Sekvencia rastlinnej DNA kódujúca mutovanú 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsyntázu, mutovaný rastlinný proteín EPSPS, chimérický gén, vektor, rastlinná bunka, rastlina, spôsob produkcie rastlín a spôsob ošetrenia rastlín

Číslo patentu: 285144

Dátum: 19.06.2006

Autori: Freyssinet Georges, Sailland Alain, Degryse Eric, Lebrun Michel

Je ešte 2 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Opisuje sa sekvencia rastlinnej DNA kódujúca mutovanú formu enzýmu 5-enol- pyruvylšikimát-3-fosfátsyntázy (skrátene EPSPS), ktorá obsahuje aspoň jednu substitúciu aminokyselín, a to zámenu treonínu za izoleucín v pozícii 102 a substitúciu prolínu za serín v pozícii 106 v sekvencii EPSPS z kukurice a prepožičiava rastline zvýšenú toleranciu voči herbicídom.

Text

Pozerať všetko

vynález opisuje novú formu enzýmu 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsyntázy (skrátené EPSPS), ktorá vykazuje zvýšenú toleranciu proti herbicidom, ktoré sú kompetitívnymi inhíbítormi aktivity EPSPS vzhľadom na fosfoenolpyruvát (PEP). Táto odolnejšia forma enzýmu obsahuje najmenej jednu substitúciu aminokyselín, a to zámenu treonínu za izoleucín. Vynález sa ďalej vzťahuje na gén kódujúci tento proteín, na rastlinné bunky transfonnované chimérickýmí génovými konštrukciami, ktoré obsahujú tento gén, na regenerované rastliny z týchto buniek a tiež na rastliny, ktoré vznikli krížením s použitím týchto transformovaných rastlín.Glyfosat, sulfosat a fosametin sú širokospektrálne herbícídy, ktoré patria do rodiny fosfometylglycínových herbicídov. Pôsobia v podstate ako kompetitívne inhibítory 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsyntázy (EC 2.5.1.l 9) alebo EPSPS, vzhľadom na PEP (fosfoenolpyruvát). Po ich aplikácii na rastliny sa tieto herbicídy v rastlinc lokalízujú v rýchlo rastúcich častiach, osobitne v stonkových a koreňových vrcholoch, kde sa akumulujú a spôsobujú poškodenie,ktoré vedie až k deštrukcíi citlivých rastlín.Plastidová EPSPS, hlavný cieľ týchto herbicídov, je enzým, ktorý sa v metabolizme zúčastňuje biosyntézy aromatických aminokyselín. EPSPS je kódovaná jedným alebo viacerými jadrovými génmi a syntetizovaná vo forme cytoplazmatického prekurzoru, ktorý je následne importovaný do plastidov, kde sa enzým akumuluje vo svojej maturovanej forme.Tolerancia rastlín proti glyfosatu a podobným herbicídom z rovnakej skupiny sa získa začlenením EPSPS génu do ich genómu. Gén je rastlinného alebo bakteriálneho pôvodu a je mutovaný alebo inak pozmenený, a to tak, aby došlo k zmene charakteru inhibicie produktu génu glyfosatom. Z hľadiska pôsobenia glyfosatu a stupňa tolerancie produktu použitých génov proti glyfosatu, sa ukazuje výhodné, aby bolo možné exprimovat produkt translácie tohto génu tak, aby došlo k jeho akumulácii v dostatočnom množstve priamo v plastidoch.V US patente 4 535 060 je opisovaná tolerancia rastlín proti spomínaným typom herbicídov, osobitne N-fosfonometyglycínu a glyfosatu, ktorá sa dosiahla zavedením génu kódujúceho EPSPS s najmenej jednou mutáciou do rastlinného genómu. Táto mutácia spôsobila, že zmienený enzýrn po jeho lokalizácii v plastidovom kompattmente je odolnejší proti jeho ínhíbítoru (glyfosatu).Uvedené techniky by však malí byt vylepšené tak, aby sa získala väčšia spoľahlivosť s používaním týchto rastlín v poľnohospodárskych podmienkach.V tomto vynáleze sa pod pojmom rastlina rozumie každý mnohobunkový organizmus schopný fotosyntézy, a pojmom rastlinná bunka sa rozumie každá bunka odvodená od rastliny, schopná tvorit akékoľvek nediferencované pletivá, ako sú kalusy alebo diferencované pletivá, ako sú embryá, rastlinné časti alebo semená, Predmetom prcdkladaného vynálezu je príprava transformovaných rastlín so zvýšenou toleranciou proti herbicídom fosfonometyl-glycinovej skupiny, a to regeneracíoubuniek transformovaných pomocou nových chimérických génov, ktoré obsahujú gén pre toleranciu proti týmto herbicídom.Predmetom vynálezu je tiež chimérický gén, o ktorom je známe, že v rastlinách zvyšuje toleranciu proti herbicídom s cieľovým pôsobením na EPSPS. Tento gén obsahuje v smere transkripcie po sebe promótorovú oblasť, voliteľne aj tranzitnú peptidovú oblast, sekvenciu génu pre toleranciu enzýmu proti glyfosatu a neprekladanú oblasť s polyadenylačným signálom na 3 konci. Gén pre rezístenciu proti glyfosatu obsahuje v porovnaní s génom, z ktorého je odvodený, substitúciu treonínu 102 za izoleucín v aroA oblasti. Vo výhodnom usporiadaní tento gén obsahuje navyše v rovnakej oblasti substitúciu prolínu 106 za scrín. Tieto substitúcie môžu byť vnesené alebo už sú prítomné v EPSPS sekvencii akéhokoľvek pôvodu, osobitne rastlinného či bakteriálneho, alebo v enzýrne z rias či húb.Tranzítnć peptidy, ktoré môžu byt použite v tranzitnej peptidovej oblasti, môžu byť rastlinného pôvodu, odvodené napríklad z kukurice, slnečníce, hrachu, tabaku alebo z ďalších ľubovoľných rastlín. Prvý a druhý tranzitný peptid môžu byt identické, podobné alebo rôzne, Ďalej môžu obsahovať jednu alebo viac jednotiek tranzitných peptídov,ako je uvedené v Európskej patentovej prihláške EP 0 508 909. Úlohou tejto charakteristickej oblasti je umožniť uvoľnenie maturovaných a natívnych proteínov s maximálnou účinnosťou, osobitne zmiencneného mutovaného EPSPS, v plazmidových kompartmentoch.Výhodne sa podľa vynálezu promótorová oblast chimérického génu skladá najmenej z jedného promótora génu alebo promótorového fragmentu, ktorý je v rastlinných pletivách prirodzene exprímovaný (tubulín, intróny, aktin,histón).Neprekladaná oblast so signálom na termináciu transkripcie na 3 konci chimérického génu môže byt rôzneho pôvodu, napríklad bakteriálneho, ako signál z génu pre nopalin syntázy, alebo rastlinného, ako signál z génu pre histón H 4 A 748 z Arabidopsis thalíana, ako je uvedené v Európskej patentovej prihláške 633 317 (European Application 633 317).Chimérický gén podľa vynálezu môže obsahovat, okrem zmienených častí, ešte najmenej jednu neprekladanú spájajúcu oblast (línker), ktorá môže byt umiestnená medzi dvoma rôznymi transkribovanými oblasťami, ktoré boli opisané skôr. Táto spájajúca oblast môže byt akéhokoľvek pôvodu, napríklad bakteriálneho, virusového alebo rastlinného.Izolácia cDNA kódujúcej kukuríčnú EPSPSV nasledujúcej časti sú opísané rôzne postupy vedúce ku získaniu cDNA kódujúcej EPSPS z kukurice. Táto cDNA slúži ako základ na vnesenie dvoch mutáeií, ako je opísané. Všetky opísané operácie sú opísané formou príkladov a zodpovedajú jednému možnému vybranému spôsobu z mnohých, ktoré vedú k dosiahnutiu rovnakých výsledkov. Tento výber nemá žiadny vplyv na kvalitu výsledkov, a tak možno na dosiahnutie výsledkov použit akúkoľvek vhodnú metódu, podľa výberu odbomíka v danom odbore. Väčšina metód týkajúcich sa molekulového inžinierstva DNA fragmentov je opisaná v Current Protocols in Molecular Biology Diel l a 2, Ausubel a kolektív, vydané v Greene Publishing Associates and Wiley-lnterscience(1989) (ďalej uvádzané odkazy na protokoly opísané v tejto práci budú označené skratkou ref. CPMB). Operácievzťahujúce sa na DNA, ktoré sú uskutočňované podľa protokolov opísaných v tejto práci, sú predovšetkým tieto ligácia DNA fragmentov, pôsobenie Klenowovho fragmentu DNA polymerázy I a T 4 DNA polymerázy, príprava plazmidovej DNA a DNA z bakteriofága Ä, ďalej tiež minipreparácia a maxipreparácia a analýza RNA a DNA pomocou Southem a Northem hybridizácie. Ďalšie metódy opisané v tejto práci boli uskutočnené podľa uvedených protokolov a len významné modifikácie a dodatky k týmto protokolom sú opisané neskôr.l. Získanie fragmentov EPSPS z Arabídopsis thaliana dva ZO-mérové oligonukleotidy s nasledovnými sekvenciami 5 -GCTCTGCTCATGTCTGCTCC-3 5-GCCCGCCCTTGACAAAGAAA-3boli syntetizovane podľa sekvencie genu pre EPSPS z Arabídapsis thaliana (Klee H. J. a kolektiv (1987) Mol. Gen. Genet., 210, strana 437 až 442). Tieto dva oligonukleotidy zodpovedajú pozíciám 1523 až 1543 a 1737 až 1717 podľa publikovanej sekvencie a v opačných orientáciách.c) 50 nanogramov (ng) DNA sa zmieša s 300 ng každého oligonukleotidu a podrobí sa 35 ampliñkačným cyklom v prístroji Perkin-Elmer 9600, s použitím štandardného média na amplitikáciu, ktoré je odporúčané výrobcom. Výsledný fragment s dĺžkou 204-bp tvorí fragment EPSPS z Arabidopsis thaliana.2. Konštrukcia knižnice cDNA z BMS bunkovej línie kukuricea) 5 g filtrovaných buniek je zhomogenizovaných v kvapalnom dusiku, celkové nukleové kyseliny sú odstránené spôsobom podľa Shura a kolektív, s nasledovnými modifikáciami- pH lyzujúceho pufru je upravené na pH 9,0,- po precipitácii s izopropanolom sa sediment rozpusti vo vode a pridá sa chloríd lítny do koncentrácie 2,5 M. Po dvanásťhodinovej inkubácii pri 0 °C sa sediment získaný centrifugáciou počas 15 minút pri 30.000 g pri 4 °C resolubilizuje. Rozpustený sediment obsahuje RNA frakciu z celkových nukleových kyselín.b) Poly (A) RNA frakeia sa získa chromatografiou na oligo (dT)-celulózovej kolóne, ako je opisané v Current Protocols in Molecular Biology.c) Syntćza dvojvláknovej cDNA obsahujúcej syntetický EcoRI koniec táto syntéza sa uskutočňuje podľa protokolu výrobcu dodávajúcim rôzne chemikálie potrebné na túto syntézu vo fomie kitov, napríklad - copy kit od firmy InVitrogen.Dva jednovláknove a čiastočne komplementáme oligonukleotidy nasledujúcich sekvenciisa ligujú k tupým koncom dvojvláknovej cDNA.Výsledkom ligácie adaptorov je vytvorenie Smal miest pripojených k dvojvláknovej cDNA a kohéznych EcoRI miest na každom konci dvojvláknových cDNA.cDNA s umelo vytvorenými kohéznymi EcoRI miestami na koncoch sa liguje s ltgtlo cDNA po štiepení pomocou EcoRI a defosforyláciou podľa protokolu dodávateľa kitu New England Biolabs.Časť produktov ligačnej reakcie je enkapsidovaná in vitro s enkapsidačnými extraktmi, menovite s Gigapack Gold, podľa inštrukcií dodávateľa. Knižnica je ďalej titrovaná s použitím baktérií E. coli C 600 hfl. Takto získaná knižnica sa namnoží a skladuje podľa inštrukcií toho istého dodávateľa a obsahuje cDNA knižnicu pre BMS bunkovú suspenziu kukurice.3. Skríning cDNA knižnice BMS bunkovej suspenzie kukurice pomocou EPSPS sondy z Arabídopsis thalíanaProtokol používaný na tento skríning sleduje návody uvedené v Current Protocols in Molecular Biology diel l a 2, Ausubel a kolektiv, publikovaný v Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1989) (CPMB).V skratke, približne 10 ° rekombinantných fágov sa vyseje pri priememej hustote 100 fágov na cmz na LB misky. Lytické plaky sa replikujú na membrány Amersham Hybond N ako duplikáty.DNA sa fixuje na filtre pomocou pôsobenia 1600 kJ UV (Stratagene Stratalinker). Filtre sa prehybridizujú v 6 xSSC/ 0,1 SDS/ 0,25 odtučnené mlieko počas dvoch hodín pri 65 °C. Hybridizačná sonda pre EPSPS z Arabidopsis thaliana bola označená s 31 PdCTP metódou náhodných primerov podľa návodu dodávateľa kitu (Phamiacia Ready to Go kit). Ziskaná špecifická aktivita je rádovo 108 cpm na g fragmentu. Po denaturácii trvajúcej 5 minút pri 100 °C sa sonda pridá do prehybridizačného média a hybridizácia pokračuje ďalších 14 hodín pri 55 °C. Filtre boli autorádiografované po 48 hodín trvajúcej expozícii pri-80 °C na film Kodak XARS a s použitím kazety so zosilňovačom signálu Amersham Hyperscreen RPN. Porovnanie pozitívnych škvŕn na filtri s miskamí, z ktorých boli replikované, umožní zistit fágy zodpovedajúce pozitivnym hybridizačným signálom s EPSPS sondou z Arabidapsis thaliana. Tieto kroky odobratia z kultivačných platni, vysiatia,prenosu, hybridizácie a opätovného získavania sú opakované dovtedy, pokým všetky škvmy na miske z úspešne purifikovaných fágov nie sú pri hybridizácii 100 pozitivne. Jednotlivé plaky z fágového lyzátu sú prenesené do riediaceho média t (Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgSO 4, 0,1 M NaCl, 0,1 želatína). Tieto fágy tvoria v roztoku EPSPSpozitívne klony BMS bunkovej suspenzie kukurice.4. Príprava a analýza DNA z EPSPS klonov BMS bunkovej suspenzie kukuricePribližne 5 x 108 fágov sa pridá ku 20 ml baktérií C 600 hfl s optickou hustotou OD 500, 2/ml a inkubuje sa 15 minút pri 37 °C. Táto suspenzia sa nariedi do 200 ml bakteriálneho rastového média v 1 l Erlenmayerových bankách a mieša sa na rotačnej trepačke pri 250 rpm. Lýza je zjavná,ked sa médium začne číriť, čo zodpovedá lýze turbídnych baktérií a prejavuje sa približne po 4 hodinách miešania. S týmto supernatantom sa zaobchádza podľa inštrukcií opísaných v Current Protocols in Molecular Biology. Ziskaná DNA zodpovedá EPSPS klonom bunkovej suspenzie kukurice BMS.Jeden až dva mikrogramy tejto DNA sa štiepia s EcoRI a delia sa v 0,8 LGTA/TBE agarózovom géli (ref. CPMB).Konečné overenie je založené na kontrole toho, že puriíikovaná DNA vykazuje hybridizačný signál s EPSPS sondou z Arabidopsis thalíana. Po elektroforéze sú fragmenty DNA prenesené na membrány Amersham Hybond N podľa protokolu opisujúceho Southem blotting a opísaného Current Protocols in Molecular Biology. Tento filter sa hybridizuje so sondou EPSPS z Arabídapsís thalíana podľa opísaných podmienok v sekcií 3. Klon, ktorý vykazuje hybridizačný signál s touto sondou pre EPSPS z Arabídapsis thaliana a obsahujúci najdlhší EcoRI fragment by mal mať odhadovanú veľkost na géli približne 1,7 kbp.Desať mikrogramov klonu fága obsahujúceho 1,7 kbp dlhý inzert sa podrobí pôsobeniu restrikčného enzýmu EcoRI a rozdelí sa v 0,8 LGTA/TBE agarózovom géli(ref. CPMB). Časť gélu s 1,7 kbp dlhým inzertom sa vyreže z gélu po vyfarbení pomocou BET a fragment sa opracuje agarázou podľa inštrukcií dodávateľa, New England Biolabs. Puriñkovaná DNA získaná z fragmentu 1,7 kbp sa líguje pri 12 °C počas 14 hodín s DNA plazmidom pUCl 9(New England Biolabs) naštiepenýrn pomocou restrikčného enzýmu EcoRI podľa protokolu na ligáciu opísaného v Current Protocols in Molecular Biology. Dva mikrolitre zmienenej ligačnej zmesi boli použité na transformáciu časti elektrokompetentných buniek E. coli DHIOB, transformácia sa uskutočňuje elektroporáciou pri nasledovných podmienkach zmes kompetentných baktérií a ligačné médium sa prenesie do elektroporačnej kyvety s hrúbkou 0,2 cm (Biorad), ktorá sa predtým vychladí na 0 °C. Fyzikálne podmienky elektroporácie pri použití elektroporátoru vyrobeného firmou Biorad sú nasledovné 2500 V, 25 F a 200 Q. Za týchto podmienok je stredná doba vybitia kondenzátora rádovo 4,2 milisekundy. Baktérie sa následne prenesú do 1 ml SOC média (ref. CPMB) a miešajú sa jednu hodinu pri 200 rpm na rotačnej trepačke v pätnásťmílilitrových skúmavkách Coming. Po vysiatí na LB/agarové médium, do ktorého je pridaný karbenicillin do l 00 g/ml,sa uskutoční minipreparácia bakteriálnych klonov, ktoré narástli cez noc pri 37 °C. Minipreparácia sa uskutočňuje podľa návodu opísaného v Current Protocols in Molecular Biology. Po naštiepení DNA s enzýmom EcoRI a separácii elektroforézou v 0,8 LGTA/TBE agarózovom géli(ref. CPMB) sa vyberú klony s 1,7-kbp dlhým inzertom. Konečné overenie sa skladá z kontroly toho, že purifikovaná DNA skutočne vykazuje hybridizačný signál s EPSPS sondou z Arabidopsis thaliana. Po elektroforéze sa DNA fragmenty prenesú na membrány Amersham Hybond N tak,ako je to opísané v návode na Southem blotting v Current Protocols in Molecular Biology.Filtre sa hybridizujú s EPSPS sondou z Arabidopsis thaliana podľa podmienok opísaných v sekcii 3. Plazmid s 1,7-kbp dlhým klonovaným inzertom a hybridizujúci s EPSPS sondou z Arabidopsis thalianu bol pripravený vo väčšom množstve a výsledná DNA bola purifikovaná z baktérií na gradiente CsCl, ako je opísané v Current Protocols in Molecular Biology. Puriñkovaná DNA bola čiastočne sekvenovaná pomocou Pharmacia kitu podľa návodu výrobcu a s použitím primerov, ako sú M 13 priamy a spiatočný (reverzný) univerzálny primer, ktoré sú dodávané rovnakým výrobcom. Čiastočná sekvencia pokrýva približne 0,5 kbp. Odvodená amínokyselinová sekvencia v oblastimaturovaného proteínu (približne 50 aminokyselinových zvyškov) vykazuje l 00 totožnosť so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou maturovanej kukuričnej EPSPS opísanej v Americkom patente USP 4 971 908. Tento klon zodpovedajúci 1,7-kbp EcoRI fragmentu EPSPS DNA z BMS bunkovej suspenzie kukurice, bol označený ako pRPA-ML-71 1. Kompletná sekvencia tohto klonu bola určená sekvenovaním obidvoch vláken s použitím postupu podľa Pharmacia kitu a syntetizovaním komplementámych oligonukleotidov k týmto vláknam, ale opačne orientovaný/m, približne pre každých 250 bp. Komplemá sekvencia získaného l 7 l 3-bp dlhého klonu je uvedená V Sekvencíi id. č. 1.Analýza sekvencie klonu pRPA-ML-71 l, a najmä porovnanie odvodenej aminokyselinovej sekvencieso zodpovedajúcou sekvenciou z kukurice, vykazuje predlženie sekvencie o 92 bp proti smeru transkripcíe od GCG kodónu kódujúceho NHz-koncový alanín maturovanej časti kukuričnej EPSPS (Americký patent USP 4 971 908). Podobne je pozorované predĺženie sekvencie o 288 bp v smere transkripcie od AAT kodónu kódujúceho COOH-koncový asparagín maturovanej kukuričnej EPSPS (Americký patent USP 4 971 908). Tieto dve časti by mohli zodpovedať v prípade predĺženia NH konca, časti sekvencie tranzitného génu pre lokalizáciu v plastide a v prípade COOH-konca,neprekladanej 3 oblasti DNA.V prípade získania cDNA kódujúcej maturovanú časť kukuričnej EPSPS, ako je opísané v USP 4 97 908, sú uskutočnené nasledovné operácieOdstránenie 3 neprekladanej oblasti konštrukcia pRPA-ML-712Klon pRPA-ML-7 ll bol štiepený s restrikčným enzýmom Asel. Na výsledné získané štepy sa pôsobilo Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I podľa protokolu opísanom v CPMB. Tak boli získané tupé konce. Produkt bol následne štiepený s restrikčným enzýmom Sacll. Výsledná DNA bola delená elektroforézou v l LGTA/ľ BE agarózovom géle (ref. CPMB).Časť gélu obsahujúca inzert s veľkosťou 0,4-kbp, so zarovnaným koncom po pôsobení restrikčného enzýmu Asel a siahąjúca až po miesto štiepenia enzýmu Sacll, bola vyrezaná z gélu a purifikovaná podľa protokolu uvedeného V odseku 5. DNA získaná z klonu pRPA-ML-7 ll bola podrobená restrikčnému štiepeniu s enzýmom HindIII v mieste HindIII ležiacom v polylinkeri klonovanćho vektora pUCl 9. Presahujúce konce vzniknuté týmto štiepením boli Klenowovým fragmentom DNA polymerázy l zarovnané na tupé. Ďalej nasledovalo štiepenie restrikčným enzýmom Sacll. DNA vzniknuté touto manipuláciou bola delená pomocou elektroforézy v 0,7 LGTA/TBE agarózovom géliČast gélu obsahujúca fragment s približnou veľkosťou 3,7-kbp s tupými koncami po štiepení restrikčným enzýmom HindIII a siahajúca až po štiepne miesto pre restrikčný enzým Sacll bola vyrezaná z gélu a purifikovaná podľa protokolu opísanom v odseku 5.Tieto dva inzerty boli ligáciou spojené a 2 l ligačnej zmesi boli použité na transformáciu E. coli DHIOB, ako už bolo opísané v odseku 5.Obsah plazmidovej DNA z rôznych kmeňov bol analyzovaný podľa postupu opísaného pre pRPA-ML-7 l l. Jeden z vybraných plazmidových klonov obsahuje približne 1,45 SK 285144 B 6-kbp dlhý EcoRI-HindIII inzert. Sekvenovanim terminálnych koncov tohto klonu sa potvrdilo, že 5 koniec inzertu presne zodpovedá korešpondujúcemu koncu pRP-ML-7 ll a 3 koniec má nasledujúcu sekvenciuPodčiarlmutá sekvencia zodpovedá kodónu pre COOH-koncovú aminokyselinu asparagín, nasledujúci kodón zodpovedá translačnému stop kodónu.Nukleotidová sekvencia V smere transkripcie zodpovedá sekvencii časti polylinkera pUCl 9. Tento klon obsahuje sekvenciu zodpovedajúcu sekvencii pRPA-ML-7 l 1 až po miesto na tennináciu translácie maturovanej kukuričnej EPSP syntázy. Za týmto miestom nasleduje sekvencia polylinkera pUCl 9 až po miesto HindIII. Celá táto konštrukcia sa nazýva pRPA-ML-712.Klon pRPA-ML-712 bol štiepený restríkčnými enzýmami PstI a HindIII. Z týchto manipulácií vzniknutá DNA bola separovana pomocou elektroforézy na 0,8 LGTA/TBE agarózovom géli (ref. CPMB). Časť gélu obsahujúca Pstl-EcoRI inzert s veľkosťou 1,3-kbp bola vyrezaná z gélu a puriñkovaná podľa návodu uvedeného V odseku 5.Inzert bol ligovaný za prítomnosti ekvimolárnych množstiev každého z dvoch čiastočne komplementárnych oligonukleotidov s nasledujúcimi sekvenciamia tiež v prítomnosti DNA plazmídu pUCl 9 štiepenej s restrikčnými enzýmami BamHl a HindIII.Dva mikrolítre lígačnej zmesi boli použité na transformáciu E. coli DHlOB, ako je opísané v odseku 5. Po analýze obsahu plazmídovej DNA v rôznych klonoch, ktorá bola uskutočnená podľa návodu v časti S, bolo zistené, že jeden klon obsahuje inzert s približne 1,3-kbp dlhou sekvenciou. Tento bol podrobený ďalšej analýze. Sekvencia 5 konca vybraného klonu sa skladá z nasledujúcich častí sekvencia polylinkera, a to od štiepneho miesta pre EcoRI až po miesto štíepenia BamHI, potom nasleduje sekvencia oligonukleotidov použitých na klonovanie, ďalej nasleduje zvyšok sekvencie nachádzajúci sa V pRPA-ML-712. Tento klon bol označený pRPA-ML-7 l 3. V tomto klone je kodón ATG pre metionín zahmutý do väzbového miesta pre restrikčný enzým Ncol, a to proti smeru transkrípcie N-koncovej časti kodónu pre alanin maturovanej EPSP syntázy. Ďalšie kodóny pre alanín a glycín nachádzajúce sa na N-konci, sú zachované, ale sú modifikované na tretej variabilnej báze počiatočný GCGGGT dáva po modifikácii GCCGGC.Klon pRPA-ML-7 l 3 bol štiepený restrikčnýrn enzýmom HindIII. Na získané výsledné štepy sa pôsobilo Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I. DNA bola potom podrobená restrikčnému štiepeniu s enzýmom Sacl. Výsledná DNA bola delená elektroforézou V 0,8 LGTA/TBE agarózovom géli (ref. CPMB), Časť gélu obsahujúca inzert s veľkosťou 1,3-kbp HindlIl-tupý koniec/sací bola vyrezaná z gélu a puriflkovaná podľa protokolu uvedeného v odseku 5. Tento inzert bol ligovaný za prítorrmosti DNA z plazmídu pUCl 9, ktorá bola štiepená s restrikčným enzýmom Xbal a prečnievajúce konce vzniknuté týmto štíepením bolí zarovnané pomocou Klenowovho fragmentu DNA polymerázy I. Výsledný produkt bol štiepený s restrikčným enzýmom SacI.2 l ligačnej zmesi boli použité na transformáciu E. coli DHIOB, ako je opísané v odseku 5. Po analýze plazmídovej DNA z rôznych klonov, ktorá bola uskutočnená podľa návodu v časti 5, bolo zistené, že jeden klon má inzert s približne 1,3-kbp sekvenciou. Tento bol podrobený ďalšej analýze. Sekvencia DNA koncových častí tohto vybraného klonu sa skladá z nasledovných časti sekvencia pUCl 9 polylinkera, a to od štiepiaceho miesta pre EcoRI až po miesto Sacl štiepenia, potom nasleduje sekvencia oligonukleotidov použitých na klonovanie, z ktorých bola vynechaná sekvencia s dĺžkou 4 bp GATC z oligonukleotídu 1 opísaného skôr. Ďalej nasleduje zostávajúca sekvencia prítomná v pRPA-ML-712 až po miesto štiepenia pre HindIII a sekvencia polylinkera pUC 19 od miesta pre XbaI pomiesto pre HindIII. Tento klon bol označený pRPA-ML-7 l 5.Príprava cDNA kódujúcej mutovanú formu kukuričnej EPSPS.Všetky kroky vedúce k mutagenéze boli uskutočnené pomocou súpravy Pharmacia U.S.E. podľa inštrukcií dodávateľa. Princíp tohto systému na generovanie mutácií je nasledovný plazmidová DNA sa teplotné denaturuje a reasociuje sa v molámom nadbytku oligonukleotidov, ktorý má eliminovať unikátne cieľové miesto pre ten restrikčný enzým, ktorý sa vyskytuje v polylinkeri. Po reasociácii sa nasyntetizuje komplementáme vlákno pomocou T 4 DNA polymerázy v prítomnosti T 4 DNA ligázy a proteínu génu 32 vo vhodnom pufri, ktorý je dodávaný výrobcom. Produkt syntézy je inkubovaný v prítomnosti restrikčného enzýmu, ktorého Cieľové sa malo mutagenézou odstrániť. Ako hostiteľské bunky na transfomiáciu touto DNA sa použijú baktérie E. coli, predovšetkým však také kmene, ktoré obsahujú mutácíu mutS.Bunky sa nechajú rást v kvapalnom médiu, celková plazmidová DNA sa z nich puriñkuje a tá sa potom inkubuje s uvedeným restrikčným enzýmom. Potom sa ako hostitel na transformáciu touto DNA použijú baktérie kmeňa E. coli DHIOB, Vyizoluje sa plazmidová DNA jednotlivých klonov a sekvenovaním sa otestuje prítomnost mutácie.A)- modifikácia cieľových miest alebo sekvencie, bez významného zásahu do charakteru rezistencie kukuričnej EPSPS proti produktom metabolizmu, ktoré sú zároveň kompetitívnymi inhibítomii EPSP syntázy vynechanie cieľového miesta pre NcoI z plazmídu pRPA-ML-7 l 5.Sekvencia plazmídu pRPA-ML-715 bola očislovaná tak, že ako začiatok bol určená prvá báza N-koncového alanínového kodónu GCC. Táto sekvencia obsahuje cielové miesto NcoI v pozícií 1217. Oligonukleotid určený na modiñkáciu cieľového miesta má sekvenciuVlastné sekvenovanie sa uskutočnilo postupom uvedeným v referenciách a pritom sa zistilo, že po mutagenéze sekvencia zodpovedá použitému oligonukleotidu. Cieľové

MPK / Značky

MPK: C12N 15/82, A01H 5/00, C12N 15/54

Značky: buňka, proteín, ošetrenia, sekvencia, rastlinný, chimérický, mutovaný, rastlín, vektor, 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsyntázu, gén, produkcie, epsps, kódujúca, mutovanú, rastlinnej, spôsob, rastlina, rastlinná

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/10-285144-sekvencia-rastlinnej-dna-kodujuca-mutovanu-5-enolpyruvylsikimat-3-fosfatsyntazu-mutovany-rastlinny-protein-epsps-chimericky-gen-vektor-rastlinna-bunka-rastlina-sposob-produkcie-ras.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Sekvencia rastlinnej DNA kódujúca mutovanú 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsyntázu, mutovaný rastlinný proteín EPSPS, chimérický gén, vektor, rastlinná bunka, rastlina, spôsob produkcie rastlín a spôsob ošetrenia rastlín</a>

Podobne patenty