieša temozolomid a laktóza, mikrokryštalická celulóza, laurylsulfát sodný a kukuričný škrob. Preoseje sa cez sito číslo 80, pridá sa stearát horečnatý, premieša a uzatvori do dvojdielnych želatínových kapsúl patričnej veľkosti.Orálný prostriedok mg na kapsulu Oĺbenzylguanin 100 laktóza, USP 21 3 mikrokryštalická celulóza 30 laurylsulfát sodný 20 kukuričný škrob 25 stearát horečnatý 2Spolu sa zmieša Oĺbenzylguanln a laktóza, mikrokiyštalická celulóza, laurylsulfát sodný a kukuričný škrob. Preoseje sa cez sito číslo 80, pridá sa stearát horečnatý,premieša a uzatvorí do dvojdielnych želatlnových kapsúl patričnej veľkosti.Orálny prostriedok mg na kapsulu temozolomid 100 OG-benzylguanín 100 laktóza, USP 213 mikrokryštalická celulóza 30 laurylsulfát sodný 20 kukuričný škrob 25 stearát horečnatý 2Spolu sa zmieša temozolomid a Oó-benzylguanín, laktóza, mikrokryštalická celulóza, laurylsulfát sodný a kukuričný škrob. Preoseje sa cez sito číslo 80, pridá sa stearát horečnatý, premieša sa a uzatvori do dvojdielnych želatinových kapsúl patričnej veľkosti.

MPK / Značky

MPK: A61K 31/70, A61P 35/00, A61K 31/52

Značky: o6-benzylguanínu, použitie, liečbu, nádorových, prostriedok, buniek, farmaceutický, kombinovaný, ľudských, temozolomidu, přípravu

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/11-282452-kombinovany-farmaceuticky-prostriedok-na-liecbu-ludskych-nadorovych-buniek-pouzitie-o6-benzylguaninu-a-temozolomidu-na-jeho-pripravu-a-farmaceuticky-kit.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Kombinovaný farmaceutický prostriedok na liečbu ľudských nádorových buniek, použitie O6-benzylguanínu a temozolomidu na jeho prípravu a farmaceutický kit</a>

Podobne patenty