Streptomyces avermitilis a spôsob výroby avermektínu B

Číslo patentu: 279351

Dátum: 07.10.1998

Autori: Holdom Kelvin Scott, Lee Shin-jen Edward, Hafner Edmund William

Je ešte 3 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Spôsob výroby avermektínu B tak, že sa pestuje kmeň Streptomyces avermitilis, ktorému chýba dehydrogenáza 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom a O-metyltransferáza avermektínu B. Použitie získaných prírodných i neprírodných avermektínov B ako paraziticídnych prostriedkov.

Text

Pozerať všetko

Vynález sa týka spôsobu výroby derivátov averrnektínu B, ktoré je možné získať pestovaním kmeňoVStreptomyces avermizilis, ktoré nemajú avermektín B-O-metyltransferázovú účinnosť a účinnosť dehydrogenázy 2-oxokyselín V bočnom reťazci. Je možne získať prírodné i polosynteticke deriváty avermektínu B.V US patentových spisoch č. 4 310 519 a 4 429 042 sa opisujú avermektíny ako komplex príbuzných látok, ktoré majú vysokú antiparazitámu účinnosť a tiež ich výroba aeróbnou fermentáciou kmeňov Streptomyces avermitilis, a to hlavne S. avermitiĺis ATCC č. 31267, 31271 a 31272. Obzvlášť dva uvedené posledné kmene sú k dispozícii v zmrazlenej alebo lyofilizovanej forme a boli získané ožiarením kmeňa S. avermítíĺís ATCC 31267 ultrafialovým svetlomV európskom patentovom spise č. 214 731, uverejnenom 18. marca 1987, ktorý zodpovedá US patentovej prihláške č. 886 867, podanej 16. júla 1986, sa uvádza celý rad zlúčenín, ktore sú príbuzné prírodným alebo známym avermektínovým derivátom, ale nie sú prírodného pôvodu a majú nový substituent V polohe 25. V spise sa rovnako opisuje spôsob výroby týchto látok fermentácíou mikroorganizmov, produkujúceho averrnektín za prítomnosti určitých karboxylových kyselín alebo derivátov týchto kyselín, alebo ich prekurzorov. Mikroorganizmy S. avermítilis, použité na Výrobu uvedených nových avermektínových derivátov,substituovaných na uhlikovom atóme V polohe 25, sú S. avermílílís ATCC 31267, 31271, 31272 a NCIB 12121. Posledný z týchto organizmov, opísaný v európskom patentoVom spise č. 214 731 je odvodený od S. avermitilis ATCC 31271. Pri použití tohto mikroorganizmu je možne získať zlepšenć výťažky nových avermektínových derivátov, substituovaných V polohe 25 V prípade, že sa tieto mikroorganizmy pestujú na určitom prostredí. Každý z kmeňov ATCC 31267, 31272, 31271 a NCIB 12121 môže tiež produkovať okrem nových derivátov, substituovaných V polohe 25 ešte rôzne množstvá známych prírodných avennektínov, V ktorých je substituentom v polohe 25 izopropylová alebo sekbutylová skupina (1-metylpropyl).Uhlíková kostra avermektínu, ktorá bude ďalej znázornená, je odvodené od acetátov a propionátov a substituent V polohe 25 prírodných averrnektínov je odvodený od L-izoleucínu (R(S)-sek.-butyl) alebo od L-valínu (Rizopropyl), ako bolo opísané v publikácií Fisher a Mrozik, Macrolide Antibiotics, Academic Press (1984), kap. 14.Pod pojmom známe alebo prírodné averrnektíny sa chápu tie látky, ktoré sú produkované S. avermitílis ATCC 31267, ATCC 31271 a ATCC 31272, pričom substituentom V polohe 25 je bud izopropyl, alebo (S)-sek.-buty 1-(1-metylpropyl). Avennektín, ktorý nesie v polohe 25 iný substituent ako ízopropyl alebo sek.-butyl (S)-forrna sa nazývajú noVé avermektíny alebo avermektíny iného ako prírodného pôvodu.Kmene S. avermitilis, ktoré sú V uvedených US patentových spisoch, produkujú skupinu látok, ktoré sa súhmne označujú ako C-076. Táto skupina látok pozostáva z ôsmich zreteľne odlišných, ale blízko príbuzných zlúčenín,ktoré sa zvyčajne označujú ako C-076 Ala, Alb, A 2 a, A 2 b,Bla, B lb, B 2 a a B 2 b. Skupina a uvedených zlúčenín zahmuje prirodne avermektíny, v ktorých je substituentom V polohe 25 (S)-sek.-butyl, skupina b uvedených zlúčenín zahrnuje tie látky, V ktorých je substituentom V polohe 25izopropylový zvyšok. Označenie A a B sa týka avermektínov, v ktorých substituentom V polohe 5 je V prvom prípade metoxyskupina a V druhom hydroxylová skupina. Cislo l znamená avermcktíny, V ktorých sa V polohe 22 - 23 nachádza dvojitá väzba a číslo 2 sa týka avermektínov, ktoré obsahujú V polohe 22 atóm Vodíka a V polohe 23 hydroxylovú skupinu.V priebehu tejto prihlášky nebude použité žiadne identifikujúce označenie, pokiaľ ide o substituent V polohe 25 nových averrnektínov. Označenie Al, A 2, B 1 a B 2 bolo zachované pre nové avermektíny, ktorých štruktúme vlastnosti zodpovedajú uvedeným štruktúrnym vlastnostiam doteraz známych avemiektínových derivátov.Tvorba mutans, zbavených účinnosti dehydrogenázy 2-oxokyselín bočného reťazca už bolo uvedene pre Bacillus subtilis V publikácii Wíllecke a Pardee, J. Biol. Chem 246,5264 - 5272 (1971) a pre Pseudomonas putida V publikácii Martin a ďalší, J. Bacteriology, 115, 198 - 204 (1973),tvorba podobných mutans Však nebola ešte nikdy opísaná V prípade čeľade Streptomyces.S. avermítílís Agly-l, mutant, ktorý produkuje V podstate iba aglykóny avermektínu Ala a A 2 a, bola opísaná V publikácii Schulman a ďalší, J. Antibiot. 38 (l l), 1494 až 1498 (1985). V publikácii sa opisuje tiež fermentàcia S. avermítílís Agly-l za prítomnosti sinefungínu, čím je možné dokázať zvýšené produkcie zložiek aglykónu avermektínu B. Rovnako tak pri pestovaní S. avermítílis 0,8, Vysoko produkčného kmeňa za prítomnosti sineñingínu ako inhibítora O-metyltransferáz dochádza k produkcii avermektínových derivátov, ktoré sú zbaveně O-metylovej skupiny na aglykóne na uhlikovom atóme v polohe 5 a V oleandrózovej disacharidovej skupine.US patentový spis č. 4 378 353 opisuje zlúčeniny, príbuzné skupine C-076 a ich získavanie pestovaním MA-5218, čo je mutant kmeňa S. avermitilis ATCC 31272, získaný ožiarenlm tohto kmeňa ultrafialovým svetlom. Mutant je identitlkovaný ako ATCC 31780. Zlúčeniny, príbuzné skupine C-076, produkované fermentáciou tohto mutantu nemajú C-076 furánový kruh. Okrem toho V niektorých týchto látkach došlo k odštepeniu jednej alebo obidvoch oleandrózových sacharidových skupín, pričom V iných látkach tejto skupiny došlo k oxidácíí skupiny V polohe 5 na ketoskupinu.Tri skupiny O-metyltransferázových mutantov S. avermitilís, ktoré sú schopné produkovať avermektínove deriváty, V ktorých chýbajú O-metylové skupiny, boli opísané V publikácii Rub a ďalší, 6 th International Symposium on the Bíology of Actinomycetes, Debrecín, Maďarsko, 26. - 30. augusta 1985 a V publikácii Schulman a ďalší, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31, 744 - 747 (1987). Prvá z týchto skupín produkuje prevažne avermektíny B vzhľadom na neschopnosť metylácie hydroxylovej skupiny V polohe 5 makrocyklíckěho laktónového kruhu. Druhá skupina týchto mutantov produkuje 3-0, 3-O-bis-demetylavermektíny (avermektíny, ktoré nemajú O-metylový zvyšok ako substituent V polohe 3 na obidvoch oleandrózových monosacharidových zvyškoch), tieto látky sa nazývajú dimetylavermektíny. Tretia skupina mutantov nie je schopná metylácic V žiadnej polohe.(1985) sa opisuje zvýšená produkcia avermektínu B fermentáciou S. avermítilís za prítomnosti rôznych látok, napríklad sinefungínu, S-adenozyletionínu a S-adenozylhomocysteínu, ktoré inhibujú metyláciu hydroxylovej skupiny V polohe 5 aglykónovej skupiny pôsobením enzýmu averrnektín B-O-metyltransferázy. Mutanty Streptamyces avermitilis, ktoré nemajú O-metyltransferázovú účinnosť aprodukujú zvýšené množstvo zložiek averrnektínu B, ktoré boli rovnako opísané napríklad V publikácii Schulman a ďalší, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 29, 620 až 624 (1986).Mutagenézou S. avermitilis je možné získať také mutanty, ktoré už nemajú účinnosť dehydrogenázy 2-oxokyselín v bočnom reťazci. Tieto mutanty už nemajú schopnosť produkovať väčšie množstvo prírodných averrnektínov v neprítomnosti pridaných zlúčenín vzorca RCOOH, v ktorých R znamená izopropyl alebo (S)-sek.-butyl alebo zlúčenín, ktoré je možné previesť na zlúčeniny vzorca RCOOH v priebehu femientácie. Je však prekvapujúce a neočakávané,že pri pestovaní týchto mutantov došlo k produkcii averrnektinov, prírodných i neprírodných V pripade, že tieto mutanty boli pestované za pridania zlúčeniny vzorca R-COOH, V ktorom R je izopropyl alebo (S)-sek.butyl alebo prekurzora zlúčeniny RCOOH. Je ďalej prekvapujúce, že uvedené mutanty,ktorým chýba účinnosť dehydrogenázy Z-oxokyselin bočného reťazca a ktoré sú neschopné rozkladať L-izoleucín, L-leucín alebo L-valín, sú schopné asimilovať celý rad rôznych zlúčenín do biosyntetických procesov, ktoré prebiehajú pri tvorbe neprírodných averrnektínov, pričom dochádza k tvorbe týchto látok, ktoré sú zbavené prítomnosti prírodných averrnektínov.Mutagenćzou takto získaných jednoducho blokovaných mutantov vznikajú mutanty, ktoré sú zbavcne účinnosti dehydrogenázy 2-oxokyselín v bočnom reťazci a účinnosti O-metyltransferázy avermektinu B. Takto dvojnásobne blokované mutanty sú neočakávane schopné produkovať V podstate iba prírodné a neprirodné avermektíny B V prípade, že sú pestované V prostredi, ku ktorému bola pridaná zlúčenina všeobecného vzorca R-COOH, v ktorom R má uvedený význam.Ako už bolo uvedene, sú prirodne avennektíny produkované ako komplexná zmes ôsmich od seba odlišných, ale blízko príbuzných zlúčenín všeobecného vzorca (I), v ktorom R znarnená izopropyl alebo (S)-sek.-butyl. Jednotlivé zložky tohto komplexu boli izolované v podstate čistej forme, ako bolo uvedené v US patentovom spise č. 4 429 042, pričom spôsob izolácie jednotlivých zložiek je prinajmenšom prácny. Avermektíny B majú zvyčajne vyššiu antihelmintickú účinnosť ako zodpovedajúce averrnektíny A. Pri produkcii neprírodných avermektinov (zložky A a B) spôsobom, opísaným v európskom patentovom spise č. 214 731, môže rovnako dochádzať k vzniku prírodných averrnektínov v rôznom množstve vzhľadom na prítomnosť dehydrogenázy 2-oxokyseliny v bočnom reťazci a aminokyselín L-valinu a L-izoleucinu v bunkách mikroorganizmov S. avermítilis a v prostredí, v ktorom sú tieto mikroorganizmy pestované.Schopnosť produkovať iba účinnejšie zložky B prírodného alebo neprírodného pôvodu, minimalizácia komplexity produktu a počtu zložiek a zvýšenie čistoty zvoleného derivátu avermektínu, a tými zjednodušenie izolácie jednotlivých zložiek celého komplexu by teda bolo veľmi žiaduce.Kmene S. avermitilis, ktoré nemajú účinnosť dehydrogenázy 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom, je možné získať mutáciou kmeňov S. avermitilís, produkujúcich averrnektín, a to hlavne mutáciou kmeňov S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 alebo NCIB 12121. Získané mutanty nie sú schopné syntetizovať prirodne averrnektíny s výnimkou prípadu, že sa do živnéhoprostredia, v ktorých sú tieto mutanty pestované, pridá alifatická kyselina alebo prekurzor alifatíckej kyseliny, nesúci izopropylovú alebo sek-butylovú skupinu (S-fomiu). Tieto mutanty sú schopne produkovať prírodné a neprírodne averrnektíny v prípade, že sú fermentované vo vodnom prostredi za aeróbnych podmienok, pričom žívnć prostredie obsahuje príslušnú kyselinu alebo zlúčeninu, ktorú je možne na príslušnú kyselinu previesť v priebehu fermentácie.Tie mutanty, ktoré nemajú účinnosť dehydrogenázy 2-oxokyselln s rozvetveným reťazcom, sa izolujú zo získaných kolónií pri použití MCOZ. Pri tomto postupe je nepritomnosť C 02 v bunkách, pestovaných na substráte s obsahom C-l-2-izo 1 aprónovej kyseliny alebo C-l-2-oxo-3-metylvalerovej kyseliny alebo 14 C-1-2-oxo-metylmaslovej kyseliny dôkazom neprítomnosti účinnosti dehydrogenázy 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom.Je prekvapujúce a neočakávané, že opísanć mutanty,ktoré nemajú účinnosť dehydrogenázy Z-oxo-kyselín s rozvetveným reťazcom, si uchovávajú schopnosť produkovať avemrektíny, hlavne neprírodného pôvodu. Neschopnosť týchto mutantov k produkcii derivátov prírodného koenzýmu A pre acylovú skupinu alifatických kyselín pri pestovaní na bežnom prostredí by mohla byť letálnou mutáciou v prípade, že by integrita membrany závisela od derivátov 2-oxokyselín alebo keby nahromadenie 2-oxo kyselín bolo cytotoxické. Okrem toho by nebolo možné očakávať, že by uvedene mutanty mohli syntetizovať acetyl CoA alebo propionyl CoA pri degradácii L-izoleucinu a L-valínu, pretože vznik týchto zlúčenín zvyčajne vyžaduje účinnosť enzýmu,ktorú mutanty nemajú. Nutnosť prítomnosti acyl CoA-derivátov pre biosyntćzu avennektínu viedla k očakávaniu,že mutanty zrejme nebudú schopne produkcie neprírodných avermektínov, tento predpoklad však proti všetkému očakávaniu nebol potvrdený.Neprítomnosť účinnosti dehydrogenázy 2-oxo kyselín s rozvetveným reťazcom v opísaných mutantoch má za následok prekazenie syntézy CoA s naviazaným rozvetveným acylovým zvyškom alifatických kyselín z degradácíe L-izoleucinu, L-leucínu a L-valínu, takže do femrentačněho prostredia sa pridáva kyselina všeobecného vzorca R-COOH (v ktorom R znamená (S)-sek.-butyl alebo izopropyl) alebo prekurzor tejto kyseliny.Ďalšou mutáciou mutantov, ktorým chýba dehydrogenáza 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom, je možné získať mutanty, ktorým okrem iného chýba O-metyltransferáza avemrektinu B. Mutanty, ktorým chýba táto O-metyltransferázová účinnosť avemrektínu B, nie sú schopné metylácie v polohe C-5 aglykónovej skupiny averrnektínu. Mutanty, ktoré uvedenú účinnosť nemajú, produkujú v podstate iba averrnektíny B, pretože nie sú schopne produkcie averrnektinu A.Je zrejmé, že je možne na tento cieľ použiť akýkoľvek mikroorganizmus, ktorý je možné získať transformáciou,transdukciou, genetickou rekombináciou alebo niektorými inými genetickými postupmi pri použití nukleových kyselín alebo ekvivalentného materiálu z opísaných mikroorganizmov, a tak prenesenie vlastností týchto mikroorganizmov na ďalšie mikroorganizmy.Pod pojmom averrnektin alebo averrnektíny, tak,ako sa používajú v priebehu prihlášky, sa chápu zlúčeniny ďalej uvedeného vzorca (I), v ktorom substituentom R v polohe 25 môže byť akákoľvek skupina, ktorá je v tejto polohe asimilovateľná určitým kmeňom S. avermitilis, používaným v priebehu spôsobu podľa vynálezu.Opísané mutanty sú veľmi cenné pre produkty neprírodných averrnektínov spôsobom, ktorý bude ďalej opísaný a ilustrovaný jednotlivými príkladmi. Postup je obzvlášťcenný pre výrobu výhodných avermektínových derivátov, t. j. zlúčenín, v ktorých substituentom v polohe 25 je cykloalkyl alebo cykloalkenyl vždy so 4 až 6 atómami uhlíka, prípadne substituovaný alkylovým zvyškom s 1 až 4 atómarni uhlíka, 1-metyl-tioetyl alebo heterocyklický kruh s 5 alebo 6 atómami v kruhu a s obsahom kyslíka alebo síry, obzvlášť 3-tienyl alebo 3-furyl.Mutácia určitého kmeňa čeľade Streptomyces avermitilis, produkujúceho avermektín, sa vykonáva známym spôsobom aje možno pri nej použiť celý rad mutačných činidiel, ako sú napríklad ultrafialové svetlo, X-lúče, pridanie N-metyl-NĽ nitro-N-nitrózoguanidínu, etylmetánsulfonátu,kyseliny dusitej a horčičného dusíka, napríklad N-metylbis(2-chlóretyl) amínu a podobne. Tvorbu mutácií je možné uskutočniť tak na spórach, ako na vegetatívnych kultúrach kmeňov S. avermitilis, ktoré sú schopné produkovať prírodné avermektíny, je napríklad možne použiť kmeň S. avermitilís ATCC 31272.Na základe postupov, ktoré sú v odbore veľmi dobre známe, je možné kolónie, získané mutagenézou, podrobiť selekcii na neprítomnosť dehydrogenázy Z-oxokyselín s rozvetveným reťazcom pri použití biochemických postupov, ktoré dovoľujú vyšetrenie veľkého počtu bakteriálnych kolónií, ktoré boli podrobené náhodnej mutagenéze podľa produkcie C 01 zo zvolených C-l-2-oxo kyselín s rozvetveným reťazcom, ako bolo opísané v publikácii Tabor a ďalší, J. Bact. 128, 485 - 486, 1976.Tento postup spočíva v tom, že sa pestujú kolónie získaných mutantov vo vyhĺbeniach mikrotitračnej platne na vhodnom živnom prostredí, prestupnosť buniek sa zvýši pôsobením toluénu a potom sa pridá zvolená MC-l 2-oxo kyselina, napríklad kyselina 2-oxoizokaprónová do každého vyhlbenia a prostredie sa vyšetruje nad jednotlivými vyhĺbeniami na prítomnosť značeného oxidu uhličitého. Je možne tiež použiť kyselinu l 4 C-l-2-oxo-3-metylvalerovú alebo kyselinu C-1-2-oxo-3-metylmaslovú namiesto uvedenej kyseliny ląC-lł-oxo-ízokaprónovej. Produkcia značeneho oxidu uhličitého sa ľahko zisťuje tak,že sa jednotlivé vyhĺbenia prekryjú vlhkým ñltračným papierom, nasýteným hydroxidom bámatým, aby bolo možné zachytiť akýkoľvek značený oxid uhličitý a preukázať ho vo forme značeného uhličitanu bárnatého autorádiografiou. Mutanty, ktorým chýba dehydrogenáza Z-oxokyselín s rozvetveným reťazcom, poskytujú autorádiogramy, ktoré sa približujú tým, ktoré boli získané od nenaočkovaných kontrolných kolónií, to znamená, že mutanty neprodukujú žiaden značený uhličitan bárnatý.Takto získané mutanty sa potom podrobía ďalšej mutagenćze pri použití akéhokoľvek uvedeného činidla, ktoré môže spôsobiť vznik mutácie. Takto získané kolónie sa skúšajú na neprítomnosť účinnosti O-metyltransferázy avermektínu B chromatogratiou na tenkej vrstve alebo vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou po predchádzajúcej fermentácii, ktorá sa vykonáva za prítomnosti pridaného prekurzora, napríklad kyseliny 2-metylmaslovej. Averrnektíny A sú v podstate neprítomné v prostrediach, v ktorých boli pestované uvedené mutanty.Okrem produkcie požadovaných alel daného kmeňa mikroorganizmu mutagenézou umožňuje fúzia protoplastov včleneníe požadovaných alel jedného kmeňa do chromozómu ďalšieho kmeňa. Napríklad kmeň S. avermitilis, ktorému chýba dehydrogenáza 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom a O-metyltransferáza avermektínu B, môže fúziou protoplastov s kmeňom S. avermítílís, ktorý obsahuje uvedenú účinnosť, produkovať kmeň S. avermítílís, ktorému chýba iba O-metyltransferáza avermektínu B. Ako je v odbore známe, je možné získať fúziou protoplastov rôznekombinácie žiaducich alel z divergentných línii a spojiť ich v jedinom kmeni.Morfologické vlastnosti a vlastnosti pri pestovaní v kultúre sú pre mutanty, získané V priebehu spôsobu podľa vynálezu podstatne zhodné s vlastnosťami, ktore boli opísane v US patentovom spise č. 4 429 042. Rozlišujúcou vlastnosťou mutantov, získaných uvedeným spôsobom je skutočnosť, že tieto mutanty neobsahujú dehydrogenázu 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom alebo O-metyltransferázu avermektínu B. Tieto vlastnosti je možné preukázať uvedeným spôsobom. Nedostatok týchto vlastností má za následok neschopnosť mutantu produkovať prírodné avermektíny B pri pestovaní na deñnovanom prostredí, ktoré je v podstate zbavené alifatických kyselín všeobecného vzorca RCOOH, v ktorom R znamená izopropyl alebo (S)-sek.butyl alebo zlúčenín, ktore je možné v priebehu fennentácie na zlúčeninu všeobecného vzorca RCOOH previesť. Taxonomicke výskumy, ktoré boli vykonávané V zbierke American Type Culture Collection,potvrdili, že vlastnosti mutantu I-3, izolovaného pri použití značeného oxidu kremičitého, sú veľmi blízke vlastnostiam pôvodného kmeňa ATCC 31272, opísanćho v US patentovom spise č. 4 429 042 s niektorými výnimkami. Mutant I-3(ATCC 53567) tvorí podstatne menší počet reťazcov spór ako materský kmeň ATCC 31272. V našich pokusoch nebolo možné použitím rafinózy zlepšiť rast mutantu I-3. Na rozdiel od pokusu, ktorý je uvedený pre kmeň ATCC 31272 v US patentovom spise č. 4 429 024 nebolo možné pozorovať rast mutantu alebo kmeňa ATCC 31272 pri použití sacharózy ako jediného zdroja uhlíka. Mutant -3 nemá dehydrogenázu 2-oxo kyselín s rozvetvenýnn reťazcom. Dvojnásobne deficientný mutant, kmeň S. avermitilis 7881, ktorý nemá ani dehydrogenázu Z-oxo kyselín s rozvetveným reťazcom, ani 0-metylnansferázu avermektínu B, produkovaný ďalšou mutagenézou pri použití kmeňa I-3 (ATCC 53567), má k pôvodnému materskému kmeňu ATCC 31272 podobné taxonomícké vzťahy ako mutant I-3.Kmene Streptomyces avermitilis l-3 a 7881 boli uložené V medzinárodnej zbierke kultúr American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, odkiaľ je možné obidva uvedené kmene voľne získať, len čo bude udelený patent na pôvodnú prihlášku. Tieto kmene boli označené Streptamyces avermitilis ATCC 53567 a ATCC 53692. Uložené kultúry sú V priebehu konania materskej prihlášky dostupné iba podľa ustanovení Commissioner of the United States Patent and Trademark Office pod označením 37 CFR 1.14 a 35 USC 122 v súlade so zákonom. Všetky obmedzenia dostupnosti uvedených mikroorganizmov, uložených v uvedenej zbierke však budú neodvolateľne zrušené, len čo bude na pôvodnú prihlášku udelený patent.Každý z kmeňov S. avermitílís ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 a NCIB 12121 je schopný produkcie prírodných avermektínov, ktoré je možné označiť všeobecným vzorcom (l)prerušovaná čiara v polohe 22 - 23 znamená prípadnú dvo jitú väzbu, R 1 znamená hydroxylovú skupinu iba v prípade, že nie je prítomná dvoj itá väzba, R 2 znamená 4-(a-L-oleandrozyD-or-L-oleandrozylskupinu vzorcaR 3 znamená atóm vodíka alebo metyl a R znamená izopropyl alebo (S)-sek.-butyl.V US patentovom spise č. 4 285 963 sa opisuje avermektín všeobecného vzorca (l), ktorý je v polohe 25 substituovaný metylovou a etylovou skupinou, R 1 znamená hydroxylovú skupinu a R 3 znamená metylový zvyšok.V averrnektínoch iného ako prírodného pôvodu, ktoré je možné získať spôsobom podľa vynálezu, znamená R odlišný Substituent od izopropylovej alebo (S)-sek.-butylovej skupiny.Zlúčeniny, ktoré sú nevyhnutné pri biosyntćze zlúčenín všeobecného vzorca (I), sa nachádzajú v bunke S. avermítilis a v živnom prostredí. Tieto látky vznikajú rozkladom L-valínu a L-izoleucínu alebo z ich zodpovedajúcich 2-oxokyselín dekarboxyláciou týchto Z-oxokyselin príslušnou dehydrogenázou za súčasnej väzby získaného produktu na koenzým A. Prítomnosť týchto látok zaisťuje súčasnú produkciu zlúčenin všeobecného vzorca (I), V ktorých je substituentom izopropylová skupina a (S)-sek.butylová skupina. Samozrejme, vznikajú problémy pri oddeľovaní derivátov s obsahom izopropylovej skupiny od derivátov,ktoré obsahujú (S)-sek.butylovú skupinu.V prípade ferrnentácie v živnom prostredí, ktoré obsahuje príslušné východiskové látky, sú mutanty, získané uvedeným spôsobom schopne produkovať zlúčeninu všeobecného vzorca (I) alebo častejšie zmes dvoch zlúčenín všeobecného vzorca (l), v ktorých Substituent R zodpovedá použitej východiskovej látke. Je možné získať dva produkty, ktoré sa zvyčajne nazývajú R-avermektín B 1 a B 2,podľa označenia, ktoré bolo použité v US patentovom spise č. 4 429 042. Substituent R sa nachádza v polohe 25 získaného výsledného produktu. Napríklad v prípade, že R znamená cyklopentylový zvyšok, je možné získať nasledujúce dva avermektínové derivátyV avermektínových derivátoch neprírodného pôvodu má substituent R v polohe 25 všeobecného vzorca (I) odlišný význam od ízopropylovej alebo (S)-sek.butylovej skupiny.Zlúčeniny všeobecného vzorca (I), v ktorých je prítomná dvojitá väzba a ktoré neobsahujú hydroxylovú skupinu,je možné získať tiež zo zodpovedajúcich zlúčenín všeobecného vzorca (I), v ktorom R znamená hydroxylovú skupinu a zlúčenina neobsahuje dvojitú väzbu dehydratáciou. Reakcia sa vykonáva tak, že sa najprv selektívne chránia hydroxylové skupiny, ktoré sa nachádzajú v polohách 5 a 4, napríklad naviazaním terc.-butyldimetylsilyloxyacetylovej skupiny, načo sa vykonáva reakcia so substituovaným tio karbonylhalogenidom, napríklad so (4-metylfenoxy) tiokarbonylchloridom s následným zahrievaním vo vysoko vriacom organickom rozpúšťadle, napríklad v tríchlórbenzéne pre dosiahnutiu dehydratácie. V získanom produkte sa potom odštepia ochranné skupiny, čím sa získa nenasýtená výsledná látka. Tento postup spolu s príslušnými reakčnými činidlami a reakčnými podmienkami bol opísaný v US patentovom spise č. 4 328 335.Zlúčeniny všeobecného vzorca (I), v ktorom R znamená atóm vodíka a dvojitá väzba nie je prítomná, je možné získať zo zodpovedajúcich zlúčenín, ktoré obsahujú dvojitú väzbu a neobsahujú Substituent R selektívnou katalytíckou hydrogenáciou pri použití príslušného katalyzátora. Redukciu je možné uskutočniť napríklad pri použití tris(trífenylfosñmródiumchloridu s obsahom jednoväzobného ródia, ako bolo opísané v uverejnenej európskej patentovej prihláške č. 0001689 a v zodpovedajúcom US patentovom spise č. 4 199 569, vydanom 22. apríla 1980.Zlúčeníny všeobecného vzorca (I), v ktorom R 2 znamená atóm vodíka, je možné získať zo zodpovedajúcich zlúčcnín, v ktorých RZ mamená 4-(oL-L-oleandr 0 zy 1)-a-L-oleandrozyloxyskupinu tak, že sa odstráni 4-(ix-L-oleandrozyD-or-L-oleandrózová skupina miemou hydrolýzou pôsobením kyseliny v zmesi vody a organického rozpúšťadla,čím sa získa aglykón s hydroxyskupinou v polohe 13. Tento aglykón sa potom halogenuje, napríklad reakciou s benzénsulfonylhalogenidom, čím sa získa l 3-deoxy-13-halogénovaný derivát, ktorý sa potom podrobí selektívnej redukcii, napríklad pri použití hydridu tributylcínu. Aby bolo možné zabrániť nežiaducim vedľajším reakciám, je žiaduce chrániť akúkoľvek ďalšiu hydroxylovú skupinu,napríklad naviazaním ochrannej terc.-butyldimetylsilylovej skupiny. Túto skupinu je potom možno ľahko odstrániť po vykonanej halogcnácii alebo redukcii pôsobením metanolu,ktorý obsahuje malé množstvo kyseliny. Všetky tieto postupy sú spolu s príslušnými reakčnými činidlami a reakčnýmí podmienkami pri ich vykonávaní opísané v uverejnenej európskej patentovej príhláške č. 0002615.Zlúčeniny, ktoré je možné využiť pri fermentácii S. avermítílis pre biosyntézu avennektínov tak prírodného, ako neprírodného pôvodu, je možné vyjadriť všeobecným vzorcom (II-A)vrátane zlúčením, ktoré je možné previesť na zlúčeniny II-A v priebehu fennentačného postupu. Tieto látky sú tiež nazývané priméry. Vo všeobecnom vzorci (II-A) znamená R skupinu s reťazcom, vysvetleným v (at-polohe, pričom atóm uhlíka,ku ktorému je viazaná skupina -COOH, je rovnako viazaná na aspoň dva ďalšie atómy alebo skupinu, odlišné od atómu vodíka. Je zrejmé, že toto vymedzenie zahrnuje nasýtenć i nenasýtené acyklické a cyklické skupiny, vrátane skupín,ktoré prípadne obsahujú ako heteroatóm atóm kyslíka alebo síry ako člen acyklického reťazca alebo kruhu.Substituent R, ktorý sa nachádza v polohe 25, môže teda byť alkylový zvyšok, alkenylový zvyšok, alkinylový, alkoxyalkylový alebo alkyltioalkylový zvyšok vždy s 3 až 8 atómami uhlíka, rozvetvený v polohe a, cykloalkylalkylový zvyšok s 5 až 8 atómami uhlíka, V ktorom alkylová skupina obsahuje 2 až 5 atómov uhlíka a je rozvetvená V polohe oc,ďalej cykloalkyl s 3 až 8 atómami uhlíka alebo cykloalkenyl s 5 až 8 atómami uhlíka, vždy prípadne substituovaný metylénovým zvyškom alebo jednou alebo väčším počtom alkylových skupín s l až 4 atómami uhlíka alebo atómami halogénu, a to íluóru, chlóru, jódu alebo brómu, ďalej heterocyklický zvyšok s 3 až 6 atómami V kruhu s obsahom

MPK / Značky

MPK: A61K 31/71, C12N 1/14, C12P 17/18

Značky: avermektínu, streptomyces, avermitilis, spôsob, výroby

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/11-279351-streptomyces-avermitilis-a-sposob-vyroby-avermektinu-b.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Streptomyces avermitilis a spôsob výroby avermektínu B</a>

Podobne patenty