Spôsob výroby bielkovinových látok

Číslo patentu: 287740

Dátum: 28.07.2011

Autori: Gorr Gilbert, Reski Ralf

Je ešte 2 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Je opísaný spôsob výroby heterológnych bielkovinových látok z rastlinného materiálu, pri ktorom sa kultivuje protonemálne tkanivo machov a požadované cieľové látky sa získavajú z kultivačného média, v podstate bez porušenia tkaniva a buniek. Tento spôsob umožňuje cenovo efektívnu výrobu všetkých druhov heterológnych bielkovín v ich aktívnej forme za štandardných podmienok.

Text

Pozerať všetko

Predložený vynález sa všeobecne týka oblasti výroby bielkovínových látok v rastlinnom materiáli. Vynález sa týka osobitne nového spôsobu výroby požadovaných bielkovinových látok v rnachoch.Doteraj ší stav technikyVyužívanie biotechnologických metód na výrobné účely je pre ľudstvo dôležitou možnosťou výroby látok, ktoré nemôžu byť vyrábané ekonomicky inými spôsobmi - pokiaľ vôbec môžu byt vyrábané - napriklad chemickou syntézou, a ktoré sú ako suroviny dostupné z prirodzených zdrojov v nedostatočnom rrmožstve. I keď je známych cez 10 000 sekundárnych metabolitov rastlinných látok, v priemysehrom meradle sa vyrábajú pomocou rastlinných bunkových kultúr iba niekoľko týchto zlúčenín. Tieto látky sú prevažne farmaceuticky účinne sekundárne metabolity. Medzi príklady, o ktorých je potrebné sa zmierniť, patrí a) berberín (výroba v meradle 4000 l), ktorý má bakteriostatické a fungicídne účinky (Fujita, Y. a Tabata, M. in Plánt tissue and celí culture, Plánt science, 3, 169 Green, C. E., et al., (Ed.), A. R. Líss Inc New York, 1987), b) shikonin (v meradle 750 l), ktorý má antibiotické a protizápalové účinky (Tabata, M. a Fujita, Y., in Biotechnology in plánt science, 207 - 218, Day, P., et al (Ed.), Academic Press, Orlando, 1985), a c) paclitaxel (v meradle 75000 l) známy viac pod názvom taxol, ktorý má protinádorové účinky (J azirí, M., et al Taxus sp. cell. tissue and organ cultures as altematíve sources for taxoids production a literatúre survey, Plant Cel Tiss. Org. Cult., 46, 59 - 75, 1996).Ďalšou dôležitou biotechnologickou metódou, v ktorej sa využívajú rastlinné bunkové kultúry, je biotransformácia digitoxínu na digoxín - liečivo na srdce a krvný obeh. Táto stereošpecifická hydroxylačná reakcia sa úspešne vykonáva V bioreaktore s kultúrami Digitalis lanata (Reinhard, E. a Kreis, W., Kultivierung von ptlanzlichen Zellen im Bioreaktor Kultivácia rastlinných buniek v bioreaktore Bio. Engin., 5, 135 - 136. 1989) s vysokými výťažkarni. Doterajšiu a rozsiahlu rešerš využitia rastlinných bunkových kultúr v biotechnológii je možné nájsť v Muhlbach, H.-P., Use of plant cell cultures in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 4, 113- 176, 1998).Vývoj metód genetickej transformácie vyšších rastlín na počiatku deväťdesiatych rokov umožnil významne zvýšiť produktivitu špecifických sekundámych zložiek rastlinami transformáciou génov špeciñckými kľúčovými enzýmarni zodpovedajúcimi metabolickýrni cestami. Boli využité nielen transgénne intakmé rastliny, ale tiež rastlinné bunkové kultúry. Ako príklady možno uviesť zmeny expresie bakteriálnej lysindekarboxylázy v transgénnych kultúrach koreňových vlákien Nicotiana tabacum, ktoré zvýšili výťažok biogénnych amínov kadaverínu a anabazínu až l 4-krát (Berlin, J., et ai., Genetic modification of plant Secondary metabolism Alternation of product levels by overexpression of amino acid decarboxylases, in Advances in Plant Biology, Studies in Plant Science, 4, 5 7- 8 l , Ryu, D. D. Y. a Furasaki, S. (Ed.), Elsevier. Amsterdam,1994).Možnosť transféru DNK do rastlín nielenže otvorila kvantitatívne a kvalitatívne zmeny súčastí rastlín, ale rastliny a rastlinné bunkové kultúry sa navyše stali zaujímavejšie na výrobu heterológnych proteínov (Moffat,A. S., High-Tech plants prornise a bumber crop of new products, Science, 256, 770 - 771, 1992), a na to boli zvolené dva principiálne odlišné prístupy.Jeden prístup spočíva vo výrobe heterológnych proteínov v transgénnych intaktných rastlinách. Vedľa výroby protilátok v transgénnych tabakových rastlinách (Ma, J. K.-C., et al., Generation and assembly of secretory antibodies in plants, Science, 268. 716 - 719, 1995), bola opísaná expresia a regulované spracovanie ľudského serumalbumínu tak v transgénnych tabakových rastlinách, ako aj v transgénnych rastlinách zemiakov(Síjmons, P. C., et al., Production of correctly processed human serum albumin in transgenic plants,Bio/Techn., 8, 217 - 221. 1990). Ľudský epidermálny rastový faktor (hEGF) bol v transgénnych tabakových rastlinách expresovaný tiež (Salmanian, A.-H., et al., Synthesis and expression of the gene for human epidermal growth factor in transgenic potato plants, Biotechnol. Lett., 18, 1095 - 1098, 1996). Boli však využité aj iné rastliny. Leu-encefalírr bol úspešne vyrobený s použitím Arabidopsis thalíana a Brassica napus (Krebbers, E. a Vandekerckhove, J., Production of peptides in plant seeds, Tibtech, 8, 1 - 3, 1990). Dalej boli na expresiu chimerických virusových častíc, ktore pôsobia ako vakcíny, využité transgénne rastliny Vigna unguiculata (Dalsgaard, K., et al., Plant-derived vaccine protects target animals against a viral disease, Nat. Biotech., 15, 248 - 252, 1997).Principiálnou nevýhodou používania intaktných rastlín, ako sú rastliny uvedené ako príklady, je nutnost ich rastu, ktorý je časovo náročný a nákladný a pri výrobe v priemyselnom meradle vyžadujú veľkú kultivačnú plochu. Izolácia požadovaných cieľových látok z intaktných rastlín vyžaduje navyše obvykle zložité výrobné postupy, zvlášť, pokiaľ musia zloženie a akosť výrobku spĺňať vysoké požiadavky, ako je tomu v prípade látok, ktoré sa majú používat na farmaceutické alebo potravinárske účely.Druhý prístup spočíva vo využití transgénnych tabakových bunkových kultúr na výrobu protilátok. Opísané sú napríklad expresie protilátok a ich vylučovanie do média (Magnuson, N. S., et al., Enhanced recovery of a secreted mammalian protein from suspension culture of genetically modified tobacco cells, Prot. Expr. Pur., 7. 220 - 228, 1996). Pretože čistenie heterológnych proteínov z buniek je navyše zložité, poskytuje vylučovanie cieľového pretínu do média významné zlepšenie. Výroba rekombinantov farmaceutický vyhovujúcich proteínov v bunkových kultúrach je tiež zaujímavá z bezpečnostného hľadiska, pretože transgénne rastlinné bunky môžu rásť výhradne v bioreaktoroch a nemusia sa vypúšťať. Nevyhnutnú kultivačnú hmotu bolo umožnené vyrobit pri vývoji bioreaktorov pre rastlinné heterotropné bunkové kultúry vo väčšom meradle(napríklad Shuler, M. L., et al., Bioreactor engineering as an enabling technology to tap biodiversity The case oftaxol., Ann. N. Y. Acad. Sci., 745, 455 - 461, 1994).Základnou nevýhodou tohto druhého prístupu, V ktorom sa používajú suspenzíe rastlinných kultúr je malá rýchlosť rastu, pomerne pomalá tvorba sekundárnych metabolitov, inhibícia vytvárania produktov pri vysokých hustotách buniek, a z toho vyplývajúca nízka objemová produktivita, tvorba agregátov a zložiek bunkových stien a zvýšená citlivosť buniek na šmykové napätie. Tiež je nutne vziať do úvahy, že sa pri používaní heterotropných bunkových kultúr musia vybavovat komplexné médiá viacerými zložkami, z ktorých mnohé sú drahé. Najzávažnejšou nevýhodou, o ktorej je však nutné sa zmieniť, je výskyt somaklonálnych zmien v rastlinných bunkových kultúrach in vitro, ktoré so sebou pri výrobe heterológnych proteínov prinášajú kvantitatívne a kvalitatívne zmeny (pozri napríklad Jones, M. G. K. a Lindsey, K Plant biotechnology, in Molecular biology and biotechnology Walker, J. M. a Gingold. E. W. (Eds.), 2. vyd., Royal Soc. of Chem., Burlington House, London, 1988). Heterogenitu vytvorených produktov a ich funkčných vlastností nie je možné akceptovať, zvlášť v spojení s výrobou farrnaceutických a ďalších požadovaných látok, ktorých úradné schválenie vyžaduje zabezpečenie spoľahlivej akosti a norrnalízovaný výrobný postup.Predmetom predloženého vynálezu je teda zabezpečenie spôsobu normalizovanej výroby heterológnych bielkovínových látok v rastlinných materiáloch, ktoré nevyhnutne eliminujú nielen opisované nevýhody používania intaktných rastlín, ale tiež nevýhody používania systémov bunkových kultúr.Tento predmet je podľa vynálezu dosiahnutý zavedením nového spôsobu výroby heterológnyeh bielkovinových látok v rastlinnom materiáli, V ktorom sa plne diferencované rastliny machov ponechávajú rásť pri norrnalizovaných podmienkach a vytvorené bíelkovinove látky sa získavajú z kultivačného média bez porušenia produkčných tkanív či buniek.Termín bíelkovinová látka tak, ako sa tu používa, predstavuje peptidy, polypeptidy a proteíny a tiež ich fragmenty, ktoré sú vhodné zvlášť na diagnostické, klinické, farmaceutické a potravinárske účely. Zahŕňa tiež molekuly, ktoré majú peptidovú väzbu a ktorých informácia je rastlinným materiálom prenášaná.Pri riešení, ktorému sa podľa predloženého vynálezu dáva prednosť, sa požadované heterologné bielkovinové látky uvoľňujú do kultivačného média v biologicky aktívnej forme.Termínom biologicky aktívny tak, ako sa používa v predloženom opise, sa myslí to, že Cieľové látky vybavené týmto atribútom majú funkčné vlastnosti požadované či vyžadované na zodpovedajúci účel. Pokial sa napríklad vyžaduje vyrobiť protilátky, je vyrobený proteín alebo jeho funkčný fragment biologicky aktivny, pokiaľ je schopný vyvolať predpokladanú špecifickú väzbu s antigénom. Skúseným pracovníkom je jasné, že sa nie vždy na takýto účel požaduje úplný proteín, ale že je možné vyhľadávať epitópy či nízkomolekuláme štruktúry, ktoré zabezpečia požadovanú biologickú aktivitu alebo funkciu. Enzým je napríklad biologicky aktívny, pokiaľ je schopný konvertovať svoj cieľový substrát.V ďalšom riešení podľa vynálezu, ktorému sa dáva prednosť, sa ponecháva rastlinný materiál rásť vo forme intaktných rastlín machov v kultivačnom médiu, ktoré je absolútne bez cukrov, vitamínov a fytohormónov či ich ñmkčných fragmentov.Spôsob podľa vynálezu umožňuje rast intaktných a plne diferencovaných rastlín pri fotoautotropných podmienok, ktoré je možné normalizovať, t. j. bez požiadaviek na prídavok cukrov, vitamínov a fytohormónov a podobných tak, ako to bolo pri predchádzajúcom systéme využívajúcom heterotropné suspenzíe bunkových kultúr. Keďže je využívané lacné a jednoduché kultivačné médium, docieľuje sa jednotlivými stupňami získavanie a čistenie požadovaných cieľových látok vo významnom množstve.Rastlinným materiálom, ktorý sa podľa spôsobu tohto vynálezu používa, je prednostne intaktná machová rastlina vyberaná zo skupiny machov zahmujúcich druhy rodu Physcomitrella, Funaria, Sphagnum a Ceratodon a zahmujúcich druhy pečeňoviek rodu Marchantia a Sphaerocarpos, ktorým sa dáva zvlášť prednosť. Spôsob podľa vynálezu sa najlepšie uskutočňuje s využitím machu Physconritrella patens.V ďalšom riešení, ktorému sa dáva prednosť, sa skelet kyseliny nukleovej používa na transformačné kódovanie nielen požadovaných bielkovinových látok, ale tiež na prevod peptidov na vylučovanie látky z hostiteľskej bunky do kultivačného média. Ako je odbomíkom zrejmé, podľa tohto vynálezu môže byť použitáakákoľvek autológna a heterológna sekvencia kyseliny nukleovej, ktorá sa môže použiť na vytvorenie expresnej kazety na transformovaníe pracovného tkaniva. Pri transporte endoplasmického retikula či buniek sa dáva prednosť zvlášť využívaniu signálnych peptidov.Práce vykonané V predloženom vynáleze potvrdzujú, že opísaný problém sornaklonálnej variácie, s ktorým sa ráta v bunkových kultúrach, neexistuje vo fotoautotrofických kvapalných kultúrach machov. Machy použité podľa vynálezu majú ďalej pred inými systémami jasnú sekvenciu presne defmovaných diferenciačných stupňov (chloronéma, caulonéma, očko, gamatofory), ktoré môžu byť ovplyvnené prídavkom hormónov (kyselina índol-3-octová vyvoláva vznik caulonémy, isopentenyladenín vyvoláva vznik očiek (pozri napríklad Ashton, N. W., et al., Analysis of gametophytic development in the moss, Physcomitrella patens,using auxin and cytokinine resistant mutants, Planta, 144, 427 - 435, 1979). V kultivačných bioreaktoroch je teda možná smerovaná diferenciačno-špeciñcká expresia heterológnych proteínov a synchrónne delená, čistá,a tým homogénna kultúra chloronéma je podľa vynálezu zvlášť vhodná pre svoju kontrolovateľnú a rovnomernú produkciu proteínu v bioreaktore a pre svoju vhodnosť využitia od hormónov závislých či diferenciálne špecifických promótorov.Vedľa takých expresných systémov je možne tiež podľa vynálezu použiť systém indukovateľných promótorov, osobitne na výrobu proteínov s krátkym polčasom rozpadu, alebo cytotoxických, kde sa prednostne používa 1 -promótor Agrobacterium tumefaciens.Kultivácia machov navrhnutá podľa vynálezu na výrobu heterológnych proteínov pri ekonomických podmienkach môže byť realizovaná napríklad pri použití Physcomitrelly v objemoch od 20 ml cez 6 l až do 10 l a vyššie v miešaných kultúrach alebo v prevzdušňovaných sklenných nádržiach (pozri napríklad Reski, R.,Zell- und molekularbioligische Untersuchungen der cytokinin-índuzierbaren Gewebedifferenzierung und Chloroplastenteilung bei Physcomitrella patens (Hedw.) B. S. G., Bunkové a molekulámo-biologické štúdie diferenciácie cytokinínom indukovateľných tkanív a delenia chloroplastov vo Physcornitrella patens (Hedw.) B. S. G. doktorské dizertácia, Universita Hamburg, 1990). Keďže je to kultúra diferencovaných fotoautotropných rastlín, nevyžaduje médium ani dodávanie rastlinných hormónov, ani vitamínov či cukrov. V porovnaní s požiadavkami na komplexné médiá, napríklad Zvieracie bunkové kultúry, je cena nižšia až stokrát. Podľa vynálezu sa ukazuje, že výťažok biologicky aktívneho heterológneho proteínu je možné v kultivačnom médiu zvýšiť V prítomnosti PVP až 35-krát, a preto sa podľa vynálezu dáva prednosť PVP v kultivačnom médiu.Podrobné informácie o kultivácii ďalších machov v bioreaktoroch, ktoré sú podľa vynálezu vhodné, ako napríklad Leptobryum pyriforme a Sphagnum magellanicurn, sú opísané v predchádzajúcich prácach (pozri napríklad Wilbert, E., Biotechnologische Studien zur Massenkultur von Moosen unter besonderer Berücksichtigung des Arachidonsäurestoffwechsels Biotechnologícké štúdie týkajúce sa kultúr machov s osobitným ohľadom na metabolizmus kyseliny arachidónovej, doktorská dizertácia, Universita v Mainzi, 1991 Rudolph, H. a Rasmussen, S., Studies on secondary metabolism of Sphagnum cultivated in bíoreactors,Crypt. Bot., 3, 67 - 73, 1992). Na účely predloženého vynálezu sa dáva osobitne prednosť použitiu Physcomitrelly, a to osobitne preto, že pri tomto organizme sú už preskúmané všetky obvyklé molekulárno biologické technológie (rešerše pozri Reski, R., Development, genetics and molecular biology of mosses, Bot. Acta, 111, l- 15, 1998).Na biotechnologické využívanie Physcornitrelly boli na výrobu heterológnych proteínov vyvinuté vhodné transformačné systémy. Úspešné transformácie boli vykonané napríklad priamym prenosom DNK do tkaniva protonémy s použitím nastreľovania častíc. Úspešný bol tiež transfér DNK do machových protoplastov sprostredkovaný PEG. Táto transfomiačná metóda bola opakovane opísaná pri Physcomitrelle a viedla tak k prechodovým, ako aj stabílným transformantom (pozri napríklad Reutter, K. a Reski, R., Production of a heterologous proteín in bioreactor cultures of fully differentiated moss plants, PI. Tissue culture, Biotech., 2, 142 - 147, 1996).Aj ked je predložený vynález principiálne vhodný na výrobu akejkoľvek bielkovinovej látky, bude tu ukázaná výroba zodpovedajúceho farmaceutického proteínu s osobitným zreteľom na ľudský vaskulámy endotheliálny rastový (VEGF).VEGF bo po prvýkrát izolovaný Ferrarom, N. a Henzelom, W. J. (Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells, Biochem. Biophys. Res. Commun.,161, 851 -858, 1989) a charakterizovaný ako regulačný faktor na riadenú angiogenézu a endotheliálne delenie buniek pri bežných fyziologických podmienkach (Ferrara, N., et al., The vascular endothelial growth factor family of polypeptides, J . Cell. Biochem., 47, 211 - 218, 1991). Autori tiež uvádzajú, že tento rastový faktor pôsobí vysoko špecificky na vaskláme endoteliálne bunky a je inaktívny vzhľadom na iné bunkové typy. VEGF je homodimerický glykoproteín viazaný disulñdovými mostíkmi. Sú známe štyri formy ľudského VEGF. Štyri izomemé formy sú aminokyseliny dlhé 121, 165, 189 a 206 a sú tvorené alternatívne previazanýrni VEGF RNK. VEGF 205 bol zistený iba vo fetálnej pečeňovej cDNK, zatiaľ čo VEGFm. VEGF 155 a vEGFlgg boli zistené vo veľkom počte nádorových buniek a nádorových tkanív. Všetky izomérne formy VEGF mali navádzacie sekvencie k sekrécíi, ale účinne sú vylučované iba dve najmenšie formy (pozri naprí 10klad Martiny - Barón, G. a Marmé. D., VEGF-mediated tumor angíogenesis A new target for cancer therapy,Curr. Opin. Biotechnol., 6, 675-680, 1995).Podstatné množstvo VEGF bolo a je stále vyžadované ako na vývoj a zdokonaľovanie súčasných požiadaviek pri terapií nádorov a na charakterizáciu VEGF. V ranných štádiách práce na predloženom vynáleze všetko, čo bolo do tohto času opísané, bola výroba rekombinantu VEGF v bunkách hmyzu expresiou systému bacilovírusu (napríklad Fíebich, B. L., et al., Synthesís and assembly of functionally active human vascular endothelial growth factor homodimers in insect cells, Eur. J. Biochem., 21 l, 19 - 26, 1993). Nasledovali Saccharomyces cerevisiae (Kondo, S., et al., The shortest isoforrn of human vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor (VEGFA/PFm) produced by Saccharomyces cerevisiae promotes both angiogenesís and vascular permeability, Biochim Biophys. Acta, 1243, 195 - 202, 1995), kvasinky Pichia pastoris (Mohanraj, D., et al., Expression of biologically active vascular endothelial growth factor in Yeast,Growth factors, 12, 1 7 - 2 7 , 1995) a Escherichia coli (Siemeister, G., et al., Expression of biologically active isoforms of the t 11 mor angiogenesis factor VEGF in Escherichia coli, Biochem.Biophys. Res. Commun 222,249 - 255, 1996) ako ďalšie produkčné organizmy. Biologický aktívny VEGF bol vyrobený všetkými týmito rekombinačnými systémami. Expresný systém E. coli je však komplikovaný, čo sa týka čistenia a rekonštitúcie proteínu, pretože sa uzatvára do telových dutín.Zavedenie kontrolovateľných masových kultúr Physcomitrella patens (Reuter a Reski, loc. cit.) a spôsoby transféru DNK do machu Physcomitralla patens (Reutter. K Expression heterologer Gene in Physcomitrella patens (Hedw.) B. S. G. Expresia heterologných génov po Physcomitrella patens (Hedw.) B. S. G., doktorská dizertáeia na Uníversite v Hamburgu, 1994) vytvoril základný predpoklad na biotechnologické využívanie tejto rastliny.Práce vykonané na začiatku dokázali dlhodobú stabilitu integrácie pri použití transgenných línií Physcomitrelly pôvodom od Reuterra (loc. cit., 1994). Expresia heterologných génov npt II a gus, ktoré boli ako príklad použité na tento účel bola ešte detegovateľná po štyroch rokoch. Bola optimalizovaná bioreaktorová kultivácia Physcomitrelly. Bolo vyvinuté miešadlo, ktoré drvilo protonćmy a tým zabezpečovalo požadovanú homo genitu kultúry pri stabilných obrátkach 300 až 500 1.min 1. Bolo tak umožnené normalizované vzorkovanie. Súčasne privádzaný vzduch bol v kvapalnej kultúre distribuovaný rovnomernejšie. Za týchto podrnienok bolo dokázané, že vývoj biomasy a proteínu prebieha bez vonkajšej regulácie pH rovnakým spôsobom ako pri regulácii pH je prekvapivé, že regulácia pH nie je teda nutná. V poloprevádzkovom meradle sa týždenne vyprodukovalo 500 mg sušiny biomasy alebo 22 mg celkového proteínu na liter. To znamená päťnásobný nárast produkcie biomasy v kultúre v 5 l sklennej banke. Znižením koncentrácie soli v Knopovom médiu na desatinu viedlo k podobným hodnotám, a tým k zníženiu nákladov.Prídavok 5 mM vínanu amónneho urýchlilo vývoj biomasy skrátením lag fázy. Prídavok vínanu amónneho vydal súbežne kultúry, ktoré virtuálne pozostávali výlučne z buniek chloronéma. Pomocou prietokovej cytometrie, bolo dokázané, že virtuálne sto percent buniek týchto kultúr bolo vo fáze G 2/M bunkového cyklu. Tento výsledok bol potvrdený ďalšími fyziologickými štúdiami s auxínom a štúdiami s diferenciačno-špecifickými mutantmi cal 112 a cal 113 a bolo zistené, že bunky caulonéma sú vo fáze Gl/GO väčšinu času,zatiaľ čo bunky chloronéma sú prevažne vo fáze G 2/M.Promótor bol skúmaný na možnú indukovateľnost do machu s použitím agrobakteriálneho 1-promótoru. Ako markerový gén bol použitý gén B-gluloironídázy (gus). V prechodne transformovaných machových protoplastoch (transformačná rýchlosť 3.104) bola po indukcii 5 M kyselinou indol-3-octovou pozorovaná expresia génu gus. V kontrolných vzorkách nebola pozorovaná žiadna expresia.Gén pre zostrihnutú formu ľudského vaskulámeho endoteliálneho rastového faktora (VEGFm) aminokyseliny 121 bol prevedený do Physcomitrelly transformačnou rýchlosťou 0,5.105 a 3,3.106. Až potiaľ bol gén klonovaný z konštitutívneho promótora 35 S a do transformačného vektora pRT 99, ktorý je pre rastliny vhodný. Pri druhom prístupe bolo sekvenčné kódovanie zodpovedajúceho ľudského tranzitného peptidu ER dodatočne klonované. Analýzou Southern bola potvrdená integrácia heterolognej DNK a opísaný typ integrácie získaných stabilných transforrnantov. Iná analýza (N othern analysis) v týchto transformantoch potvrdila existenciu npt II a dvoch VEGF transskriptov. Expresia VEGFm v bunkách machu bola dokázaná nepriamou imunotluorescenciou. Protein bol nepochybne lokalizovaný v bunkách pomocou konfokálneho laserového skenovacieho mikroskopn. Tieto štúdie odhalili na transformantoch bez tranzitných peptidov, že proteín je lokalizovaný najmä v cytoplazme. Pri transformantoch, ktoré navyše obsahovali tranzitný peptid ER, bolo možné zistit proteín V oblasti jadra a V apikálnych oblastiach apikálnych buniek oblastí s veľmi vysokým obsahom ER. Biologická aktivita heterologných proteínov produkovaných podľa vynálezu bola overená vykonaním skúšky ELISA a dvoch funkčných skúšok s proteínom VEGF získaných z kultivačného média.

MPK / Značky

MPK: C12N 15/82, C12P 21/02, A01H 5/00, C07K 14/52

Značky: látok, výroby, bielkovinových, spôsob

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/10-287740-sposob-vyroby-bielkovinovych-latok.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob výroby bielkovinových látok</a>

Podobne patenty