PCV2 imunogénne kompozície a spôsob produkovania takýchto kompozícií

Číslo patentu: E 18650

Dátum: 29.12.2005

Autori: Schaeffer Merrill Lynn, Nitzel Greg, Eichmeyer Marc Allan

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Táto prihláška obsahuje zoznam sekvencií vpapierovej verzii avo formáte čitateľnomJeden aspekt predkladaného zverejnenia sa týka získania proteínu exprimovaného pomocou otvoreného čítacie rámca 2 (ORF 2) prasacieho cirkovírusu typ 2 (PCVZ). Konkrétne, proteín je rekombinantný proteín exprimovaný pomocou transfektovaného vírusu obsahujúceho rekombinantné kódujúce sekvencie pre prasací cirkovírus typu 2, otvorený čítací rámec 2. Konkrétnejšie, transfektovanému vírusu je umožnené infikovať bunky vrastovom médiu a proteín exprimovaný pomocou otvoreného čítacieho rámca 2 je získaný zo supematantu,skôr ako z prostredia buniek. Najvýhodnejšie, spôsob zahrnuje kroky amplifikácie otvoreného čítacieho rámca 2 génu z prasacieho cirkovírusu typu 2, klonovania tejto amplifikovanej časti do prvého vektora, odstránenia časti otvoreného čítacieho rámca 2 ztohto prvého vektora a klonovania do prenosového vektoru, kotransfekcie prenosového vektora s vírusovým vektorom do buniek v rastovom médiu, a kroky vedúce k tomu, aby sa bunky stali infekčné prostredníctvom vírusového vektoru, čím dôjde kexpresii otvoreného čítacieho rámca 2,a kroky vedúce k získaniu exprimovaného rekombinantného proteínu kódovaného otvorenýmVďalšom aspekte, sa predkladané zverejnenie týka imunogénnej kompozície účinnej na vyvolanie imunitnej odpovede proti PCV 2, a spôsobov prípravy týchto imunogénnych kompozícií. Výhodnejšie, predkladané zverejnenie sa týka imunologickej kompozície účinnej pri poskytovaní imunitnej odpovede, ktorá chráni zviera, ktorému bola kompozícia podaná aredukuje alebo zmierňuje prejavy klinických symptómov spojených s PCV 2 infekciou. Najmä sa predkladané zverejnenie týka imunologickej kompozícii na báze proteínu, ktorá poskytuje účinnú ochranu pred PCV 2 infekciou. Obzvlášť sa predkladané zverejnenie týka imunologickej kompozície obsahujúcej ORF 2-PCV 2, pričom podanie of PCV 2-ORF 2 má za následok ochranu pred PCV 2 infekciou. Ďalej sa predkladané zverejnenie týka imunologickej kompozície, ktorá prepožičiava účinnú imunitu ošípaným, ktorým bola podaná, pričomkompozícia obsahuje proteín exprimovaný ORF 2-PCV 2.Opis doterajšieho stavu technikyPrasací cirkovírus typu 2 (PCV 2) je malý (17 -22 nm V priemere), ikozahedrálny, nezabalený DNA vírus, ktorý obsahuje jednovláknový kruhový genóm. Kim a kol. (J. Vet. Sci, 2002,3(l) 19-23) charakterizujú rekombinantné proteíny PCV 2 izolátu exprimovaného V bakulovírusovom systéme. Nawagitgul a kol. (J. Gen. Virol, 2000, 81 2281-2287) uvádza,že hlavný štrukturálny proteín PCV 2 je kódovaný pomocou ORF 2. PCV 2 zdieľa približne 80 sekvenčnú identitu s prasacím cirkovírusom typu 1 (PCVl). Avšak, na rozdiel od PCVl,ktorý je vo všeobecnosti nevirulentný, ošípané infikované PCV 2 vykazujú syndróm bežne nazývaný ako syndróm multisystémového chradnutia prasiat po odstavení od materského mlieka (Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS. PMWS je klinicky charakterizované stratou hmotnosti, bledosťou kože, stratou schopnosti sať materské mlieko,respiračnou bolesťou, hnačkou, žltačkou. Uniektorých nakazených ošípaných sa prejavila kombinácia všetkých príznakov, zatiaľ čo uniektorých sa vyskytol len jeden alebo dva symptómy. Počas pitvy sa pozorovali mikroskopickć amakroskopicke lézie na viacerých tkanívách a orgánoch, najčastejším miesto výskytu lézii boli lymfatické orgány. Silná korelácia bola pozorovaná medzi množstvom PCV 2 nukleovej kyseliny alebo antigénom a rozsahom lymfatických lézií. Percento úmrtnosti u ošípaných infikovaných PCV 2 je približne 80. Okrem syndrómu PMWS, sa PCV 2 vyskytuje aj pri niekoľkých ďalších infekciách zahrnujúcich pseudobesnotu, prasací reprodukčný a respiračný syndróm (PRRS),Glasserovo ochorenie, streptokokovú meningitídu, salmonelózu, kolibacilózu po odstavení od materského mlieka, dietetickú hepatózu, a hnisavú bronchopneumóniu.Protein otvoreného čítacieho rámca 2 (ORF 2) z PCV 2, majúci molekulovú hmotnosť približne 30 kDa zistenú na základe reakcie na SDS-PAGE gély, bol V minulosti využívaný ako antigénová zložka vo vakcínach pre PCV 2. Blanchard a kol. (Vaccine 21, 2003, 45654575) opisujú vakcinačné protokoly s dvomi injekčnými dávkami založené na DNA využívajúce 72 hodinovú kultiváciu pri príprave surového proteínového lyzátu. Typické metódy získania ORF 2 na použitie vtakýchto vakcínach vo všeobecnosti zahmujú ampliñkáciu PCV 2 DNA, ktorá kóduje ORF 2, transfekciu vírusového vektora s ORF 2 DNA,inñkovanie buniek vírusovým vektorom obsahujúcim ORF 2 DNA, umožnenie vírusu exprimovať ORF 2 proteín vo vnútri bunky, aextrakciu ORF 2 proteínu z bunky prostredníctvom bunkovej lýzy. Tieto postupy vo všeobecnosti trvajú asi štyri dni po infekciibuniek pomocou vírusového vektoru. Avšak, tieto postupy majú nevýhodu vtom, žeextrakčné postupy sú finančne náročné atiež časovo náročné. Navyše, množstvo ORF 2 ziskaného z buniek nie je veľmi veľké takže je potrebné veľké množstvo buniek, ktoré by mali byt infikované veľkým počtom vírusových vektorov, aby sa získalo dostatočnémnožstvo rekombinantného exprimovaného proteínu na použitie vo vakcínach a podobne.Súčasné spôsoby PCV 2 imunizácie zahmujú vakcíny na báze DNA, také ako tie, ktoré sú opísané v U.S.Patente č. 6,703,023. Avšak, takéto vakcíny boli neúčinné z hľadiska získania ochrannej imunity proti PCV 2 infekcii a z hľadiska klinických indikácií spojených s týmitoTeda, to čo je potrebné vtomto odbore, je spôsob získania ORF 2 proteínu, ktorý by nevyžadoval extrakciu ORF 2 proteínu z vnútra infikovaných buniek. Čo je ďalej potrebné, sú spôsoby získania rekombinantného ORF 2 proteínu vmnožstvách dostatočných na účinnú prípravu vakcínových kompozícii. Čo je ešte ďalej potrebné, sú spôsoby získania ORF 2 proteínu, ktoré si nevyžadujú komplikované aprácne postupy, ktoré sú nevyhnutné pre súčasné extrakčné postupy pre proteín ORF 2. Nakoniec, s ohľadom na kompozície, to čo je potrebné V danom odbore sú imunogénne kompozície, ktoré vykazujú ochrannú imunitu proti PCV 2 infekcii azmierňujú intenzitu klinických príznakov alebo predchádzajú klinickýmPredkladaný vynález rieši problémy vyplývajúce zo stavu techniky aposkytuje odlišný1. Spôsob získania rekombinantného proteínu exprimovaného pomocou otvoreného čítacíeho rámca 2 PCV 2 v supernatante, pričom uvedený spôsob zahmuje nasledujúce kroky i) inñkovanie buniek v rastovom médiu bakulovírusovým vektorom obsahujúcim uvedený otvorený čitací rámec 2ii) umožnenie uvedenému bakulovímsovému vektoru exprimovať uvedený proteín otvoreného čítacíeho rámca 2 aíii) získania uvedeného exprimovaného proteínu otvoreného čítacíeho rámca 2 v supematante, kde uvedené získanie nastáva najmenej 5 dní po infekcii buniek uvedeným2. Spôsob podľa bodu 1, zahmujúci krokyA) klonovania uvedeného rekombinantného otvoreného čítacieho rámca 2 z PCV 2 do prenosového vektoraB) zavedenia časti uvedeného prenosového vektora obsahujúceho uvedený rekombinantný otvorený čítací rámec 2 do bakulovírusuD) umožnenia uvedenému bakulovírusu exprimovať proteín otvoreného čítacie rámca 2 z uvedeného otvoreného čítacieho rámca 2E) separovania buniek obsahujúcich uvedený bakulovírusový vektor zo supematantu aF) získania uvedeného exprimovaného proteínu otvoreného čítacieho rámca 2v uvedenom supematante najmenej päť dní po infikovaní buniek uvedeným bakulovírusom.3. Spôsob podľa bodu l alebo bodu 2, kde exprimovaný proteín otvoreného čítacieho rámca 2 je vylučovaný bunkami do obklopujúceho rastového média a kde proteín otvoreného4. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z bodov l-3, kde uvedený spôsob ďalej zahmuje krok ampliñkovania uvedeného otvoreného čítacieho rámca 2 z kmeňa PCV 2 pred klonovanímuvedeného otvoreného čítacieho rámca do uvedeného prenosového vektora.5. Spôsob podľa ktoréhokoľvek zbodov l-4, kde uvedený rekombinantný otvorený čítací rámec 2 ďalej zahrnuje sekvenciu vybranú zo skupiny obsahujúcej 5 Kozakovúsekvenciu a 3 EcoRl miesto, a ich kombinácie. 6. Spôsob podľa bodu 5, kde uvedená 5 Kozáková sekvencia obsahuje SEQ ID NO l. 7. Spôsob podľa bodu 5, kde uvedené 3 EcoRl miesto obsahuje SEQ ID N 0 2.8. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z bodov l až 7, kde uvedený PCV 2 otvorený čítací rámec obsahuje SEQ ID NO 4.9. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z bodov l až 7, kde uvedený rekombinantný proteinotvoreného čítacieho rámca 2 obsahuje SEQ ID No 6.10, Spôsob podľa ktoréhokoľvek zbodov 1 až 8, kde uvedené médium je hmyziebunkové médium bez séra.

MPK / Značky

MPK: C12Q 1/68, A61K 39/12, C12N 7/04, C07K 14/01

Značky: imunogénne, kompozícií, kompozície, takýchto, spôsob, produkovania

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/102-e18650-pcv2-imunogenne-kompozicie-a-sposob-produkovania-takychto-kompozicii.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">PCV2 imunogénne kompozície a spôsob produkovania takýchto kompozícií</a>

Podobne patenty