Spôsob výroby sialylovaných oligosacharidov

Číslo patentu: E 16234

Dátum: 07.03.2007

Autor: Samain Eric

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 Predložený vynález sa týka spôsobu vo veľkom meradle invivo syntézy sialylovaných oligosacharidov, kultivovania mikroorganizmu V kultivačnom médiu, prípadne zahŕňajúcom exogénny prekurzor, ako je laktóza, pričom uvedenýmikroorganizmus obsahuje heterológne gény CMP-Neu 5 Ac syntetázu,syntézu kyseliny sialovej, epimerázu GlcNAc-6-fosfátu 2 a sialyltransferázu, a kde endogénne gény kódujúce aldolázu sialovej kyseliny (NanA) a ManNac kinázu (NänK) boli deletované alebo deaktivované. Tento vynález sa tiež týka tohto mikroorganizmu, ktorý je schopný produkovať vnútorne aktivovanú0002 N-Acetylneuramínová kyselina (Neu 5 Ac) je najobvyklejším členom skupiny kyseliny sialovej aminocukrov. Neu 5 Ac sa často nachádza ako koncový cukor v komplexných uhľohydrátoch bunkového povrchu a hrá hlavnú úlohu v mnohých biologických procesoch, ako je bunková adhézia a naviazanie toxínov a vírusu (Varki, 1993). Neu 5 Ac je tiež hlavnou zložkou uhľohydrátovej časti gangliozidov, ktoré sú pozoruhodne početné v tkanive mozgu a sú0003 Z dôvodu ich dôležitých biologických funkcií priťahujú oligosacharidy obsahujúce kyselinu sialovú značný záujem. Bolo vyvinutých mnoho spôsobov syntézy týchto štruktúr pre základnýsialylovaných oligosacharidov vo veľkom meradle nebola dosiaľ0004 Chemické syntézy nie sú praktické z dôvodu mnohých stupňov chránenia a odstraňovania chránenia funkčných skupín. Veľké úsilie bolo vynaložené na enzymatické a biotechnologické spôsoby. Sialyltransferázy používajú CMP-Neu 5 Ac ako aktivovaný cukor-nukleotid. Vyvinutie účinných procesov enzymatickýchsyntéz sialyloligosacharidov bolo možné vďaka identifikáciibakteriálnych sialyltransferázových génov, ktoré sú dobre exprimované v E. coli a navrhnutie mnohých enzymatických systémov, ktoré napodobňujú prirodzenú cestu biosyntézy0005 Významné zlepšenie neskôr prišlo pri použití žijúcich bakteriálnych buniek, ktoré produkujú sialyloligosacharidy(Priem a spol. 2002). V tomto prístupe bola sialyllaktóza priamo vyrábaná rastúcimi bunkami metabolickým inžinierstvom zostavenými kmeňmi Escherichia coli nadexprimujúcimi gény Neisseria meningitidis pre d-2,3-sialyltransferázu a pre CMPNeu 5 Ac syntázu. Tieto baktérie rástli vo vysokej bunkovej hustote s glycerolom ako zdrojom uhlíka a zdrojom energie,pričom exogénna laktóza a Neu 5 Ac boli dodávané ako prekurzory pre syntézu sialyllaktózy. Počas rastu boli laktóza a Neu 5 Ac aktívne internalizované permeázami E. coli B-galaktozidu a Neu 5 Ac. Na zabránenie katabolizmu laktózy a Neu 5 Ac boli použité kmene mutantu zbavené aldolázových aktivít B-galaktozidázy a Neu 5 Ac. Laktóza a Neu 5 Ac sa akumulovali V cytoplazme, kde bola Neu 5 Ac premenená na CMP-Neu 5 Ac, ktorá je ďalej premenená na laktózu, takže sa vytvorí sialyllaktóza (náš európsky patent EP 1194584). Tento systém bol aplikovaný na výrobu uhľohydrátovej časti gangliozidov GM 2 a GM 1 dodatočným exprimovaním príslušných glykozyltransferázových génov (Antoine a spol. 2003). Polysialylované oligosacharidy (GD 3 a GT 3 cukry) boli tiežprodukované týmto spôsobom a s génom Campylobacter cstII, ktorý kóduje bifunkčnú a-2,3- a a-2,8-sialyltransferázu (naša0006 Produkcia sialyloligosacharidov vo veľkom meradle týmto mikrobiologickým spôsobom vyžaduje dôležité množstvo kyseliny sialovej ako prekurzoru. Kyselina sialová môže byť vyčistená z prírodných zdrojov, ako je mlieko a vaječný žĺtok, ale výťažky sú nízke a tento postup nie je vhodný na produkciu vo veľkom meradle. Kyselina sialová je všeobecne pripravovaná enzymatickou syntézou aldolázou kyseliny sialovej použitím N-acetylmanozamínu(ManNAc) a pyruvátu ako substrátu. Na zníženie ceny je ManNAc obvykle pripravovaný chemickou alebo enzymatickou epimerizáciou N-acetylglukozamínu, ktorý je lacnejším substrátom ako ManNAc(Lee a spol. 2004 Maru a spol. 1998). Napriek týmto zlepšeniam je cena kyseliny sialovej stále ešte relatívne vysoká a táto cena vadí vývoju ekonomického systému produkcie0007 Antoine a spol. (Chembiochem, zv. 4, č. 5, 9. mája 2003,str. 406-412) a Priem a spol. (Glycobiology, zv. 12, Č. 4,október 2002, str. 235-240) opisujú produkciu sialylovaných cukrov z laktózy a Neu 5 Ac ako vonkajších prekurzorov. Európsky patent č. 1 484 406 opisuje produkciu Neu 5 Ac v E. coli0008 Hamamoto Tomoki a spol. (Biotechnology and Biochemistry október 2005, zv. 69, č. 10, str. 1944-1950) opisuje enzymatickú syntézu CMP-Neu 5 Ac z GlcNAc a CMP použitím E. coli obsahujúcu heterológnu GlcNAc 6-P 2-epimerázu a heterológnu NeuAc syntázu v kombinácii s kvasinkovými bunkami a vyčistenú H. influenza CMP-NeuAc syntetázou. Spis WO 2005/090552 sa týka produkcie sialylovaných glykoproteínov V kvasinkách a Ends a spol.produkciu sialyloligosacharidov kombinovaním dvoch rôznych E.0009 Tiež kmene ako E. coli K 1 a N. meningitidis sú schopné produkovať CMP-Neu 5 Ac, ale sú patogénne a nemôžu byť používané v biotechnologických procesoch z bezpečnostných dôvodov. Väčšina iných baktérií, zahŕñajúcich E. coli Kl 2, nemajú enzymatický systém pre biosyntézu CMP-Neu 5 Ac. Cieľom tohto vynálezu je genetickýn inžinierstvom pripraviť nepatogénne kmene, ktoré byboli schopné produkovať CMP-Neu 5 Ac z endogénnej UDP-GlcNAc.0010 V súvislosti s predloženým vynálezom. sme navrhli nový mikrobiálny systém po produkcii sialyloligosacharidov vo veľkom meradle a cenove efektívne bez potreby exogénneho dodávania kyseliny sialovej. Metabolicky inžinierskym spôsobom pripravené mikroorganizmy podľa vynálezu sú životaschopné, nepatogénne a môžu byť používané vo veľkom meradle a V priemyselných kultivačných procesoch. Majú optimalizované modifikované cesty prípravy a delécie zbytočných metabolických cyklov a vedú k biosyntéze aktivovanej CMP-Neu 5 Ac, ktorá slúži ako in situdonor kyseliny sialovej na tvorbu sialylovaných oligosacharidov.0011 Predložený vynález poskytuje spôsob vyrábania sialylovaných oligosacharidov fermentatívnym rastom mikroorganizmov. Konkrétne sa tento vynález týka spôsobu syntézy oligosacharidov nesúcich jeden alebo niekoľko zvyškov kyseliny sialovej bez akéhokoľvek vonkajšieho pridávania kyselinysialovej ku kultivačnému mediu, zahŕňajúci, ale bez obmedzení na- oligosacharidové časti gangliozidov vybrané 2

MPK / Značky

MPK: C12N 9/10, C12P 19/18, C12N 1/21, C12N 9/04, C12P 19/26, C12N 9/12

Značky: spôsob, oligosacharidov, výroby, sialylovaných

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/107-e16234-sposob-vyroby-sialylovanych-oligosacharidov.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob výroby sialylovaných oligosacharidov</a>

Podobne patenty